張海燕, 吳金鑫, 張云貴, 趙 萍, 林 英,*

(1. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 成都 610066; 2. 家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室, 重慶 400716;3. 西南大學(xué)生物學(xué)研究中心, 重慶 400716)

家蠶Bombyxmori作為遺傳背景研究較為深入的鱗翅目模式昆蟲，其遺傳學(xué)研究具有悠久的歷史和深厚的積累，而隨著家蠶基因組的成功測序和家蠶分子遺傳圖譜的成功構(gòu)建，使用定位克隆技術(shù)對家蠶突變體進(jìn)行定位研究成為可能(Mitaetal., 2004; Xiaetal., 2004; Xiaetal., 2008; Yamamotoetal., 2008; Xiaetal., 2009)。 眼色素(ommochromes)作為昆蟲色素的主要成分之一，通常以顆粒的形式存在，多與昆蟲的表皮、翅、復(fù)眼和卵的著色相關(guān)，主要表現(xiàn)為黃色、紅色、棕色或紫褐色(Linzen, 1974; Sawadaetal., 2000; Bannoetal., 2010)。目前，定位克隆研究方法和技術(shù)平臺已經(jīng)相當(dāng)成熟和完善，已通過定位克隆的方法定位出的家蠶卵色突變體有w-1,w-2,w-3,pe和re等(Quanetal., 2002a, 2002b; Kmotoetal., 2009; Tatematsuetal., 2011; Osanai-Futahashietal., 2012, 2016)，這些突變體的突變基因均與眼色素合成通路相關(guān)：白色卵突變體w-1因缺乏犬尿氨酸-3-單加氧酶(kynurenine3-monooxygenase, KMO)導(dǎo)致3-羥基-犬尿氨酸(3-hydroxy-kynurenine)及后續(xù)眼色素的合成受阻，從而導(dǎo)致卵色偏白(Quanetal., 2002a, 2007)；白色卵突變體w-2和w-3因white基因的突變導(dǎo)致三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白(ATP-binding cassette transporter, ABC transporter)的功能缺失，不能將眼色素前體轉(zhuǎn)運到色素顆粒進(jìn)一步形成眼色素， 3-羥基-犬尿氨酸大量富集而呈現(xiàn)淡黃色(魯成等, 1999; 代方銀等, 2000; Quanetal., 2002b; Kmotoetal., 2009; Tatematsuetal., 2011; Xieetal., 2012; Wangetal., 2013; Zhangetal., 2017)；桃紅眼白卵突變體pe因cardinal基因的突變而導(dǎo)致吩噁嗪合成酶(phenoxazine synthase)的功能缺失，不能合成眼色素，蠶卵內(nèi)3-羥基-犬尿氨酸部分發(fā)生自身氧化形成少量的眼黃素，導(dǎo)致卵色呈現(xiàn)黃色偏微紅色(Osanai-Futahashietal., 2016)；紅色卵突變體re由于Bm-re基因的突變導(dǎo)致主要協(xié)助超家族轉(zhuǎn)運蛋白(major facilitator superfamily transporter, MFS transporter)的功能缺失，不能合成奧敏類眼色素，僅含有奧馬丁(ommatins)類眼色素而呈現(xiàn)紅色(Osanai-Futahashietal., 2012; Zhangetal., 2017)。而眼色素生物合成后期3-羥基-犬尿氨酸進(jìn)一步代謝合成奧馬丁類眼色素的過程尚需進(jìn)一步的研究。由于眼色素及其前體物質(zhì)易于辨認(rèn)的顏色，眼色素合成相關(guān)基因常被用作分子標(biāo)記(Klemenzetal., 1987; Fridell and Searles, 1991)。

家蠶非滯育紅卵突變體Re-nd是由林英等(2007)利用化學(xué)誘變劑N-甲烷-N-甲硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea, MNU)處理家蠶品種C108而誘導(dǎo)產(chǎn)生的新型非滯育家蠶卵色突變體，而后張宇靖等(2020)證實該突變體屬于獨立的顯性遺傳，其突變基因作為分子標(biāo)記在應(yīng)用方面潛力極大。同時，張宇靖等(2020)的研究結(jié)果暗示非滯育紅卵突變體Re-nd的突變基因參與眼色素生物合成后期3-羥基-犬尿氨酸進(jìn)一步代謝合成奧馬丁的過程，而目前對這一過程的研究尚不明確。因此，本研究通過基因連鎖分析和定位克隆的方式確定家蠶非滯育紅卵突變體Re-nd突變基因所在的染色體位置，為后續(xù)Re-nd突變基因的功能研究及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，有助于進(jìn)一步闡釋和完善色素代謝路徑，探明非滯育狀態(tài)下家蠶卵的著色機制。

1 材料與方法

1.1 突變體材料制備

本研究供試的家蠶非滯育紅卵突變體Re-nd和野生型家蠶品種大造由西南大學(xué)家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室保存，兩個品種第1輪飼養(yǎng)時孵化的催青條件為：溫度25℃、光周期12L∶12D，催青周期為10 d左右。飼養(yǎng)至羽化時期，以突變品種Re-nd與野生型品種大造進(jìn)行雜交產(chǎn)下F1代蠶卵，F(xiàn)1代和大造的蠶卵進(jìn)行低溫催青處理，確保回交產(chǎn)下的BC1代蠶卵為非滯育卵，方便表型判定，蠶卵孵化的催青條件為：溫度15℃、光周期6L∶18D，催青周期為30 d左右。由于家蠶具有雌完全連鎖、雄個體交換的遺傳特性，且張宇靖等(2020)對Re-nd的遺傳分析已表明Re-nd屬于獨立的顯性遺傳，所以本研究以F1代雌性個體與大造雄性個體回交產(chǎn)生的BC1代個體作為連鎖分析的材料；以F1代雄性個體與大造雌性個體回交產(chǎn)生的BC1代個體作為定位克隆研究的材料(圖1: A)。在蠶卵非滯育的情況下，在BC1代的蠶卵變?yōu)楣逃猩筮M(jìn)行突變性狀的判型，將單個蛾圈的紅色卵與淡黃色卵分開并單蛾區(qū)飼養(yǎng)(圖1: B)，在3齡末期或4齡期收取材料，提取基因組DNA進(jìn)行實驗。所有供試家蠶均在25℃、自然光照的條件下以單蛾區(qū)飼養(yǎng)的方式用新鮮桑葉飼養(yǎng)。

圖1 基因連鎖分析和定位克隆家蠶材料配制模式圖Fig. 1 Mode diagram of preparation of Bombyx mori materials for genetic linkage analysis and positional cloningP: 親本Parents; F1: 雜交F1代The first generation hybrid； BC1: 回交BC1代The first backcrossing generation. F1代的非滯育卵均表現(xiàn)為淡紅色； BC1代的非滯育卵出現(xiàn)卵色分離，表現(xiàn)為紅色和淡黃色，且比例接近1∶1。紅色線框所示用于定位克隆研究的材料；黑色線框所示用于基因連鎖分析的材料。The non-diapause eggs of F1 generation were all in light red, while those of BC1 generation showed egg color separation and were in red and light yellow, with the ratio of about 1∶1. Red box indicates the materials for the position cloning, and black box indicates the materials for the genetic linkage analysis.

1.2 SNP標(biāo)記開發(fā)

由于不知道Re-nd的突變基因位于哪一條染色體上，我們針對家蠶全染色體進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(SNP標(biāo)記)開發(fā)，每對引物的擴增目的片段長度在500 bp左右，以便測序時一次測通。參照家蠶基因組序列，在家蠶每條染色體上設(shè)計6對引物，并以直系親本P代和F1代的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴增和測序篩選。

PCR反應(yīng)體系(10 μL): rTaq 0.1 μL, 10×rTaq Buffer 1 μL, dNTPs 0.8 μL, 正反向引物(2 pmol/μL)各2 μL， 基因組DNA稀釋液4 μL， ddH2O 0.1 μL。PCR反應(yīng)程序: 95℃ 5 min; 95℃ 10 s, 55℃ 15 s, 72℃ 30 s, 30個循環(huán); 72℃ 7 min; 16℃保存。取PCR擴增產(chǎn)物2 μL與2×上樣緩沖液混勻，點樣至2%瓊脂糖凝膠中電泳。選取PCR擴增條帶均一的PCR產(chǎn)物適度稀釋到10～20 ng/反應(yīng)后進(jìn)行產(chǎn)物純化。產(chǎn)物純化體系(5 μL體系)：Exonuclease I0.05 μL， SAP 0.05 μL，稀釋后PCR產(chǎn)物2 μL，ddH2O 2.9 μL。產(chǎn)物純化反應(yīng)程序： 37℃ 30 min； 80℃ 15 min。純化產(chǎn)物在3730xl基因測序儀上機測序。

運用Sequencher軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析，若直系親本Re-nd與大造測序的序列存在堿基差異，且二者雜交產(chǎn)生的F1代的序列在兩個親本的差異位點為雜合基因型，表現(xiàn)為雙峰，兼具兩個親本的基因型，則判定對應(yīng)的SNP標(biāo)記可用于后續(xù)的連鎖分析和定位克隆。每條染色體上篩選到1～2對可用的SNP標(biāo)記，用于后續(xù)的連鎖分析和定位克隆。

1.3 連鎖分析

由于家蠶的紅色卵突變品系re,rec,rel等以及桃紅眼白卵pe的突變基因均定位在第5號染色體上(向仲懷, 2005; Osanai-Futahashietal., 2012; Osanai-Futahashietal., 2016)。本研究以第5號染色體上的SNP標(biāo)記對Re-nd的突變基因進(jìn)行連鎖分析驗證：選取24個BC1代連鎖分析群體的正常表型個體(卵色表現(xiàn)為淡黃色)和24個突變表型個體(卵色表現(xiàn)為鮮紅色)提取基因組DNA并作為模板，以1.2節(jié)篩選出的SNP標(biāo)記進(jìn)行PCR擴增和純化測序(同1.2節(jié))。運用Sequencher軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析，分析BC1代個體表型與基因型的匹配性：BC1代正常表型(淡黃色卵)個體的基因型與大造的基因型一致，且BC1代突變表型(紅色卵)個體的基因型與F1代的基因型一致，則表示突變基因與該SNP標(biāo)記所在的染色體連鎖，反之則為不連鎖。

1.4 定位克隆

提取定位克隆群體材料BC1代家蠶幼蟲的基因組DNA，針對突變基因連鎖的染色體進(jìn)行SNP標(biāo)記開發(fā)，以篩選出的SNP標(biāo)記進(jìn)行PCR擴增和純化測序(同1.2節(jié))。運用Sequencher軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析，在SNP標(biāo)記位點進(jìn)行測序結(jié)果的記錄，分析BC1代個體表型與基因型的匹配性：BC1代正常表型個體的基因型與F1代的基因型一致，或BC1代突變表型個體的基因型與大造的基因型一致，則表示該個體在該SNP標(biāo)記位點發(fā)生了重組。根據(jù)重組個體在不同染色體區(qū)域SNP位點的測序結(jié)果，結(jié)合 BC1代重組個體的表型判斷突變基因所在的區(qū)域：突變基因位于表現(xiàn)為正常表型的重組個體的大造基因型的區(qū)域，位于表現(xiàn)為突變表型的重組個體的F1代基因型的區(qū)域，二者結(jié)合判定突變基因所在的位置。

2 結(jié)果

2.1 Re-nd突變基因的連鎖分析

連鎖分析發(fā)現(xiàn)部分BC1代正常表型個體的基因型與大造的基因型不一致，部分BC1代突變表型個體的基因型與F1代的基因型不一致，表明Re-nd突變性狀與第5號染色體上的SNP位點的基因型是不連鎖的，即Re-nd的突變基因不在第5號染色體上。

以其他27條染色體篩選到的SNP標(biāo)記對BC1代的連鎖群體的基因組進(jìn)行PCR擴增和純化測序，發(fā)現(xiàn)BC1代的連鎖群體的基因型和表型在SNP標(biāo)記chr.6-2上是完全連鎖的，其余26個染色體上的SNP標(biāo)記基因型呈隨機分布，與Re-nd的突變基因無連鎖關(guān)系。進(jìn)一步以第6號染色體上的3個SNP標(biāo)記進(jìn)行PCR擴增和純化測序，發(fā)現(xiàn)24個BC1代個體的表型與在3個SNP標(biāo)記上的基因型是一致的，表明突變基因與第6號染色體連鎖，即因此可判斷Re-nd的突變基因位于第6號染色體上(表1)。

表1 家蠶Re-nd突變基因的連鎖分析Table 1 Linkage analysis of the mutant geneof Re-nd of Bombyx mori

2.2 Re-nd突變基因的定位克隆

為了進(jìn)一步鎖定Re-nd在第6號染色體上的位置，針對家蠶第6號染色體開發(fā)新的SNP標(biāo)記，篩選出18個可用的SNP標(biāo)記(表2)，選用其中相隔一定距離的9個SNP標(biāo)記對48個BC1代定位群體的突變表型個體基因組進(jìn)行PCR擴增和純化測序，將Re-nd的突變基因定位在SNP7和SNP17兩個SNP標(biāo)記之間，剩余重組個體5個；擴大樣本群體，在384個BC1代定位群體中篩到在SNP7和SNP17之間發(fā)生重組的重組個體20個，以SNP7和SNP17之間篩選出的6個SNP標(biāo)記對這25個重組個體進(jìn)行精細(xì)定位，測序后將定位區(qū)域縮小到SNP10和SNP12兩個SNP標(biāo)記之間，位于nscaf2853上，物理距離949.3 kb左右(圖2)。

表2 家蠶第6號染色體上的SNP標(biāo)記Table 2 SNP markers on chromosome 6 of Bombyx mori

圖2 家蠶Re-nd突變基因的定位克隆Fig. 2 Positional cloning of the mutant gene of Re-nd of Bombyx mori初步定位克隆結(jié)果顯示Re-nd的突變基因位于SNP標(biāo)記SNP7和SNP17之間，物理距離4.04 Mb；精細(xì)定位克隆結(jié)果顯示Re-nd的突變基因所在的區(qū)域位于SNP10和SNP12兩個SNP標(biāo)記之間的nscaf2853上，物理距離949.3 kb左右。The preliminary positional cloning results showed that the mutant gene of Re-nd was located between the SNP markers SNP7 and SNP17, with a physical distance of 4.04 Mb. The fine positional cloning results showed that the region of the mutant gene of Re-nd was located on nscaf2853 between the SNP markers SNP10 and SNP12, with a physical distance of about 949.3 kb.

2.3 定位區(qū)域內(nèi)候選基因信息分析

根據(jù)最新版本家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(SilkDB 3.0)的信息，在精細(xì)定位獲得的區(qū)域內(nèi)包含50個候選基因，其中非特征蛋白編碼基因6個，具有FLYWCH鋅指結(jié)構(gòu)域的基因8個，F(xiàn)es/CIP4和EFC/F-BAR同源域基因3個，未注釋基因8個，其他不同的功能基因28個，已有的基因信息較為復(fù)雜多樣，不容易確定候選基因，還需進(jìn)一步精細(xì)定位縮小候選區(qū)域，減少候選基因數(shù)量后再進(jìn)行詳細(xì)的信息分析和驗證。

3 討論

家蠶卵色突變基因可作為分子標(biāo)記用于轉(zhuǎn)基因篩選，白色卵突變體(w-1,w-2和w-3)和桃紅眼白卵突變體(pe)由于其卵色為淡黃色，易與非滯育卵和未受精卵相混淆而應(yīng)用受限 (Quanetal., 2002a, 2002b; Tatematsuetal., 2011; Osanai-Futahashietal., 2016)；紅卵突變體re卵色鮮明，但屬于隱性突變體，不利于篩選轉(zhuǎn)基因雜合子(Osanai-Futahashietal., 2012)；家蠶非滯育紅卵突變體Re-nd是由林英等(2007)利用化學(xué)誘變劑MNU處理家蠶品種C108而誘導(dǎo)產(chǎn)生的突變體，屬于漿膜色突變，通過與野生型品種大造和N4的遺傳雜交分析被證實屬于獨立的顯性遺傳(張宇靖等, 2020)，相對于其他卵色突變體，其卵色鮮明且為顯性性狀，易于篩選轉(zhuǎn)基因雜合子，其突變基因作為分子標(biāo)記在應(yīng)用方面潛力極大。

張宇靖等(2020)通過對Re-nd與其他已知突變基因的卵色突變品種的遺傳雜交分析，推測Re-nd的突變基因位于眼色素合成通路中w-2及pe突變基因所處位置的下游，參與眼色素生物合成后期3-羥基-犬尿氨酸進(jìn)一步代謝合成奧馬丁的過程，而目前對這一過程的研究尚不明確，且目前對家蠶卵色眼色素生物合成代謝的研究均是在滯育的前提下進(jìn)行的(Osanai-Futahashietal., 2012, 2016; Zhangetal., 2017)，非滯育狀態(tài)下的研究尚未有相關(guān)報道。

本研究以家蠶非滯育紅卵突變體Re-nd為研究對象，根據(jù)家蠶的遺傳特性，與野生型品種大造進(jìn)行雜交和回交，配制連鎖分析和定位克隆的群體材料，通過連鎖分析和定位克隆，將家蠶非滯育紅卵突變體Re-nd的突變基因定位到第6號染色體的nscaf2853上，位于兩個SNP標(biāo)記SNP10和SNP12之間，物理距離949.3 kb左右(圖2)，為后續(xù)Re-nd突變基因的精細(xì)定位及功能應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)，有助于進(jìn)一步闡釋和完善色素代謝通路，探明非滯育狀態(tài)下家蠶卵的著色機制。