趙一鳴 倪喆鑫 劉新敏

子宮內(nèi)膜異位癥是一種雌激素依賴性疾病，以子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞與腺細(xì)胞在子宮被覆黏膜及子宮肌層以外部位種植生長為特點[1]。雖然子宮內(nèi)膜異位癥是一種良性疾病，但它所導(dǎo)致的盆腔疼痛、月經(jīng)異常、不孕等影響著10%左右的育齡女性，并給全球各個國家造成不小的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。目前，有關(guān)子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病原因，“經(jīng)血逆流”學(xué)說是被最廣泛接受的學(xué)說， 90%的育齡女性存在經(jīng)血逆流，但最終只有10%左右女性發(fā)展為子宮內(nèi)膜異位癥[3]。經(jīng)血逆流的子宮內(nèi)膜組織碎片在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)展過程中可能起著重要作用。正常育齡期女性子宮內(nèi)膜組織會隨著體內(nèi)激素水平變化而呈現(xiàn)周期性更換，而子宮內(nèi)膜組織在生長、脫落過程中伴隨著大量細(xì)胞的增殖、死亡[4]。本研究通過已有數(shù)據(jù)分析，挖掘子宮內(nèi)膜異位癥患者內(nèi)膜組織細(xì)胞死亡途徑和異常表達(dá)基因及其相關(guān)通路，并探討子宮內(nèi)膜異位癥不同分期的潛在生物學(xué)標(biāo)志物，為子宮內(nèi)膜異位癥的診治提供參考。

資料與方法

一、基因芯片選取及差異基因篩選

基因芯片數(shù)據(jù)選取通過美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)進(jìn)行檢索與篩選完成。檢索式為：endometriosis[Title] AND "Homo sapiens"[porgn] AND ("Expression profiling by array"[Filter] AND "attribute name tissue"[Filter])。搜索時間為2021年1月3日。在搜索結(jié)果中兩人背對背逐條閱讀，確認(rèn)入選研究。利用在線R語言分析工具GEO2R進(jìn)行分析，設(shè)調(diào)整后P值(Padj)<0.05的基因為顯著差異基因。

二、差異基因生物學(xué)功能及通路富集分析

將得到的差異基因去重，并刪除無對應(yīng)Gene symbol的基因后，利用生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)對所有差異基因進(jìn)行分析，并利用Functional Annotation Tool進(jìn)行GO(gene ontology)生物學(xué)過程富集分析(取P<0.05為顯著富集)。利用在線氣泡圖工具(http://www.bioinformatics.com.cn/login/)繪制通路富集氣泡圖。

三、子宮內(nèi)膜異位癥不同分期樣本差異基因分析

利用在線韋恩圖工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)，獲取不同分期子宮內(nèi)膜異位癥患者內(nèi)膜組織差異表達(dá)的基因。利用GEO2R獲取差異基因在兩組間表達(dá)的具體情況，并利用String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)獲得相對應(yīng)蛋白關(guān)聯(lián)情況；利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/uniprot/)獲取每個基因的詳細(xì)名稱信息。

四、子宮內(nèi)膜異位癥患者內(nèi)膜組織細(xì)胞死亡相關(guān)基因分析

利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)，獲取鐵死亡(ferroptosis)、凋亡(apoptosis)、自噬(autophagy)、程序性壞死(necroptosis)和焦亡(pyroptosis)這五種細(xì)胞死亡方式相關(guān)基因。通過在線韋恩圖工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)，將篩選出的子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)基因與細(xì)胞死亡相關(guān)基因取交集，觀察子宮內(nèi)膜異位癥患者內(nèi)膜組織細(xì)胞相關(guān)死亡方式。

結(jié) 果

一、樣本間比較與差異基因篩選

本研究共檢索到16篇相關(guān)文獻(xiàn)。通過數(shù)據(jù)篩選后，最終納入研究1項(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE51981)，涉及GEO平臺為GPL570， 登記號為GSE51981。該研究包含微輕度子宮內(nèi)膜異位癥患者內(nèi)膜組織樣本28例(設(shè)為A組)，中重度子宮內(nèi)膜異位癥患者內(nèi)膜組織樣本49例(設(shè)為B組)，正常對照內(nèi)膜組織樣本34例(設(shè)為C組)，樣本間詳細(xì)分布見圖1A。GEO2R分析發(fā)現(xiàn)，A、B組間共有12 410種差異基因ID(Padj<0.05)，A、C組間共有26 695種差異基因ID(Padj<0.05)，B、C組間共有21 230種差異基因ID(Padj<0.05)。C組 vs A組與B 組vs C組交集而不包括A組 vs B組部分，代表子宮內(nèi)膜異位癥患者內(nèi)膜組織樣本與正常對照組相比，共有11 695種基因ID存在顯著差異(Padj<0.05)；而這些差異基因ID很可能就是區(qū)別健康人群與子宮內(nèi)膜異位癥患者的潛在基因譜(圖1B)。

與此同時，本研究利用GEO2R自帶的R limma(plotDensities)分析了樣本相關(guān)基因的表達(dá)密度情況，顯示樣本值分布均一性較好(圖1C)；利用limma(qqt)評估了limma測試結(jié)果的質(zhì)量，所有樣本點組成了近似直線，提示質(zhì)量可(圖1D)；利用hist包繪制調(diào)整后的P值直方圖，提示大部分探針檢測結(jié)果Padj小于0.05，差異基因較多(圖1E)；利用R limma(plotSA, vooma)檢查了表達(dá)式數(shù)據(jù)的均方差關(guān)系，提示整體數(shù)據(jù)變化較小，較為穩(wěn)定(圖1F)；利用R(boxplot)進(jìn)一步分析選定樣本值的分布情況，提示不同組間基因表達(dá)值是被標(biāo)準(zhǔn)化且具有可比性的(圖1G)。

組間火山圖與平均差圖進(jìn)一步可視化差異基因數(shù)量情況(圖2)，提示相比對照組，子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜樣本基因表達(dá)存在顯著異常；微輕度(組A)與中重度(組B)子宮內(nèi)膜異位癥患者內(nèi)膜組織基因表達(dá)存在顯著差異。

二、子宮內(nèi)膜異位癥患者內(nèi)膜組織異常表達(dá)基因富集分析

本研究獲取了子宮內(nèi)膜異位癥與對照組之間11 695種顯著差異基因ID，并剔除了無對應(yīng)Gene symbol以及重復(fù)的基因ID。由于差異基因數(shù)量過多，本研究進(jìn)一步篩選出|log2FC|>2.5的431種具有Gene symbol基因進(jìn)行GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)(圖3)，這些差異基因在RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(GO:0045944)、細(xì)胞增殖(GO:0008283)、細(xì)胞分裂(GO:0051301)、有絲分裂核分裂(GO:0007067)、凋亡過程正調(diào)控(GO:0043065)和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(GO:0035556)等60條生物功能通路上顯著富集(P<0.05)。

(A) UMAP diagram. Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) is a dimension reduction technology used to visualize how samples are related. The figure shows the number of nearest neighbors in the calculation. (B) Venn diagram. It is used to compare the similarities and differences of different gene IDs between different combination groups. (C) The expression density diagram. It is used to view the distribution of the selected sample values. This diagram complements the boxplot that checks the normalization of the data before differential expression analysis (Figure 1G). (D) Moderated t-statistical quantile-quantile (q-q) plot. It plots the quantiles of data samples according to the theoretical quantiles of Student′s t distribution. This chart helps to evaluate the quality of limma test results. (E) The adjusted p-value histogram. It is used to view the distribution of p-values in the analysis. (F) Mean-variance trend chart. It is used to check the mean variance relationship of expression data after fitting the linear model. Each point represents a gene; the red line is an approximation of the mean variance trend; the blue line is a constant variance approximation. (G) Boxplot chart. It is used to view the distribution of selected sample values.圖1 三組樣本分布情況Figure 1 Distribution of three groups of samples

The volcano maps of differential genes between (A) A vs B groups, (B) C vs A groups, and (C) B vs C groups. They are used to show the relationship between statistical significance (-log10p value) and multiple of change (log2FC), which are helpful to show the differentially expressed genes. The mean difference (MD) maps between (D) A vs B groups, (E) C vs A groups, and (F) B vs C groups. They are used to show the comparison of log2FC and average log2 expression value, which are convenient to visualize the differentially expressed genes. The adjusted p value (Padj) with less than 0.05 is considered to have significant difference.圖2 兩組間差異火山圖與平均差圖Figure 2 Difference volcano maps and average difference maps between the two groups

圖3 子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)基因GO富集分析氣泡圖Figure 3 Bubble diagram of GO enrichment analysis of endometriosis related genes

三、微輕度與中重度子宮內(nèi)膜異位癥患者內(nèi)膜組織基因表達(dá)差異分析

在圖1B的基礎(chǔ)上，本研究提取A、B兩組間獨有的717種顯著差異基因ID，剔除了無對應(yīng)Gene symbol以及重復(fù)的基因，獲取了最終14種具有Gene symbol的差異基因(圖4)。本研究進(jìn)一步利用GEO2R工具分析了這些基因在AB兩組患者內(nèi)膜組織中的表達(dá)差異情況，發(fā)現(xiàn)A、B組間差異倍數(shù)顯著(表1)，提示這14種基因表達(dá)情況可能對子宮內(nèi)膜異位癥分期具有潛在作用。

四、子宮內(nèi)膜異位癥患者內(nèi)膜組織細(xì)胞死亡相關(guān)基因分析

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫，本研究獲得了鐵死亡(103)、凋亡(13 206)、自噬(5 786)、程序性壞死(653)和焦亡(110)五種細(xì)胞死亡相關(guān)基因(圖5)。在上文的基礎(chǔ)上，本研究獲取了子宮內(nèi)膜異位癥疾病相關(guān)且具有Gene symbol的1 468個差異基因(|log2FC|>2)。與上述五種細(xì)胞死亡方式相關(guān)基因取交集后發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)基因與凋亡基因交集數(shù)量最多，有1 058個，占子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)基因80.1%，見圖5；交集基因在鐵死亡、凋亡、程序性壞死、自噬及焦亡基因中分別占12.6%(13/103)，8.01%(1 058/13 206)，14.7%(96/653)，10.5%(605/5 786)和8.18%(9/110)。本研究列舉了五大細(xì)胞死亡方式中各自排名前十的與子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)基因，見表2。

圖4 對子宮內(nèi)膜異位癥疾病分期具有潛在作用基因Figure 4 Genes with potential role in the stage of endometriosis

表1 對子宮內(nèi)膜異位癥疾病分期具有潛在作用基因情況表Table 1 Genes with potential effect on the stage of endometriosis

圖5 子宮內(nèi)膜異位癥患者內(nèi)膜組織異常表達(dá)基因與細(xì)胞死亡相關(guān)基因交集情況Figure 5 Intersection of abnormal expression genes and cell death related genes in endometrium of patients with endometriosis

討 論

子宮內(nèi)膜異位癥嚴(yán)重影響婦女及其家庭的生活質(zhì)量，給社會帶來的代價與其他慢性疾病(如2型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)相似[5]。目前，子宮內(nèi)膜異位癥治療主要是由臨床癥狀(不孕癥或盆腔疼痛)決定的，包括外科手術(shù)、激素治療和止痛藥，但這些治療有許多不良反應(yīng)，很少能長期緩解疾病帶來的痛苦[6-7]。可見子宮內(nèi)膜異位癥的治療仍有很長之路要走，而發(fā)掘子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生之前的預(yù)警信號以及進(jìn)展過程中的治療靶點具有巨大潛在經(jīng)濟(jì)價值。本研究從在位子宮內(nèi)膜組織著手，對異常表達(dá)的基因進(jìn)行了分析，并挖掘了部分具有潛在研究價值的異常表達(dá)基因和通路。

表2 子宮內(nèi)膜異位癥與細(xì)胞死亡交集相關(guān)度前10基因列表Table 2 List of top 10 genes of intersection between endometriosis and cell death

表2(續(xù))

目前，廣泛認(rèn)可的子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病學(xué)說是“經(jīng)血逆流”學(xué)說，即子宮內(nèi)膜碎片隨著月經(jīng)血通過輸卵管進(jìn)入盆腹腔，但是90%的輸卵管未阻塞女性存在經(jīng)血逆流，其數(shù)量遠(yuǎn)大于子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病人數(shù)[8]。所以，逆流的子宮內(nèi)膜細(xì)胞本身特性在子宮內(nèi)膜異位癥病灶形成過程中扮演了重要作用，這也是子宮內(nèi)膜異位癥研究的方向之一。而在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生之前，子宮內(nèi)膜細(xì)胞是否已經(jīng)異常值得探討，目前尚缺乏大規(guī)模前瞻性研究驗證，但是不少病例對照研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜細(xì)胞基因表達(dá)存在異常[9-11]。盡管子宮內(nèi)膜瘤和深部浸潤型子宮內(nèi)膜異位癥可以通過成像技術(shù)(超聲或MRI)檢測到，但子宮內(nèi)膜異位癥的最終診斷仍需要通過手術(shù)(最常見為腹腔鏡)和病理檢測來完成[12]。目前，子宮內(nèi)膜異位癥診斷仍然缺乏特異性的分子標(biāo)志物，無法幫助臨床工作人員對子宮內(nèi)膜異位癥進(jìn)行有效無創(chuàng)診斷，從而減少患者因經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及手術(shù)帶來的痛苦[13]。

本研究挖掘了431種|log2FC|>2.5的異常表達(dá)基因，而這些基因在RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分裂、有絲分裂核分裂、凋亡過程正調(diào)控和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等60條生物功能通路上顯著富集。這些結(jié)果提示子宮內(nèi)膜異位癥患者內(nèi)膜組織相比正常內(nèi)膜組織存在異常，而在這些異常表達(dá)基因中很可能存在潛在生物學(xué)標(biāo)志物，可用于疾病的診斷及跟蹤，但是進(jìn)一步的分子驗證需要更加深入和廣泛的實驗研究驗證。

此外，子宮內(nèi)膜異位癥分期主要以美國生育學(xué)會(AFS)和美國生殖醫(yī)學(xué)學(xué)會(ASRM)制定的標(biāo)準(zhǔn)為主[14]，但是癥狀的嚴(yán)重程度與分期系統(tǒng)之間不存在相關(guān)性[15]?？梢?，仍然缺少可用于子宮內(nèi)膜異位癥分期參考的特異性生物標(biāo)志物。此外，本研究發(fā)現(xiàn)微輕度與中重度子宮內(nèi)膜異位癥患者內(nèi)膜組織中IFI6、RNF24、CP等14種基因表達(dá)存在顯著差異。這些差異基因挖掘工作只是一個開始，而在下一步的研究中，將針對這些差異基因開展深入實驗并結(jié)合臨床標(biāo)本加以驗證。

在眾多細(xì)胞死亡途徑中，本研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥與凋亡途徑交集基因最多。細(xì)胞凋亡是一種主動行為，是由基因控制的細(xì)胞自主的有序死亡方式，具有維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用[16]。在子宮內(nèi)膜組織周期性脫落的過程中，必然伴隨著細(xì)胞適應(yīng)性和主動性死亡。但不可忽視交集基因占比較高的程序性壞死和鐵死亡途徑。前者會導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，釋放大量炎癥介質(zhì)，甚至引發(fā)機(jī)體對其產(chǎn)生過度反應(yīng)，造成局部免疫環(huán)境異常[17]；后者可能引起細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物過度堆積，并以波形傳播方式誘發(fā)臨近細(xì)胞相繼功能異常和死亡，產(chǎn)生大量炎癥因子[18]。由此，本研究推測子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜細(xì)胞死亡方式存在異常，但具體哪種死亡方式的異常對疾病影響較大尚待驗證。

綜上所述，本研究利用在線數(shù)據(jù)庫已有測序數(shù)據(jù)，對子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜組織基因表達(dá)情況進(jìn)行了分析。子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜組織基因表達(dá)存在顯著異常，涉及多條異常富集通路。微輕度與中重度子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜組織基因表達(dá)也存在差異。經(jīng)過數(shù)據(jù)交集發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜組織與多種細(xì)胞死亡方式均有交集，而與凋亡交集基因最多。希望這些結(jié)果在子宮內(nèi)膜異位癥的診療過程中能起到一定參考借鑒作用。