閆 欣, 楊 洪, 宋佳慧, 李仁貴, 張毅波, 楊文佳,,*

(1. 貴州大學(xué)昆蟲研究所, 貴州省山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴陽 550025; 2. 貴陽學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院,貴州省山地珍稀動(dòng)物與經(jīng)濟(jì)昆蟲重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴陽 550005; 3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京100193; 4. 貴州大學(xué)煙草學(xué)院, 貴陽 550025)

昆蟲卵黃原蛋白受體(vitellogenin receptor, VgR)屬于低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor, LDLR)家族，其通過介導(dǎo)內(nèi)吞作用把卵黃原蛋白(vitellogenin, Vg)轉(zhuǎn)運(yùn)至卵母細(xì)胞的膜結(jié)合小泡上，為胚胎發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在昆蟲卵巢發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用(Tufail and Takeda, 2008; 陳利鵬等, 2016)。LDLR家族蛋白具有5個(gè)經(jīng)典保守結(jié)構(gòu)域，包括配體結(jié)合域(ligand binding domains, LBD)、表皮生長(zhǎng)因子前體同源域(epidermal growth factor precursor homology domain, EGF)、O-聯(lián)糖功能域(O-linked sugar domain, OLSD)、胞質(zhì)尾域(cytoplasmic domain, CPD)和跨膜域(transmembrane domain, TMD)(Tufail and Takeda, 2008, 2009)。研究發(fā)現(xiàn)，黑腹果蠅DrosophilamelanogasterVgR發(fā)生突變后會(huì)引起卵母細(xì)胞無法累積卵黃多肽，從而導(dǎo)致雌性成蟲不育(Schonbaumetal., 1995)；家蠶BombyxmoriVgR突變可引起Vg不能順利進(jìn)入卵巢，導(dǎo)致卵體積縮小且顏色失常(Shuetal., 2011)；通過RNAi技術(shù)沉默棉鈴蟲Helicoverpaarmigera、桔小實(shí)蠅Bactroceradorsalis、褐飛虱Nilaparvatalugens等昆蟲的VgR后，會(huì)引起Vg在血淋巴中大量沉積、卵巢發(fā)育受阻和雌性不育等現(xiàn)象(Congetal., 2015; Luetal., 2015; Zhangetal., 2016)。上述研究結(jié)果表明，VgR在昆蟲卵黃生成和卵母細(xì)胞發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用。因此，開展昆蟲VgR的功能研究有助于深入了解該基因調(diào)控昆蟲卵巢發(fā)育的分子機(jī)理，對(duì)削弱害蟲或提升益蟲的繁殖力均具有重要的實(shí)際意義(Roth and Khalaila, 2012)。

番茄潛葉蛾Tutaabsoluta隸屬于鱗翅目(Lepidoptera)麥蛾科(Gelechiidae)，又名番茄潛麥蛾，是一種極具毀滅性的世界檢疫性害蟲，主要危害番茄、茄子、馬鈴薯等茄科植物，對(duì)番茄表現(xiàn)出明顯偏好性。番茄潛葉蛾雌成蟲繁殖力強(qiáng)，單頭產(chǎn)卵量最多可達(dá)260粒左右，主要散產(chǎn)于植物葉片、嫩莖、頂芽和果實(shí)上，幼蟲一經(jīng)孵化便鉆蛀植物組織潛食危害，造成葉片皺縮枯萎、頂芽枯死、未熟果實(shí)腐爛或脫落，危害嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致番茄產(chǎn)量損失高達(dá)80%～100%(Desneuxetal., 2010; Zhangetal., 2020)。番茄潛葉蛾原產(chǎn)于南美洲的秘魯(Biondietal., 2018)，2006年入侵西班牙后迅速擴(kuò)散至整個(gè)非洲-歐亞大陸(Zhangetal., 2020)。2017年8月，張桂芬等于新疆維吾爾自治區(qū)伊犁哈薩克自治州發(fā)現(xiàn)了番茄潛葉蛾，證實(shí)該害蟲已入侵我國(guó)，推測(cè)其會(huì)對(duì)我國(guó)的番茄生產(chǎn)造成巨大危害(Zhangetal., 2020)。番茄潛葉蛾具有氣候環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、定殖速度快的特性，其暴發(fā)危害會(huì)大幅增加化學(xué)農(nóng)藥使用量，導(dǎo)致番茄市場(chǎng)價(jià)格升高等一系列不利市場(chǎng)效應(yīng)(Zappalàetal., 2013)。本研究在番茄潛葉蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，克隆卵黃原蛋白受體基因TaVgR，解析其在番茄潛葉蛾不同發(fā)育階段和成蟲不同組織中的表達(dá)模式，并采用RNAi技術(shù)解析其在番茄潛葉蛾生殖發(fā)育過程中的調(diào)控作用。研究結(jié)果不僅有助于闡明昆蟲生殖調(diào)控機(jī)制，也可為番茄潛葉蛾的綠色可持續(xù)治理提供新思路和新靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

供試番茄潛葉蛾種群于2018年采自云南省玉溪市，在實(shí)驗(yàn)室陽光房中連續(xù)飼養(yǎng)至今。番茄潛葉蛾幼蟲以新鮮番茄幼苗為食，成蟲供以10%的蜂蜜水。 飼養(yǎng)條件為溫度26±1℃，相對(duì)濕度60%±5%，光周期16L∶8D。

1.2 主要試劑

總RNA提取試劑TransZolUp、基因組DNA去除及反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、PCR試劑盒TransTaq?DNA Polymerase High Fidelity、大腸桿菌Escherichiacoli感受態(tài)細(xì)胞Trans5α、qPCR試劑盒TransStart?Top Green qPCR SuperMix (北京全式金生物公司)；膠回收試劑盒HiPure Gel Pure DNA Kits(Magen)；載體pGEM-T Easy Vector (Promega)；RNAi試劑盒TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit (Thermo Scientific)。

1.3 總RNA提取與cDNA第1鏈的合成

按照TransZolUp試劑盒說明書提取羽化后第3天番茄潛葉蛾雌成蟲總RNA，使用NanoDrop 2000核酸蛋白濃度測(cè)定儀(Thermo Scientific)檢測(cè)所提RNA的濃度和OD260/OD280值(1.8～2.2之間)，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性。以1 μL優(yōu)質(zhì)RNA樣品為模板，按照TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix說明書合成cDNA第1鏈，存于-20℃冰箱備用。

1.4 番茄潛葉蛾TaVgR基因的克隆

基于番茄潛葉蛾轉(zhuǎn)錄組獲得的VgR基因的unigene序列，使用Primer Primier 6.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增TaVgR基因的開放閱讀框序列。PCR反應(yīng)體系:TransTaq?HiFi DNA Polymerase 1 μL, 10×TransTaq?HiFi Buffer Ⅱ 5 μL, dNTPs (2.5 mmol/L) 4 μL, cDNA模板2 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, ddH2O補(bǔ)至總體積50 μL。反應(yīng)程序: 94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸5 min, 共35個(gè)循環(huán)；最終72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定，按照HiPure Gel Pure DNA Kit說明書回收目的條帶，連接至pGEM-T Easy Vector進(jìn)行TA克隆，經(jīng)藍(lán)白斑篩選挑取單個(gè)白色菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，PCR鑒定出陽性克隆后，將其送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.5 序列分析

采用DNAMAN 6.0 (Lynnon Biosoft)對(duì)TaVgR基因序列進(jìn)行編輯和分析；利用BLAST工具(http:∥www.ncbi.nlm.gov/BLAST/)對(duì)推導(dǎo)的氨基酸進(jìn)行同源性比對(duì)分析；利用SignalP 6.0 Server (http:∥services.healthtech.dtu.dk/services.php?SignalP)預(yù)測(cè)信號(hào)肽；利用ProtParam(http:∥web.expasy.org/)分析理化性質(zhì)；利用NetNGlys 1.0 server (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)預(yù)測(cè)N-糖基化位點(diǎn)；利用NCBI在線工具conserved domains (https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)查找保守區(qū)域；利用TMHMM Server 2.0 (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)分析跨膜域；使用MEGA 6.0軟件中的鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，樹中各分支均進(jìn)行1 000次的重復(fù)檢驗(yàn)(Tamuraetal., 2013)。

1.6 番茄潛葉蛾TaVgR基因的時(shí)空表達(dá)模式測(cè)定

選取同一批孵化的番茄潛葉蛾幼蟲，以長(zhǎng)勢(shì)一致的番茄苗為寄主植物進(jìn)行飼養(yǎng)，分別收集1-4齡幼蟲、1-7日齡雌蛹和雌成蟲樣品，每個(gè)發(fā)育時(shí)期30～50頭試蟲為一生物學(xué)重復(fù)，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。在雌成蟲羽化第5天，使用微量CO2麻醉后進(jìn)行解剖，分別獲得頭、體壁、前腸、中腸、后腸、卵巢、脂肪體和馬氏管共8種組織樣品，每組織解剖50頭試蟲為一生物學(xué)重復(fù)，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。將所有樣品經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃冰箱，按照1.3節(jié)方法分別提取上述材料總RNA并合成cDNA。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)番茄潛葉蛾內(nèi)參基因穩(wěn)定性的評(píng)估結(jié)果，選取TaEF1a(GenBank登錄號(hào): MZ054826)作為內(nèi)參基因(Yanetal., 2021)。qPCR擴(kuò)增在CFX96TMReal-Time System實(shí)時(shí)定量PCR儀(Bio-Rad)中進(jìn)行，反應(yīng)體系(20 μL):TransStart?Top Green qPCR SuperMix 10 μL, ddH2O 7 μL, cDNA模板1 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL。qPCR反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性5 min; 95℃變性15 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 共40個(gè)循環(huán)；最后于60～95℃進(jìn)行熔解曲線分析。每樣品重復(fù)測(cè)定3次。采用2-ΔΔCT方法計(jì)算TaVgR在番茄潛葉蛾不同發(fā)育階段和雌成蟲不同組織中的相對(duì)表達(dá)量(Livak and Schmittgen, 2001)。

1.7 番茄潛葉蛾TaVgR的RNAi實(shí)驗(yàn)

根據(jù)番茄潛葉蛾TaVgR和綠色熒光蛋白基因GFP的cDNA序列，在其5′端添加T7啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)雙鏈合成引物(表1)，參照TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit說明書合成dsRNA。合成的dsRNA經(jīng)純化后，用RNAi注射緩沖液稀釋至1 μg/μL備用。隨機(jī)選取大小一致、發(fā)育整齊的番茄潛葉蛾4日齡雌蛹，利用Nanoliter 2010全自動(dòng)顯微注射儀(World Precision Instruments)進(jìn)行dsRNA注射，每頭試蟲的注射量為500 ng，同時(shí)注射等量的dsGFP作為陰性對(duì)照，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)注射30頭。注射后的蛹放入無菌土壤中正常飼養(yǎng)，分別收集dsRNA注射12, 24, 48和72 h后的試蟲，采用RT-qPCR技術(shù)(方法同1.6節(jié))檢測(cè)RNAi對(duì)靶標(biāo)基因的沉默效率。dsRNA注射24 h后觀察蛹的存活情況并記錄，待羽化并與同天羽化的雄蛾以1∶3的比例放入單獨(dú)飼養(yǎng)裝置(含新鮮番茄葉片)中，雌、雄成蟲正常交配并產(chǎn)卵，每24 h更換一次新葉片，計(jì)算單雌1-10 d每日產(chǎn)卵量和10 d總產(chǎn)卵量，以及后代卵的孵化率。選取羽化后第1天的雌成蟲進(jìn)行解剖，觀察卵巢發(fā)育情況，測(cè)量卵巢管長(zhǎng)度和卵粒長(zhǎng)度，并用VHX-2000超景深三維顯微觀察系統(tǒng)(基恩士)拍照記錄。

1.8 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，基因表達(dá)量數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件的單因素方差分析法進(jìn)行差異顯著性分析，RNAi后處理組和對(duì)照組之間進(jìn)行差異顯著性分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。利用GraphPad Prism 8.0.1軟件制圖。

2 結(jié)果

2.1 TaVgR基因的克隆與序列特征

利用RT-PCR擴(kuò)增獲得番茄潛葉蛾TaVgR基因(GenBank登錄號(hào): MZ682118)的cDNA全長(zhǎng)序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后得到與預(yù)期條帶大小一致的目的片段。TaVgR開放閱讀框長(zhǎng)5 496 bp，編碼1 831個(gè)氨基酸，理論蛋白質(zhì)分子量為206 kD，等電點(diǎn)為5.17。TaVgR編碼的蛋白N端前18個(gè)氨基酸殘基MAYQHLFFLFLCLMSCSA為信號(hào)肽，有16個(gè)糖基化位點(diǎn)(NXT和NXS)。跨膜域分析結(jié)果表明，第1 699-1 721位氨基酸為跨膜域，第1 722-1 831位氨基酸為胞質(zhì)尾域，其余氨基酸部分為胞外區(qū)域。序列比對(duì)結(jié)果顯示，番茄潛葉蛾VgR與其他22種昆蟲VgR的結(jié)構(gòu)高度相似，其保守區(qū)域及保守基序(LBD和EGF)位置較為一致，表明TaVgR是LDLR家族成員，具有5個(gè)典型的功能域(LBD, EGF, OLSD, CPD和TMD)。同源性序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，番茄潛葉蛾VgR與蓖麻蠶Samiaricini的VgR(GenBank登錄號(hào): AYA29178)和綠尾大蠶蛾Actiasselene的VgR (GenBank登錄號(hào): AFV32171)的氨基酸序列一致性均為47%，與甜菜夜蛾Spodopteraexigua的VgR (GenBank登錄號(hào): AOX13593)、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera的VgR (GenBank登錄號(hào): AGF33811)和柞蠶Antheraeapernyi的VgR (GenBank登錄號(hào): AEJ88360)氨基酸序列一致性均為46%。

2.2 TaVgR的系統(tǒng)發(fā)育

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，不同目的昆蟲VgR各自聚成小類群，表明昆蟲VgR在進(jìn)化上具有較好的保守性；番茄潛葉蛾VgR和鱗翅目昆蟲VgR聚為一支，且與螟蛾昆蟲柑橘卷葉蛾Amyeloistransitella和粉斑螟蛾Cadracautella最為近緣(圖1)。

圖1 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的番茄潛葉蛾與其他昆蟲VgR的系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000次重復(fù))Fig. 1 Phylogenetic tree of VgRs from Tuta absoluta and other insects constructed by neighbor joining method (1 000 repetitions)based on amino acid sequence蛋白來源物種Origin species of proteins: Ad: 排蜂Apis dorsata; Am: 西方蜜蜂Apis mellifera; Em: 蘭花蜜蜂Eufriesea mexicana; Hl: 東南藍(lán)莓蜂Habropoda laboriosa; Mr: 苜蓿切葉蜂Megachile rotundata; Ap: 豌豆長(zhǎng)管蚜Acyrthosiphon pisum; Bt: 煙粉虱Bemisia tabaci; Nl: 褐飛虱Nilaparvata lugens; Nc: 黑尾葉蟬Nephotettix cincticeps; Aa: 埃及伊蚊Aedes aegypti; Dm: 黑腹果蠅Drosophila melanogaster; Md: 家蠅Musca domestica; Bd: 桔小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis; Sr: 蓖麻蠶Samia ricini; Se: 甜菜夜蛾Spodoptera exigua; Sl: 斜紋夜蛾Spodoptera litura; Ha: 棉鈴蟲Helicoverpa armigera; Bm: 家蠶Bombyx mori; As: 綠尾大蠶蛾Actias selene; At: 柑橘卷葉蛾Amyelois transitella; Cc: 粉斑螟蛾Cadra cautella; Mv: 豆莢螟Maruca vitrata.

2.3 TaVgR基因的時(shí)空表達(dá)模式

番茄潛葉蛾不同發(fā)育階段和雌成蟲組織中TaVgR基因的表達(dá)模式解析結(jié)果(圖2)顯示，從幼蟲期至蛹期，TaVgR基因的轉(zhuǎn)錄水平隨著齡期的增加而升高，在雌蛹和雌成蟲中的表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)，且在雌成蟲中達(dá)到峰值，較雌蛹期的TaVgR轉(zhuǎn)錄水平提高了4.57倍(圖2: A)。TaVgR在番茄潛葉蛾雌成蟲的卵巢中特異性高表達(dá)，表達(dá)水平顯著高于其他組織中的(P<0.05)，在其余組織中的表達(dá)水平則無顯著差異(P>0.05)(圖2: B)。

圖2 番茄潛葉蛾TaVgR在不同發(fā)育階段(A)和雌成蟲組織(B)中的相對(duì)表達(dá)量Fig. 2 Relative expression levels of TaVgR in different developmental stages (A) and female adult tissues (B) of Tuta absolutaL1-4: 分別為1-4齡幼蟲1st-4th instar larvae, respectively; PD1-7: 分別為1-7日齡雌蛹1-7-day-old female pupae, respectively; FA: 雌成蟲Female adult; HD: 頭Head; IN: 體壁 Integument; FG: 前腸Foregut; MG: 中腸Midgut; HG: 后腸Hindgut; OV: 卵巢Ovary; FB: 脂肪體Fat body; MT: 馬氏管Malpighian tubules. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同字母表示基因表達(dá)量在不同發(fā)育階段和成蟲不同組織間存在顯著差異(P<0.05, LSD)。Data in the figure are mean±SE. Different letters above bars represent significant difference in the gene expression level between different developmental stages and adult tissues (P<0.05, LSD).

2.4 干擾TaVgR基因表達(dá)的生物學(xué)效應(yīng)

利用RNAi技術(shù)沉默番茄潛葉蛾TaVgR基因，發(fā)現(xiàn)TaVgR的mRNA表達(dá)量在dsTaVgR注射后12, 24, 48和72 h較對(duì)照(注射dsGFP)分別下降了62.04%, 72.55%, 70.02%和70.15%(P<0.01)，表明該基因的表達(dá)被有效抑制(圖3: A)。待試蟲羽化后按照雌雄比1∶3進(jìn)行單獨(dú)飼養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)單頭雌成蟲1-10 d的產(chǎn)卵量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組和處理組雌成蟲每日產(chǎn)卵量均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，羽化第2天為產(chǎn)卵高峰期，此時(shí)處理組產(chǎn)卵量較對(duì)照組降低了61.71%(P<0.001)(圖3: B)。測(cè)定注射后單雌1-10 d單日產(chǎn)卵量、10 d總產(chǎn)卵量及后代卵孵化率，發(fā)現(xiàn)注射dsTaVgR的番茄潛葉蛾的10 d單雌總產(chǎn)卵量為90粒，而注射dsGFP組的10 d單雌總產(chǎn)卵量可達(dá)到255粒，二者差異極顯著(P<0.01)(圖3: C)，但二者的后代卵孵化率無顯著差異(P>0.05)(圖3: D)。

由于番茄潛葉蛾羽化后24 h內(nèi)卵巢發(fā)育已經(jīng)成熟，解剖此時(shí)的雌成蟲卵巢，測(cè)量并記錄卵巢管和成熟卵粒長(zhǎng)度，發(fā)現(xiàn)注射dsTaVgR組平均卵巢管長(zhǎng)度為2 846.11 μm，較注射dsGFP組(4 633.49 μm)下降了38.58%(P<0.05)(圖3: E)。注射dsGFP組番茄潛葉蛾成熟卵粒較多，平均卵粒長(zhǎng)355.43 μm，而注射dsTaVgR組成熟卵粒較少，平均卵粒長(zhǎng)258.17 μm(圖3: F)。注射dsTaVgR組番茄潛葉蛾卵巢管明顯縮短，成熟卵粒數(shù)和卵粒大小明顯小于注射dsGFP組的，大部分卵粒卵黃蛋白沉積較少，呈空癟狀態(tài)(圖3: G)。

圖3 TaVgR RNAi對(duì)番茄潛葉蛾卵巢發(fā)育及繁殖力的影響Fig. 3 Effect of RNAi of TaVgR on the ovarian development and fecundity of Tuta absolutaA: 注射dsRNA不同時(shí)間后TaVgR的表達(dá)量Expression levels of TaVgR at different time after injection of dsRNA; B: 注射dsTaVgR后1-10 d的單雌產(chǎn)卵量Number of eggs laid per female at 1-10 d after injection of dsTaVgR; C: 注射dsTaVgR后的10日單雌總產(chǎn)卵量Total number of eggs laid per female in 10 d after injection of dsTaVgR; D: 注射dsTaVgR后后代卵的孵化率Egg hatching rate of offspring after injection of dsTaVgR; E: 番茄潛葉蛾雌蛹注射dsTaVgR后成蟲羽化24 h時(shí)卵巢管長(zhǎng)度變化Changes in the length of the ovarioles of the 24 h-old adults after injection of dsTaVgR into the female pupae of T. absoluta; F: 番茄潛葉蛾雌蛹注射dsTaVgR后成蟲羽化24 h時(shí)成熟卵粒長(zhǎng)度變化Changes in the length of mature eggs of the 24 h-old adults after injection of dsTaVgR into the female pupae of T. absoluta; G: 番茄潛葉蛾雌蛹注射dsTaVgR后成蟲羽化24 h時(shí)的卵巢形態(tài)變化Morphological changes of the ovaries of the 24 h-old adults after injection of dsTaVgR into the female pupae of T. absoluta. 向番茄潛葉蛾雌蛹注射dsRNA(500 ng/頭)進(jìn)行RNA干擾試驗(yàn)。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；星號(hào)表示對(duì)照組(注射dsGFP)和處理組之間存在顯著差異(*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001)(t檢驗(yàn))，而ns代表無顯著性差異(P>0.05, t檢驗(yàn))。RNAi experiment was performed by injecting dsRNA (500 ng/individual) into the female pupae of T. absoluta. Data in the figure are mean±SE. The asterisk indicates significant difference between the control group (injected with dsGFP) and the treatment group (*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001) (t-test), while ns represents no significant difference (P>0.05, t-test).

3 討論

研究表明，VgR同一保守結(jié)構(gòu)域在不同昆蟲中的拷貝數(shù)及內(nèi)部重復(fù)基序有所差異。本研究表明，番茄潛葉蛾TaVgR包含2個(gè)LBD，其中LBD1有4個(gè)重復(fù)基序，而其他昆蟲的LBD1與之不同，如褐飛虱、黑尾葉蟬、埃及伊蚊、黑腹果蠅和家蠅具有5個(gè)，蜜蜂僅有3個(gè)(陳利鵬等, 2016; Liuetal., 2016)。番茄潛葉蛾VgR的LBD2與多數(shù)已知鱗翅目昆蟲相同，包含了7個(gè)LDLa基序，但同為鱗翅目的小菜蛾P(guān)lutellaxylostella則有8個(gè)(王加偉, 2016)。兩個(gè)LBD后面均有1個(gè)EGF，不同昆蟲的EGF均具有富含半胱氨酸殘基的B型重復(fù)基序和YWTD基序，不同昆蟲間LDLb重復(fù)基序數(shù)量不盡相同，這可能與其分子功能和VgR的內(nèi)吞作用效應(yīng)有關(guān)。番茄潛葉蛾VgR與西方蜜蜂、黑腹果蠅、埃及伊蚊等昆蟲一樣，含有1個(gè)OLSD，然而粘蟲Mythimnaseparata、斜紋夜蛾、棉鈴蟲VgR均不含OLSD，其具體功能尚不明確(李杰, 2018)。番茄潛葉蛾僅有1個(gè)TMD，而煙粉虱Bemisiatabaci、豌豆蚜Acyrthosiphonpisum和地中海實(shí)蠅Ceratitiscapitata等昆蟲的VgR具有2個(gè)TMD (郭建洋, 2010; Congetal., 2015)。不同物種VgR間的結(jié)構(gòu)差異是否會(huì)產(chǎn)生功能多效性，是否會(huì)影響其與配體的識(shí)別作用等仍不清楚，還有待深入研究。

昆蟲VgR在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量存在明顯差異，大多數(shù)物種的表達(dá)峰值出現(xiàn)在成蟲期，如粘蟲VgR表達(dá)量隨著成蟲日齡的增加而升高，在羽化第5天達(dá)到峰值(李杰, 2018)。紅火蟻Solenopsisinvicta、家蠶、棉鈴蟲和斜紋夜蛾的結(jié)果與之基本相似，在初羽化的雌成蟲中VgR表達(dá)水平較高，且在卵黃發(fā)生時(shí)期持續(xù)升高(Chenetal., 2004; Tufail and Takeda, 2005; Zhangetal., 2016)。這與本研究中番茄潛葉蛾TaVgR基因的表達(dá)情況相符，隨著卵黃發(fā)生過程其表達(dá)量逐漸升高(圖2)。本研究進(jìn)一步說明昆蟲VgR與卵黃發(fā)生過程密切相關(guān)，并在前期表現(xiàn)較高表達(dá)水平，而在整個(gè)卵黃發(fā)生過程中呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢(shì)。組織特異性研究結(jié)果表明，番茄潛葉蛾TaVgR基因在雌蟲卵巢中特異性高表達(dá)(圖2: B)，這與其他大部分昆蟲的結(jié)果一致。卵巢是昆蟲重要的生殖器官，表明VgR參與昆蟲生殖發(fā)育的調(diào)控(Linetal., 2015; Luetal., 2015)。但也有研究表明，不同昆蟲VgR組織表達(dá)模式存在差異，如粘蟲、柞蠶和野桑蠶Bombyxmandarina幼蟲脂肪體內(nèi)VgR高表達(dá)，可能通過影響昆蟲的能量和營(yíng)養(yǎng)代謝調(diào)控幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育(Liuetal., 2011; 付維維, 2013; 李杰, 2018)。西方蜜蜂VgR在頭部、咽下腺和中腸有較高的表達(dá)，推測(cè)其在種群的信息交流、行為活動(dòng)和社會(huì)分工等生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用(Guidugli-Lazzarinietal., 2008)。

為了探索TaVgR基因在番茄潛葉蛾生殖發(fā)育中的作用，本研究選擇在番茄潛葉蛾TaVgR基因表達(dá)啟動(dòng)前期(4日齡雌蛹)注射dsTaVgR，發(fā)現(xiàn)dsTaVgR注射后TaVgR的表達(dá)量較對(duì)照組(注射dsGFP)明顯下調(diào)，羽化后雌蛾產(chǎn)卵量顯著降低，卵巢管變短且成熟卵粒體積變小，卵母細(xì)胞中沉積的卵黃含量顯著減少(圖3)，導(dǎo)致其生殖力明顯下降。在斜紋夜蛾蛹期，VgR表達(dá)的抑制破壞了卵母細(xì)胞對(duì)Vg的攝取，使血淋巴中的Vg積累，最終引起卵巢管發(fā)育受阻，產(chǎn)卵量顯著降低(Shuetal., 2011)。通過對(duì)家蠶蛹第1, 4和7天注射dsVgR，發(fā)現(xiàn)雌蛾能正常羽化，但其中VgR沉默率較高的家蠶不能產(chǎn)卵，解剖可觀察其卵巢管偏短，無卵子產(chǎn)生；而VgR沉默率較低的家蠶能交配產(chǎn)卵，但所產(chǎn)卵粒多為小型卵，且顏色偏白(Linetal., 2013)；在褐色桔蚜Aphiscitricida中，AcVgR基因表達(dá)量的下降導(dǎo)致其若蟲-成蟲過渡延遲、生殖前期延長(zhǎng)和生殖期縮短，從而導(dǎo)致其卵巢發(fā)育減慢且后代數(shù)量明顯減少(Shangetal., 2018)。

綜上所述，本研究利用RT-PCR技術(shù)克隆獲得番茄潛葉蛾TaVgR基因的cDNA全長(zhǎng)序列，該基因在番茄潛葉蛾雌成蟲和卵巢中表達(dá)量較高。進(jìn)一步抑制TaVgR基因的表達(dá)后，番茄潛葉蛾雌蟲的卵巢發(fā)育受阻，其卵黃含量明顯減少，卵巢管變短，且產(chǎn)卵量顯著下降，表明TaVgR基因在番茄潛葉蛾的卵巢發(fā)育和繁殖過程中發(fā)揮了重要作用。