葉晨旭, 宋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn), 張文秀, 吳濤宇, 劉 鶴, 邢連喜, 蘇曉紅,*

(1. 西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 西安710069; 2. 陜西省珍稀瀕危動(dòng)物保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 西安710069)

社會(huì)性昆蟲由于個(gè)體之間的分化和相互合作而構(gòu)成了復(fù)雜的品級(jí)結(jié)構(gòu)，“分工合作”是社會(huì)性昆蟲在生態(tài)學(xué)上高度進(jìn)化的一個(gè)重要因素。在所有的社會(huì)性昆蟲中，白蟻具有最復(fù)雜和顯著的品級(jí)分化。白蟻在卵期并不包含品級(jí)的某種特殊因素，品級(jí)分化現(xiàn)象是在卵期以后的發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)的。品級(jí)分化調(diào)節(jié)因素有3個(gè)方面：環(huán)境因素、作用于個(gè)體之間的信息素和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)因素(Elliott and Stay, 2008; Korb, 2015)。白蟻通常有兵蟻、工蟻和生殖蟻3個(gè)品級(jí)，品級(jí)的分化最終是由基因表達(dá)差異決定的(Yeetal., 2019)；不同品級(jí)甚至在表皮結(jié)構(gòu)和表皮蛋白相關(guān)基因表達(dá)都有顯著差異，這些差異與品級(jí)的功能相適應(yīng)(Suetal., 2016; Rasheedetal., 2019)。散白蟻屬Reticulitermes卵孵化后經(jīng)過(guò)2個(gè)齡期幼蟻發(fā)育途徑向兩個(gè)方向分化: 一個(gè)是若蟻途徑(生殖型途徑)，長(zhǎng)翅成蟲就是由此途徑產(chǎn)生并經(jīng)過(guò)婚飛配對(duì)建立新巢成為原始蟻王和蟻后，也可形成翅芽型補(bǔ)充生殖蟻(brachypterous neotenic reproductives)和擬成蟲型補(bǔ)充生殖蟻(adultoid neotenic reproductives)；另一個(gè)是工蟻途徑,工蟻發(fā)育有3種可能：維持工蟻、經(jīng)過(guò)2次蛻皮成為兵蟻或成為無(wú)翅芽型補(bǔ)充生殖蟻(Elliott and Stay, 2008; Korb and Hartfelder, 2008; Korb, 2015; Suetal., 2015)。因此，僅有工蟻的蟻群可以自行產(chǎn)生補(bǔ)充生殖蟻(neotenic reproductives, NRs)和兵蟻發(fā)育為成熟蟻群。散白蟻雄性工蟻不需要轉(zhuǎn)化成為形態(tài)明顯的補(bǔ)充生殖蟻就能直接參與交配，而雌性工蟻經(jīng)歷2次蛻皮才能轉(zhuǎn)化成為雌性補(bǔ)充生殖蟻(Fujita and Watanabe, 2010; Leniaudetal., 2011; Suetal., 2017)。已有的研究證實(shí)白蟻巢中的信息素誘導(dǎo)個(gè)體內(nèi)保幼激素(juvenile hormone, JH)合成水平的動(dòng)態(tài)變化，JH通過(guò)調(diào)控品級(jí)相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)工蟻向兵蟻和補(bǔ)充生殖蟻的轉(zhuǎn)化(Korb and Hartfelder， 2008; Oguchietal., 2020)。

雌性工蟻向補(bǔ)充生殖蟻轉(zhuǎn)化最主要的特征是性腺發(fā)育的恢復(fù)，然而工蟻卵巢的發(fā)育一直是不清楚的。已有的報(bào)道僅是表明工蟻的性腺發(fā)育受抑制，對(duì)工蟻生殖發(fā)育缺乏深入研究，尤其雌性工蟻必須經(jīng)過(guò)蛻皮轉(zhuǎn)化成補(bǔ)充生殖蟻之后才能啟動(dòng)生殖力，這個(gè)過(guò)程非常復(fù)雜。因此，需要對(duì)雌工蟻從低齡發(fā)育到老齡，以及老齡工蟻轉(zhuǎn)化成補(bǔ)充生殖蟻這個(gè)過(guò)程中卵巢和卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程進(jìn)行完整研究，只有這樣才能闡明工蟻生殖能力的改變是如何發(fā)生的。棲北散白R(shí)eticulitermessperatus雌性工蟻向補(bǔ)充生殖蟻轉(zhuǎn)化卵巢長(zhǎng)度約增加了4倍(Fujita and Watanabe, 2010)；對(duì)尖唇散白蟻Reticulitermesaculabialis生殖蟻、工蟻和兵蟻卵子發(fā)生比較研究表明三者之間卵母細(xì)胞發(fā)育程度有顯著性差異(朱蓉等, 2009; 王云霞等, 2011)。卵母細(xì)胞發(fā)育無(wú)疑是決定生殖力水平變化的關(guān)鍵因素，3齡雌性工蟻發(fā)育到6齡(老齡)工蟻，再轉(zhuǎn)化為補(bǔ)充生殖蟻的過(guò)程中，卵巢以及生殖細(xì)胞發(fā)育是如何與其品級(jí)的功能相適應(yīng)的目前還不清楚。

散白蟻屬是世界上分布最廣的白蟻類群之一，在生態(tài)穩(wěn)定和社會(huì)經(jīng)濟(jì)中具有重要作用(Jongepieretal., 2018)。我國(guó)有白蟻4科44屬476種，其中散白蟻屬有111種(黃復(fù)生等, 2000; 程冬保和楊兆芬, 2014)。散白蟻種群擴(kuò)張能力強(qiáng)與雌性工蟻向補(bǔ)充生殖蟻轉(zhuǎn)化發(fā)育有直接關(guān)系。為了揭示雌性工蟻發(fā)育和生殖力改變過(guò)程中的性腺發(fā)育，我們研究了圓唇散白蟻Reticulitermeslabralis雌性工蟻從3齡-4齡-5齡-6齡(老齡)-轉(zhuǎn)化成補(bǔ)充生殖蟻發(fā)育過(guò)程中的卵巢和卵母細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化；在圓唇散白蟻若蟻向3類生殖蟻轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)錄組中篩選出與卵母細(xì)胞生長(zhǎng)期相關(guān)的基因，并利用這些基因在工蟻向補(bǔ)充生殖蟻轉(zhuǎn)化發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)變化，揭示工蟻向補(bǔ)充生殖蟻轉(zhuǎn)化過(guò)程中卵母細(xì)胞從滯育到恢復(fù)生長(zhǎng)發(fā)育的起點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 白蟻培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用的圓唇散白蟻R.labralis采自陜西省西安市，將帶有蟻巢的木頭帶回實(shí)驗(yàn)室，放置于塑料培養(yǎng)箱內(nèi)(80 cm×50 cm×40 cm)室溫培養(yǎng)；培養(yǎng)箱中的巢群在實(shí)驗(yàn)中作為原巢，從原巢取得的工蟻稱為原巢工蟻。6齡及6齡以上齡期的工蟻為老齡工蟻，圓唇散白蟻的老齡工蟻主要為6齡。從原巢中取老齡工蟻和兵蟻組成隔離群，每個(gè)隔離群由50頭老齡工蟻和2頭兵蟻組成，共設(shè)置100個(gè)隔離群，隔離群中的工蟻稱為“隔離工蟻”。每個(gè)隔離群都飼養(yǎng)在鋪有潮濕松木屑的玻璃培養(yǎng)皿中(直徑90 mm)。每天觀察和記錄隔離工蟻發(fā)育情況。在隔離群中，約3周以后出現(xiàn)由雌性工蟻分化的前補(bǔ)充生殖蟻(pre-neotenic reproductives, pre-NRs)，4周以后出現(xiàn)雌性無(wú)翅型補(bǔ)充生殖蟻。

1.2 工蟻以及工蟻向補(bǔ)充生殖蟻轉(zhuǎn)化過(guò)程中的卵巢發(fā)育觀察

在原巢中采集3-5齡和老齡工蟻；在隔離群中收集培養(yǎng)20 d的工蟻、前補(bǔ)充生殖蟻、轉(zhuǎn)變2 d的補(bǔ)充生殖蟻和膨腹的補(bǔ)充生殖蟻。在PBS溶液中解剖個(gè)體取得完整卵巢，利用顯微數(shù)碼照相系統(tǒng)VHX-5000(基恩士公司，日本)拍照并測(cè)量每個(gè)卵巢的長(zhǎng)度和寬度(n=10)，卵巢長(zhǎng)度包括卵原區(qū)、生長(zhǎng)區(qū)和卵黃區(qū)，在卵巢最寬處測(cè)量的值計(jì)為卵巢寬度; 測(cè)量各發(fā)育時(shí)期卵巢管基部的卵母細(xì)胞長(zhǎng)徑用來(lái)表示卵母細(xì)胞大小(n=10)。卵巢的長(zhǎng)度和寬度以及卵母細(xì)胞大小均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.3 工蟻向補(bǔ)充生殖蟻轉(zhuǎn)化過(guò)程中的卵母細(xì)胞和濾泡細(xì)胞發(fā)育觀察

將原巢雌性工蟻、在隔離群中培養(yǎng)20 d的雌性工蟻、前補(bǔ)充生殖蟻、轉(zhuǎn)變2 d的補(bǔ)充雌性生殖蟻和膨腹的補(bǔ)充生殖蟻個(gè)體常規(guī)石蠟切片法切片，切片厚度7 μm，蘇木精-伊紅染色(haematoxylin and eosin staining)。利用數(shù)碼顯微照相系統(tǒng)觀察卵母細(xì)胞發(fā)育和濾泡細(xì)胞形態(tài)，測(cè)量濾泡細(xì)胞層厚度(n=10), 濾泡細(xì)胞層厚度用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.4 基因的篩選

末齡若蟻卵子發(fā)生處于卵母細(xì)胞生長(zhǎng)期，經(jīng)過(guò)一次蛻皮成為翅芽型補(bǔ)充生殖蟻、擬成蟲型補(bǔ)充生殖蟻或有翅成蟲之后, 卵母細(xì)胞開(kāi)始進(jìn)入卵黃形成期。雌性工蟻恢復(fù)生殖能力必須啟動(dòng)卵母細(xì)胞發(fā)育至末齡若蟻水平，具有與末齡若蟻相似的卵母細(xì)胞形態(tài)特征和卵母細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)模式。我們已經(jīng)測(cè)定了圓唇散白蟻末齡若蟻、以及由末齡若蟻分化的翅芽型補(bǔ)充生殖蟻、擬成蟲型補(bǔ)充生殖蟻和有翅成蟲轉(zhuǎn)錄組(Suetal., 2016)。利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)若蟻和由末齡若蟻分化的生殖蟻的卵母細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)水平進(jìn)行比較分析，篩選出在末齡若蟻中的表達(dá)水平顯著高于轉(zhuǎn)化初期生殖蟻的與卵母細(xì)胞生長(zhǎng)期發(fā)育相關(guān)的基因，這些基因調(diào)控卵母細(xì)胞在生長(zhǎng)期的發(fā)育。

1.5 qRT-PCR測(cè)定卵母細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)基因在工蟻向補(bǔ)充生殖蟻轉(zhuǎn)化中的表達(dá)水平

1.5.1RNA提取及反轉(zhuǎn)錄：在液氮中分別研磨1.3節(jié)樣品至粉末狀，提取RNA；對(duì)RNA進(jìn)行純度檢測(cè)合格后，進(jìn)行下一步反轉(zhuǎn)錄。選取10 μL體系，RNA溶液8 μL，加入PrimeScriptTMRT Master Mix 2 μL，37℃反轉(zhuǎn)錄15 min，85℃反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)5 s，獲得cDNA文庫(kù)。

1.5.2引物的篩選：通過(guò)BLASTX軟件設(shè)計(jì)所選基因的引物序列(表1)，內(nèi)參基因確定為β-action，配置5 μL梯度PCR實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系: Master Mix 2.5 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL, ddH2O 1.9 μL, cDNA 0.2 μL。梯度PCR溫度范圍為55±5℃，分為12個(gè)溫度梯度。反應(yīng)后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，篩選出可用引物，確定最適退火溫度。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR

1.5.3qRT-PCR反應(yīng)：選用Roche LightCycler?480熒光定量PCR反應(yīng)儀器， PCR反應(yīng)體系(20 μL): SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL, ROX 0.4 μL, ddH2O 6 μL, cDNA 2 μL。反應(yīng)程序: 95℃ 30 s; 95℃ 5 s, 60℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán)；融解曲線模式95℃ 5 s, 60℃ 1 min；降溫50℃ 30 s。每樣品有3個(gè)生物重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

qRT-PCR反應(yīng)的基因相對(duì)表達(dá)水平用 2-ΔΔCt方法計(jì)算。用R語(yǔ)言中的aov()函數(shù)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，通過(guò)Tukey HSD()函數(shù)進(jìn)行多重比較得到各樣本均值差異的成對(duì)檢測(cè)，P<0.05為顯著性差異；最后用multcomp包中的glht()函數(shù)對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 工蟻向補(bǔ)充生殖蟻轉(zhuǎn)化的形態(tài)學(xué)變化

圓唇散白蟻工蟻身體為淺麥黃色(圖1: A)；前補(bǔ)充生殖蟻(pre-NRs)身體為乳白色，腹部長(zhǎng)度較工蟻的略長(zhǎng)(圖1: B)，并且pre-NRs的第7腹片長(zhǎng)度明顯變長(zhǎng)，覆蓋于第8和9腹板上，與末齡若蟻的第7腹片形態(tài)非常相似，后緣為圓形，弧度非常明顯。NRs身體深麥黃色，頭頂上有縱的深棕色色素沉積帶；中、后胸背板無(wú)翅或翅芽(圖1: C)。剛變的NRs，腹部細(xì)長(zhǎng)，從腹部前端向尾部逐漸變窄，第7腹板也呈明顯的圓弧狀并覆蓋于第8和9腹板上。4周以后，NRs腹部開(kāi)始明顯膨脹，表明卵母細(xì)胞內(nèi)卵黃積累形成(圖1: D)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，隔離群內(nèi)未發(fā)現(xiàn)有雄性NRs出現(xiàn)。

2.2 工蟻以及工蟻向補(bǔ)充生殖蟻轉(zhuǎn)化過(guò)程中的卵巢發(fā)育

圓唇散白蟻工蟻從3齡(W3), 4齡(W4), 5齡(W5)到老齡工蟻(W6)發(fā)育過(guò)程中，隨著齡期增加卵巢長(zhǎng)度和寬度逐漸增加，每增加一個(gè)齡期，卵巢長(zhǎng)度增加約100 μm；工蟻從3齡發(fā)育到老齡階段卵巢長(zhǎng)度增加了約1倍。雖然相鄰齡期之間卵巢寬度沒(méi)有顯著性差異，卵巢寬度增加不顯著，但是老齡工蟻W6卵巢寬度是W3的約1.5倍，從低齡向老齡發(fā)育過(guò)程中卵巢寬度在逐漸增加。隔離20 d的老齡工蟻與原巢老齡工蟻卵巢長(zhǎng)度和寬度沒(méi)有顯著性差異，但是當(dāng)隔離群中的雌性工蟻經(jīng)過(guò)1次蛻皮轉(zhuǎn)化成pre-NRs之后，卵巢極度變大。pre-NRs卵巢長(zhǎng)度和寬度分別是工蟻的約2倍和3倍，卵巢長(zhǎng)度增加近1 mm，寬度增加約150 μm。pre-NRs經(jīng)過(guò)1次蛻皮轉(zhuǎn)化成補(bǔ)充生殖蟻，NRs的卵巢與pre-NRs的卵巢相比，長(zhǎng)度和寬度都沒(méi)有顯著增加。 NRs膨腹之后，雖然卵巢長(zhǎng)度沒(méi)有顯著增加，但是寬度顯著增加，膨腹補(bǔ)充生殖蟻(physogastric neotenic reproductives, phy-NRs) 卵巢寬度是剛變NRs的約2倍(圖1: E-J; 圖2)。

圖1 圓唇散白蟻雌性工蟻、前補(bǔ)充生殖蟻和補(bǔ)充生殖蟻的形態(tài)Fig. 1 Morphology of the female workers, pre-neotenicreproductives and neotenic reproductivesof Reticulitermes labralisA: 工蟻Workers; B: 前補(bǔ)充生殖蟻Pre-neotenic reproductives; C: 補(bǔ)充生殖蟻身體細(xì)長(zhǎng)，頭部有深色色素條紋(箭頭指示) Neotenic reproductives had the elongated abdomens and their heads had dark brown pigmentation stripes (indicated by the arrow); D: 膨腹補(bǔ)充生殖蟻(箭頭指示)Physogastric neotenic reproductives (indicated by the arrow); E: 3齡工蟻的卵巢Ovary of the 3rd instar workers; F: 老齡工蟻的卵巢Ovary of the late instar workers; G: 隔離20 d工蟻的卵巢Ovary of isolated workers for 20 d; H: 前補(bǔ)充生殖蟻的卵巢Ovary of pre-neotenic reproductives; I: 補(bǔ)充生殖蟻的卵巢Ovary of neotenic reproductives; J: 膨腹補(bǔ)充生殖蟻卵巢有具卵黃的卵母細(xì)胞(箭頭指示)Ovary of physogastric neotenic reproductives had vitellogenic oocytes (indicated by the arrow).

圖2 圓唇散白蟻工蟻各齡期以及工蟻向補(bǔ)充生殖蟻轉(zhuǎn)化過(guò)程中的卵巢發(fā)育Fig. 2 Ovarian development of workers at each instar andduring the differentiation of workers into neotenicreproductives of Reticulitermes labralis圖數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；相同顏色柱子上不同字母表示有顯著性差異(P<0.05, Tukey HSD檢驗(yàn))。Data in the figure are represented as mean±SD, and different letters above bars with the same colour indicate significant differences (P<0.05, Tukey HSD test). W3-6: 分別為3-6齡工蟻3rd-6th instar workers, respectively; IW: 隔離工蟻Isolated workers; pre-NR: 前補(bǔ)充生殖蟻Pre-neotenic reproductives; NR: 補(bǔ)充生殖蟻Neotenic reproductives; phy-NR: 膨腹補(bǔ)充生殖蟻Physogastric neotenic reproductives.

2.3 工蟻向補(bǔ)充生殖蟻轉(zhuǎn)化過(guò)程中卵母細(xì)胞和濾泡細(xì)胞的發(fā)育

隔離20 d的圓唇散白蟻工蟻與原巢工蟻的卵母細(xì)胞和濾泡細(xì)胞發(fā)育水平?jīng)]有顯著性差異，它們的卵母細(xì)胞仍是在生長(zhǎng)期，卵母細(xì)胞長(zhǎng)徑?jīng)]有顯著增加(P>0.05)，濾泡細(xì)胞層比較薄(約1.20 μm)(圖3: A, B)。隔離工蟻轉(zhuǎn)化為pre-NRs之后，pre-NRs的卵母細(xì)胞和濾泡細(xì)胞層的發(fā)育水平仍然沒(méi)有顯著改變，卵母細(xì)胞停滯在生長(zhǎng)期，卵母細(xì)胞長(zhǎng)徑和濾泡細(xì)胞層厚度也沒(méi)有顯著增加(P>0.05)(圖3: C)。Pre-NRs蛻皮轉(zhuǎn)化成NRs之后，卵母細(xì)胞雖然還處于生長(zhǎng)期，但是卵母細(xì)胞長(zhǎng)徑和濾泡細(xì)胞層厚度顯著增加(P<0.05)，濾泡細(xì)胞為柱狀形；NRs卵母細(xì)胞長(zhǎng)徑和濾泡細(xì)胞層厚度分別是Pre-NRs的約2倍和3倍(圖3: D)。雖然末齡若蟻的卵母細(xì)胞也發(fā)育至生長(zhǎng)期，濾泡細(xì)胞層厚度與NRs相比沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)，但是其卵母細(xì)胞長(zhǎng)徑是NRs的約2倍，剛轉(zhuǎn)化的NRs卵母細(xì)胞發(fā)育程度低于末齡若蟻(圖3: F)。隨著NRs卵母細(xì)胞進(jìn)入卵黃期，由于卵黃的積累，卵母細(xì)胞迅速增大，膨腹NRs卵母細(xì)胞長(zhǎng)徑是剛變NRs的約5倍(圖3: E; 圖4)。

圖3 圓唇散白蟻雌性工蟻向補(bǔ)充生殖蟻轉(zhuǎn)化的卵母細(xì)胞發(fā)育Fig. 3 Oocyte development during the differentiation of female workers into neotenic reproductives of Reticulitermes labralisA: 在原巢工蟻中，卵母細(xì)胞被一層薄的濾泡細(xì)胞層包圍In the workers in the parental nest, the oocytes were surrounded by a thin layer of follicle cells; B: 在隔離 20 d工蟻中，卵母細(xì)胞被一層薄的濾泡細(xì)胞層包圍In the workers isolated for 20 d, the oocytes were surrounded by a thin layer of follicle cells; C: 在前補(bǔ)充生殖蟻中，卵母細(xì)胞被一層薄的濾泡細(xì)胞層包圍In the pre-neotenic reproductives, the oocytes were surrounded by a thin layer of follicle cells; D: 在補(bǔ)充生殖蟻中，卵母細(xì)胞被一層厚的濾泡細(xì)胞層包圍In the neotenic reproductives, the oocytes were surrounded by a thicker layer of follicle cells; E: 在膨腹補(bǔ)充生殖蟻中，卵黃發(fā)生末期的卵母細(xì)胞被一層薄的濾泡細(xì)胞層包圍 In the physogastric neotenic reproductives, the oocytes during late vitellogenesis were surrounded by a thin layer of follicle cells; F: 末齡若蟻的卵母細(xì)胞被一層厚的濾泡細(xì)胞層包圍 In the last instar nymphs, each oocyte was surrounded by a thicker layer of follicle cells. FC: 濾泡細(xì)胞層 Layer of follicle cells; Oo: 卵母細(xì)胞 Oocytes; YC: 卵黃Yolk.

圖4 圓唇散白蟻雌性工蟻向補(bǔ)充生殖蟻轉(zhuǎn)化的卵母細(xì)胞大小(A)和濾泡細(xì)胞層厚度(B)變化Fig. 4 Changes in the size of oocytes (A) and the thickness of the layer of follicle cells (B) during the differentiationof female workers into neotenic reproductives of Reticulitermes labralis圖數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；柱上不同字母表示有顯著性差異(P<0.05, Tukey HSD檢驗(yàn))。Data in the figure are represented as mean±SD, and different letters above bars indicate significant differences (P<0.05, Tukey HSD test). W: 工蟻 Workers; IW: 隔離工蟻Isolated workers; pre-NR: 前補(bǔ)充生殖蟻Pre-neotenic reproductives; NR: 補(bǔ)充生殖蟻Neotenic reproductives; phy-NR: 膨腹補(bǔ)充生殖蟻Physogastric neotenic reproductives; Ny: 末齡若蟻Last instar nymphs.

2.4 調(diào)控卵母細(xì)胞生長(zhǎng)期發(fā)育的相關(guān)基因

在我們的圓唇散白蟻雌性末齡若蟻向擬成蟲型補(bǔ)充生殖蟻、翅芽型補(bǔ)充生殖蟻和有翅成蟲轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中(Suetal., 2016)，根據(jù)末齡若蟻與這3種類型的生殖蟻的基因差異表達(dá)分析和卵母細(xì)胞發(fā)育調(diào)控通路篩選出與卵母細(xì)胞生長(zhǎng)期發(fā)育相關(guān)的6個(gè)基因表達(dá)，它們是celldivisioncycleprotein20(Unigene0019375),cyclin-dependentkinase1(Unigene0020991),G2/mitotic-specificcyclin-B3(Unigene0014235),G2/mitotic-specificcyclin-A(Unigene0004987),aurorakinaseA(Unigene0007871)和serine/threonine-proteinkinasepolo(Unigene0000840)。AurorakinaseA(Unigene0007871)的序列與內(nèi)華達(dá)古白蟻Zootermopsisnevadensis的相近，其余5個(gè)基因序列與堆砂白蟻Cryptotermessecundus的相近。這6個(gè)基因在雌性末齡若蟻的表達(dá)水平顯著高于擬成蟲型補(bǔ)充生殖蟻、翅芽型補(bǔ)充生殖蟻和有翅成蟲(原始生殖蟻)的。末齡若蟻的卵母細(xì)胞處于生長(zhǎng)期(即卵子發(fā)生的第2階段), 末齡若蟻經(jīng)過(guò)1次蛻皮分化為擬成蟲型補(bǔ)充生殖蟻、翅芽型補(bǔ)充生殖蟻和有翅成蟲之后,卵母細(xì)胞進(jìn)入卵黃形成期(即卵子發(fā)生的第3階段)。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示這6個(gè)基因在末齡若蟻中高表達(dá)，而在3種類型的生殖蟻中相對(duì)表達(dá)水平比較低(圖5)，表明這些基因與卵母細(xì)胞生長(zhǎng)期的發(fā)育有關(guān)。

圖5 圓唇散白蟻6個(gè)與卵母細(xì)胞生長(zhǎng)期發(fā)育相關(guān)的基因在末齡若蟻和生殖蟻中的差異表達(dá)熱圖Fig. 5 Heat map of the differential expression of six genesinvolved in oocyte development at the growth stage ofthe last instar nymphs and reproductives ofReticulitermes labralisLN: 末齡若蟻Last instar nymphs; AN: 擬成蟲型補(bǔ)充生殖蟻Adultoid neotenic reproductives; BN: 翅芽型補(bǔ)充生殖蟻Brachypterous neotenic reproductives; AR: 有翅生殖蟻Alate reproductives.

2.5 與卵母細(xì)胞生長(zhǎng)期發(fā)育相關(guān)基因在工蟻向補(bǔ)充生殖蟻轉(zhuǎn)化過(guò)程中的表達(dá)

qRT-PCR的測(cè)定數(shù)據(jù)顯示圓唇散白蟻工蟻經(jīng)過(guò)pre-NRs轉(zhuǎn)化為NRs之后，調(diào)控卵母細(xì)胞生長(zhǎng)期發(fā)育的6個(gè)基因在NRs中的表達(dá)水平大幅度增加;雖然有3個(gè)基因表達(dá)水平在pre-NRs中顯著高于在工蟻中的,但是增加幅度比較小。工蟻轉(zhuǎn)化為pre-NRs之后，celldivisioncycleprotein20,cyclin-dependentkinase1和serine/threonine-proteinkinasepolo表達(dá)水平?jīng)]有顯著性增加；pre-NRs轉(zhuǎn)化為NRs之后，表達(dá)水平顯著性增加并且增加幅度很大，這3個(gè)基因在NRs的表達(dá)水平分別是pre-NRs中的約62, 34和106倍。G2/mitotic-specificcyclin-B3,G2/mitotic-specificcyclin-A和aurorakinaseA這3個(gè)基因在pre-NRs表達(dá)水平顯著高于工蟻中的，分別是工蟻的約3, 3和2倍，增加幅度比較??；轉(zhuǎn)化為NRs之后，這3個(gè)基因表達(dá)水平增加幅度很大，在NRs的表達(dá)水平分別是pre-NRs中的91, 36和57倍(圖6)。

圖6 qRT-PCR分析圓唇散白蟻卵母細(xì)胞生長(zhǎng)期發(fā)育相關(guān)基因在工蟻、前補(bǔ)充生殖蟻和補(bǔ)充生殖蟻中的相對(duì)表達(dá)水平Fig. 6 Relative expression levels of genes involved in oocyte development at the growth stage in workers,pre-neotenic reproductives and neotenic reproductives of Reticulitermes labralis detected by qRT-PCRA: cell division cycle protein 20; B: cyclin-dependent kinase 1; C: G2/mitotic-specific cyclin-B3; D: G2/mitotic-specific cyclin-A; E: aurora kinase A; F: serine/threonine-protein kinase polo. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；柱上不同字母表示有顯著性差異(P<0.05, TukeyHSD檢驗(yàn))。Data in the figure are represented as mean±SD, and different letters above bars indicate significant differences (P<0.05, Tukey HSD test). W: 工蟻Workers; pre-NR: 前補(bǔ)充生殖蟻Pre-neotenic reproductives; NR: 補(bǔ)充生殖蟻Neotenic reproductives.

3 討論

我們研究發(fā)現(xiàn)工蟻從低齡到老齡的發(fā)育過(guò)程中卵巢沒(méi)有停止生長(zhǎng)，但是最終工蟻卵巢發(fā)育程度低于末齡若蟻，表明雌性工蟻性腺發(fā)育的停滯發(fā)生在老齡期。研究認(rèn)為蟻后和蟻王利用信息素傳遞它們的生殖地位從而阻止工蟻性腺發(fā)育，只有蟻后和蟻王死亡或繁育能力不足的時(shí)候，工蟻才會(huì)轉(zhuǎn)化成補(bǔ)充生殖蟻開(kāi)始具備生殖能力(Korb, 2018)。蜜蜂工蜂發(fā)育的初期具有正常的卵巢，但在以后的發(fā)育中卵巢細(xì)胞程序化死亡，導(dǎo)致卵巢管數(shù)量從150～200條減少至幾條，而且本質(zhì)上是不育的。蜂后信息素抑制了工蜂卵巢發(fā)育，當(dāng)缺乏蜂后抑制時(shí)，工蜂卵巢發(fā)育被激活(Capella and Hartfelder, 1998; Van Eeckhoven and Duncan, 2020)。山林原白蟻Hodotermopsissjostedi雄性補(bǔ)充生殖蟻的存在會(huì)加速雌性工蟻向補(bǔ)充生殖蟻轉(zhuǎn)化(Oguchietal., 2020)。然而散白蟻的生殖策略比較復(fù)雜, 在棲北散白蟻R.speratus野外巢群中雌性補(bǔ)充生殖蟻的數(shù)量多于雄性補(bǔ)充生殖蟻，可能與雄性工蟻參與生殖有關(guān)(Fujita and Watanabe, 2010)。我們已有的研究也表明雖然圓唇散白蟻R.labralis雄性老齡工蟻精巢的直徑顯著小于生殖蟻精巢直徑, 然而工蟻能夠產(chǎn)生正常的精子(Suetal., 2015)；雄性工蟻能夠與雌性生殖交配并且提供正常的精子，表明雄性工蟻和雌性工蟻在生殖途徑和生殖能力方面是不同的(Suetal., 2017)。雌性兵蟻個(gè)體終生不能生殖是雌性工蟻個(gè)體轉(zhuǎn)化為兵蟻之后失去生殖可塑性的顯著表現(xiàn)，經(jīng)歷2次蛻皮轉(zhuǎn)變成兵蟻之后卵巢極度退化，這種退化是不可逆的。本研究發(fā)現(xiàn)剛轉(zhuǎn)化的補(bǔ)充生殖蟻卵巢長(zhǎng)度是工蟻卵巢長(zhǎng)度的近3倍(圖2)，表明雌性工蟻生殖能力的恢復(fù)需要經(jīng)歷復(fù)雜的過(guò)程和調(diào)控。

卵母細(xì)胞發(fā)育恢復(fù)是生殖能力恢復(fù)的標(biāo)志，我們的研究發(fā)現(xiàn)只有工蟻轉(zhuǎn)化成補(bǔ)充生殖蟻之后，卵母細(xì)胞才能恢復(fù)發(fā)育，并且卵母細(xì)胞發(fā)育啟動(dòng)受濾泡細(xì)胞支持和調(diào)控。散白蟻生殖蟻卵巢管內(nèi)卵子發(fā)生分為3個(gè)時(shí)期：卵母細(xì)胞分化期、卵母細(xì)胞生長(zhǎng)期和卵母細(xì)胞卵黃形成期(朱蓉等, 2009)。雖然圓唇散白蟻工蟻和若蟻一樣都發(fā)育到了卵母細(xì)胞生長(zhǎng)期，但是若蟻卵母細(xì)胞直徑是工蟻的約6倍，工蟻卵母細(xì)胞發(fā)育明顯被抑制(圖4: A)，這種抑制與包圍卵母細(xì)胞的濾泡細(xì)胞退化有關(guān)。當(dāng)工蟻轉(zhuǎn)化成補(bǔ)充生殖蟻之后，濾泡細(xì)胞層厚度會(huì)增加，卵母細(xì)胞變大。通常昆蟲的卵母細(xì)胞移入生長(zhǎng)區(qū)之后大量吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，體積迅速增大；果蠅卵母細(xì)胞在生長(zhǎng)期體積急劇增大是由于從滋養(yǎng)細(xì)胞獲得了細(xì)胞質(zhì)成分(Kolahietal., 2009)。果蠅卵子發(fā)生過(guò)程中濾泡細(xì)胞的屏障功能可以被重塑，濾泡細(xì)胞的形態(tài)和生理發(fā)生動(dòng)態(tài)變化；在卵黃發(fā)生期濾泡細(xì)胞旁通透性發(fā)生改變，打開(kāi)濾泡細(xì)胞旁通道讓卵黃蛋白通過(guò)(Duhartetal., 2017; Isasti-Sanchezetal., 2021)。散白蟻卵母細(xì)胞被卵泡細(xì)胞所包圍(無(wú)滋養(yǎng)細(xì)胞)，其發(fā)育依賴濾泡細(xì)胞支持，顯然工蟻卵母細(xì)胞發(fā)育的停滯和恢復(fù)受濾泡細(xì)胞調(diào)控。我們的研究表明濾泡細(xì)胞發(fā)育啟動(dòng)是非生殖品級(jí)向生殖品級(jí)轉(zhuǎn)化生殖力開(kāi)始恢復(fù)的主要標(biāo)志。

工蟻隔離前和隔離后，卵巢長(zhǎng)度和卵母細(xì)胞發(fā)育水平?jīng)]有顯著性變化，表明隔離工蟻必須經(jīng)過(guò)蛻皮完成品級(jí)形態(tài)的轉(zhuǎn)化才能恢復(fù)生殖能力。白蟻品級(jí)的轉(zhuǎn)化是通過(guò)環(huán)境中的信息素改變個(gè)體內(nèi)激素水平最終誘導(dǎo)基因表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的；保幼激素以及保幼激素通路在低等白蟻品級(jí)非遺傳多型性分化中起關(guān)鍵調(diào)控作用(Korb, 2015; Jongepieretal., 2018)；用保幼激素類似物可以抑制雌性工蟻向生殖蟻分化，低水平保幼激素可以促進(jìn)雌性工蟻向補(bǔ)充生殖蟻分化(Oguchietal., 2020)。近年還發(fā)現(xiàn)失去蟻后信息素抑制，工蟻的磷脂酰肌醇信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、I3K-Akt 信號(hào)通路等信號(hào)通路相關(guān)基因顯著上調(diào)，可能參與調(diào)控雌性工蟻向補(bǔ)充生殖蟻轉(zhuǎn)化的信號(hào)傳導(dǎo)(Yeetal., 2019)。我們的研究證實(shí)去掉蟻后抑制,工蟻的卵巢和卵母細(xì)胞并不能恢復(fù)發(fā)育，而是啟動(dòng)了向補(bǔ)充生殖蟻轉(zhuǎn)化的調(diào)控通路。

我們對(duì)圓唇散白蟻末齡若蟻和末齡若蟻轉(zhuǎn)化的3種類型生殖蟻的比較轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了6個(gè)與卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂前期相關(guān)的基因在末齡若蟻中表達(dá)水平顯著高于剛轉(zhuǎn)化的生殖蟻中的(圖5和6)，這可能是由于末齡若蟻生長(zhǎng)期的卵母細(xì)胞正在啟動(dòng)和進(jìn)行減數(shù)分裂的過(guò)程，而轉(zhuǎn)化初期的生殖蟻卵母細(xì)胞準(zhǔn)備進(jìn)入卵黃積累階段(卵子發(fā)生的最后階段)。已有的研究表明cell division cycle 20(CDC20) 作為細(xì)胞分裂周期蛋白可以激活后期促進(jìn)復(fù)合物/環(huán)小體(anaphase-promoting complex/cyclosome, APC/C)，觸發(fā)細(xì)胞分裂中期到后期的轉(zhuǎn)變，啟動(dòng)姐妹染色單體分離(Jinetal., 2010; Lara-Gonzalezetal., 2019)。cyclin-dependent kinase 1作為細(xì)胞周期蛋白依賴激酶直接參與細(xì)胞周期調(diào)控,激發(fā)細(xì)胞周期各期的順利進(jìn)行(Shi and Feng, 2021)；細(xì)胞周期蛋白 Cyclin 是調(diào)控真核生物細(xì)胞周期有絲分裂及減數(shù)分裂過(guò)程的一個(gè)十分重要的蛋白家族，G2/mitotic-specific cyclin-B3(Cyclin-B3) 是有絲分裂染色體分離啟動(dòng)的一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控因子(Garridoetal., 2020)；G2/mitotic-specific cyclin-A(Cyclin -A)在DNA復(fù)制啟動(dòng)中起作用，也是DNA復(fù)制過(guò)程中核小體組裝所必需的；在果蠅卵巢中調(diào)控生殖干細(xì)胞的發(fā)育和分化(Seimetal., 2003; Liuetal., 2017)。aurora kinase A對(duì)細(xì)胞中心體的成熟、紡錘體組裝和染色體凝集過(guò)程有調(diào)節(jié)作用，是有絲分裂中必需的激酶，在動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟和激活過(guò)程中起著關(guān)鍵性的作用(Doyleetal., 2014; Nguyen and Schindler, 2017)；serine/threonine-protein kinase polo (polo kinase)為polo激酶，與減數(shù)分裂恢復(fù)過(guò)程中的協(xié)調(diào)事件有關(guān)，對(duì)紡錘體形成有著重要的作用；敲除小鼠polo基因?qū)е聹p數(shù)分裂在同源染色體分離之前停止，導(dǎo)致小鼠不能生育(Little and Jordan, 2020)。我們認(rèn)為這些與末齡若蟻卵母細(xì)胞生長(zhǎng)期發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)也可能與工蟻個(gè)體卵母細(xì)胞發(fā)育的抑制和啟動(dòng)有關(guān)系。

我們研究發(fā)現(xiàn)這6個(gè)基因在工蟻和前補(bǔ)充生殖蟻的表達(dá)水平較低，而當(dāng)轉(zhuǎn)化為補(bǔ)充生殖蟻之后全部高表達(dá)，表明卵母細(xì)胞發(fā)育的恢復(fù)和減數(shù)分裂啟動(dòng)從補(bǔ)充生殖蟻開(kāi)始；而在末齡若蟻向生殖蟻轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，卵母細(xì)胞減數(shù)分裂啟動(dòng)從末齡若蟻開(kāi)始。當(dāng)卵母細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)期時(shí)，細(xì)胞核正處于第1次減數(shù)分裂的前期，卵母細(xì)胞合成和積累大量物質(zhì)并進(jìn)行DNA復(fù)制，這個(gè)時(shí)期對(duì)卵母細(xì)胞的成熟、受精和胚胎發(fā)育具有非常重要的意義。celldivisioncycle20表達(dá)水平低的雌性小鼠沒(méi)有或很少生育后代，主要是由于卵母細(xì)胞減數(shù)分裂Ⅰ期染色體分離滯后和染色體錯(cuò)配所致(Jinetal., 2010)；celldivisioncycle20在調(diào)節(jié)果蠅卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中也很重要，突變可導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂中期和后期缺陷(Chuetal., 2001)。cyclin-dependentkinase1可以調(diào)控減數(shù)分裂的恢復(fù)和進(jìn)程(Santamariaetal., 2007; Lietal., 2019)；cyclin-B3作為一種有絲分裂周期蛋白在卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂成熟過(guò)程中起作用;敲除cyclinB3基因的小鼠不育，用青蛙、斑馬魚和果蠅的cyclin B3可以使cyclin B3缺陷小鼠卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂恢復(fù)(Guanetal., 2019; Karasuetal., 2019)；G2/mitotic-specificcyclin-A在日本沼蝦Macrobrachiumnipponense卵巢不同發(fā)育階段的表達(dá)水平與卵巢成熟程度呈正相關(guān)，與卵原細(xì)胞的增殖和卵母細(xì)胞的形成有關(guān)(Zhouetal., 2021)；aurorakinaseA在有絲分裂由G2進(jìn)入M期形成紡錘體后表達(dá)水平增高達(dá)到峰值，在動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟和激活過(guò)程中起著關(guān)鍵性的作用(Dutertreetal., 2002)；serine/threonine-proteinkinasepolo在G2期和M期表達(dá)水平較高，表達(dá)水平低時(shí)會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的阻滯(Little and Jordan, 2020)。工蟻轉(zhuǎn)化的補(bǔ)充生殖蟻與若蟻轉(zhuǎn)化的補(bǔ)充生殖蟻不僅外部形態(tài)有顯著差異，而且卵母細(xì)胞發(fā)育水平不同，若蟻轉(zhuǎn)化的補(bǔ)充生殖蟻可以直接進(jìn)入卵子發(fā)生的最后一個(gè)階段即卵黃形成期，而工蟻轉(zhuǎn)化的補(bǔ)充生殖蟻卵子發(fā)生將恢復(fù)第二階段的發(fā)育即卵母細(xì)胞生長(zhǎng)期。因此，可以推測(cè)若蟻轉(zhuǎn)化的補(bǔ)充生殖蟻比工蟻轉(zhuǎn)化的補(bǔ)充生殖蟻產(chǎn)卵要早。雖然Cyclin-B3,Cyclin-A和aurorakinaseA在前補(bǔ)充生殖蟻的表達(dá)水平顯著高于工蟻中的，但是表達(dá)水平的增高程度與補(bǔ)充生殖蟻中的相比還很低；另外，工蟻蛻皮轉(zhuǎn)化成前補(bǔ)充生殖蟻之后，卵母細(xì)胞和濾泡細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)沒(méi)有顯著改變。因此，這6個(gè)基因在工蟻、前補(bǔ)充生殖蟻和補(bǔ)充生殖蟻表達(dá)水平比較明確了雌性工蟻向補(bǔ)充生殖蟻轉(zhuǎn)化過(guò)程中卵母細(xì)胞發(fā)育的恢復(fù)是從轉(zhuǎn)化為補(bǔ)充生殖蟻開(kāi)始的。