張雨虹 鄭一凡 任虹彥 楊強(qiáng) 李淼 榮瑋 郝利國

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 1醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，齊齊哈爾 黑龍江 161000；2病理學(xué)院微形態(tài)中心)

國際癌癥機(jī)構(gòu)發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2018年，全球新發(fā)癌癥病患1 810萬例，死亡人數(shù)960萬，其中肝癌發(fā)病率和死亡率最高且呈逐年上升趨勢，早已成為最致命的惡性腫瘤之一〔1～3〕。免疫治療和靶向治療已成為近年來肝癌治療的重要手段，但其治療的機(jī)制尚不清楚〔4〕。其中，低電離輻射對(duì)免疫功能具有重要意義〔5〕。研究表明低電離輻射對(duì)正常機(jī)體的免疫功能有增強(qiáng)作用，然而低電離輻射對(duì)患瘤機(jī)體的免疫功能影響報(bào)道較少〔6〕。本研究探討低電離輔射對(duì)肝癌模型兔免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 正常家兔15只，4～5個(gè)月齡、體重2～3 kg，雌雄均可，由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，條件為溫度15～25℃，相對(duì)濕度40%～70%，飲用水及飼料均經(jīng)滅菌處理。

1.2藥品與儀器 脫毛劑(硫化鈉)、75%乙醇、20%烏拉坦、安爾碘溶液、0.9%等滲生理鹽水、青霉素、VX-2組織塊(由哈爾濱醫(yī)大學(xué)附屬第四醫(yī)院提供)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(江萊生物：上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司)、酶標(biāo)儀、離心機(jī)、恒溫箱、數(shù)字化彩色超聲診斷儀(飛一諾科技有限公司)、瓦里安直線加速器IX、切片機(jī)、顯微鏡。

1.3分組 將15只家兔采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組(正常家兔)、對(duì)照組(未經(jīng)低電離輻射的肝癌模型兔)和實(shí)驗(yàn)組(經(jīng)低電離輻射的肝癌模型兔)各5只?？瞻捉M不種瘤，不照射；對(duì)照組種瘤，不照射；實(shí)驗(yàn)組種瘤、照射。

1.4建模 (1)VX-2瘤塊稀釋液制備。把已成功在后腿種植荷瘤兔處死在無菌環(huán)境中，取出腫瘤組織，去除壞死組織，用眼科剪剪成組織碎塊10份，加入等量的等滲鹽水混勻，制成瘤塊組織懸液，備用。(2)組織懸液種植。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組家兔于術(shù)前禁食 24 h，禁水8 h，耳緣靜脈注射麻醉(20%烏拉坦，5 ml/kg)，將麻醉的家兔仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，上腹部備皮，安爾碘消毒，使用B超機(jī)高頻探頭找到家兔肝臟位置，將準(zhǔn)備好的組織液在超聲引導(dǎo)下注射。術(shù)后，對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兔注射抗生素，并每天監(jiān)測家兔狀況。(3)照射。實(shí)驗(yàn)組于種植腫瘤15 d后，使用齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院放療科瓦里安直線加速器Ⅸ對(duì)實(shí)驗(yàn)組家兔進(jìn)行單次全身照射，照射劑量為75 mGy〔7,8〕。

1.5檢測項(xiàng)目 (1)家兔血常規(guī)指標(biāo)及血清中IgG、IgM水平檢測:分別于照射前3 h和照射后第4、8天，取家兔外周血2～3 ml，交送齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行檢測。(2)家兔血清中白細(xì)胞介素(IL)-4含量檢測：分別于照射前3 h和照射后第4、8天，取家兔外周血2～3 ml，2 500 r/min離心20 min，取上層血清，用ELISA檢測IL-4水平。(3)巨噬細(xì)胞吞噬功能檢測：于照射后第14天向家兔腹腔注射淀粉溶液，于照射后第15天向家兔腹腔注入2%雞紅細(xì)胞懸液，1 h后取出腹腔液進(jìn)行涂片，采用瑞氏-吉姆薩復(fù)合染液染色，于油鏡下觀察巨噬細(xì)胞吞噬的雞紅細(xì)胞情況。每組載玻片于鏡下選取10個(gè)視野分別計(jì)數(shù)200個(gè)巨噬細(xì)胞及吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)，取平均值計(jì)算其吞噬百分率〔9〕。(4)家兔脾臟指數(shù)測定：于照射后第15天，處死所有家兔，取出3組家兔脾臟，稱重并計(jì)算其脾臟指數(shù)。脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量(g)/家兔體重(kg)。(5)腫瘤組織病理學(xué)觀察：于照射后第15天，處死家兔，取出腫瘤組織后，立即放入10%的甲醛溶液固定，進(jìn)行腫瘤組織石蠟切片制備，經(jīng)水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色后，于鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組家兔腫瘤組織的形態(tài)學(xué)差異。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組接種腫瘤塊3 d后，精神狀態(tài)良好，可以自行進(jìn)食和行走。 接種15 d后，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組體重均減輕且精神狀態(tài)不佳，對(duì)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行低電離輻射。接種20 d后，對(duì)照組精神狀況差，其中一只家兔拒絕進(jìn)食，體重嚴(yán)重減輕，與接種后第24天死亡；實(shí)驗(yàn)組精神狀態(tài)良好，體重開始回升，未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。于接種第30天處死所有家兔后解剖，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組腹腔有惡臭味，大部分肝臟被腫瘤侵襲，腹腔臟器出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，部分組織壞死化膿；實(shí)驗(yàn)組腹腔肝臟被腫瘤侵襲，但未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移?？瞻捉M在實(shí)驗(yàn)過程中狀態(tài)未發(fā)生變化。

2.2B超監(jiān)測 使用B超機(jī)高頻探頭(7～10 MHz)，每3 d對(duì)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組家兔的肝臟移植腫瘤進(jìn)行1次檢測。接種腫瘤7 d后，觀察到對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組家兔肝臟處有高回聲團(tuán)塊，邊界尚清，彩色多普勒血流顯像示腫瘤內(nèi)部呈短棒狀血流信號(hào)，見圖1。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組腫瘤塊長徑變化在接種后第7天〔(9.96±0.50) vs (10.26±0.22)mm〕、第15天〔(17.84±0.48) vs (17.96±0.27)mm〕、第25天〔(32.30±0.64) vs (30.60±0.60)mm〕均無顯著差異(均P>0.05)。

圖1 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組超聲下腫瘤影像及實(shí)驗(yàn)組彩色多普勒腫瘤血流顯像

2.3實(shí)驗(yàn)組家兔低電離輻射前后血常規(guī)指標(biāo)變化 實(shí)驗(yàn)組照射后第4天各項(xiàng)指標(biāo)較照射前明顯下降，照射后第8天各項(xiàng)指標(biāo)較第4天明顯升高(P<0.05)，見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)組照射前后血常規(guī)指標(biāo)變化

2.4各組家兔低電離輻射前后IL-4分泌水平 實(shí)驗(yàn)組照射后第4天IL-4水平較照射前明顯上升(P<0.05)；照射后第8天的IL-4水平較照射后第4天有所下降，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。照射后，對(duì)照組IL-4水平較空白組明顯下降，實(shí)驗(yàn)組IL-4水平較對(duì)照組明顯上升(P<0.05)，見表2。

表2 各組照射前后IL-4分泌水平比較

2.5各組家兔低電離輻射前后IgG、IgM分泌水平 實(shí)驗(yàn)組照射后第4天的IgG、IgM水平較照射前明顯上升(P<0.05)；照射后第8天的IgG、IgM較照射后第4天有所下降，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，照射后，對(duì)照組IgG、IgM水平較空白組下降，實(shí)驗(yàn)組的IgG、IgM較對(duì)照組升高，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 各組照射前后IgG、IgM水平比較

2.6低電離輻射對(duì)3組家兔巨噬細(xì)胞吞噬功能、脾臟指數(shù)的影響 鏡下觀察到細(xì)胞核呈紫紅色，胞質(zhì)呈淺紅色，可見被吞噬的雞紅細(xì)胞，見圖2。對(duì)照組巨噬細(xì)胞吞噬百分率〔(67.69±2.00)%〕較空白組〔(79.55±1.38)%〕明顯下降，實(shí)驗(yàn)組巨噬細(xì)胞吞噬百分率〔(75.26±1.55)%〕較對(duì)照組明顯升高(均P<0.05)。對(duì)照組脾臟指數(shù)〔(0.44±0.02)g/kg〕較空白組〔(0.84±0.03)g/kg〕明顯下降，實(shí)驗(yàn)組脾臟指數(shù)〔(0.76±0.02)g/kg〕較對(duì)照組明顯升高(均P<0.05)。

圖2 實(shí)驗(yàn)組巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞(蘇木素-伊紅染色，油鏡，×1 000)

2.7病理學(xué)檢查結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組可見灰白色腫瘤、伴灶性出血壞死、周邊包膜完整。種植瘤呈類圓形或橢圓形、血供豐富、質(zhì)地較硬，切開后可見液化性壞死。病理組織學(xué)切片檢查，鏡下可見大量纖維組織增生，炎細(xì)胞浸潤，假小葉之間血管擴(kuò)張充血。瘤細(xì)胞排列紊亂，呈條索或團(tuán)塊狀，其間可見血竇，瘤細(xì)胞大小不等，形狀不規(guī)則，胞質(zhì)富含嗜酸性，細(xì)胞核大深染，異質(zhì)性高，多見瘤巨細(xì)胞及病理性核分裂，見圖3。高倍鏡下轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)見大量癌細(xì)胞巢，癌細(xì)胞體積大，核大深染，淋巴結(jié)的正常結(jié)構(gòu)被完全破壞。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組家兔腫瘤組織的大體標(biāo)本與鏡下切片觀察并無顯著差異(P>0.05)。

(×100)

(×400)

3 討 論

研究表明，低電離輻射抑瘤效應(yīng)不是通過對(duì)腫瘤直接殺傷，而是通過自身調(diào)節(jié)、提高機(jī)體免疫力的方式實(shí)現(xiàn)的〔10，11〕。低電離輻射的興奮效應(yīng)和適應(yīng)性反應(yīng)已經(jīng)被廣泛證實(shí)。低電離輻射可使一些細(xì)胞因子分泌、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)，免疫細(xì)胞的相互作用提高，進(jìn)而提升機(jī)體的免疫功能〔12〕。本研究主要通過檢測低電離輻射后肝癌模型兔的免疫學(xué)指標(biāo)來研究其免疫功能變化。因腫瘤形態(tài)發(fā)生變化需要一定的時(shí)間，且病灶大小會(huì)因炎癥、水腫、壞死等因素有所改變，不能準(zhǔn)確反映腫瘤大小。故超聲檢測并未顯示顯著性差異。各組腫瘤病理學(xué)觀察并無顯著性差異，可能是因其移植瘤來源相同，且對(duì)于中晚期大負(fù)荷腫瘤，單用免疫治療難以奏效，應(yīng)將其視為輔助療法配合手術(shù)。

低電離輻射誘導(dǎo)不同細(xì)胞因子的釋放可增強(qiáng)或抑制機(jī)體的免疫功能，同時(shí)也可促使初始T細(xì)胞向輔助型T細(xì)胞轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)Th1免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)門h2免疫反應(yīng)〔13，14〕。本研究結(jié)果顯示，輻射后實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組IL-4水平有所升高，其機(jī)制可能在于低電離輻射活化免疫細(xì)胞促進(jìn)其細(xì)胞因子的分泌與調(diào)節(jié)。IL-4主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，且具有廣泛的生物學(xué)活性，可以增強(qiáng)特異性和非特異性細(xì)胞的殺傷功能。其在機(jī)體免疫應(yīng)答中發(fā)揮的作用是復(fù)雜的，IL-4可調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞的平衡，參與體液免疫；也能通過上調(diào)干擾素(IFN)-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達(dá)參與細(xì)胞免疫〔15〕。且研究發(fā)現(xiàn)IL-4可通過阻滯細(xì)胞周期來阻礙癌細(xì)胞的生長〔16〕。故低電離輻射或可通過上調(diào)IL-4分泌水平，來達(dá)到抑瘤效應(yīng)。B細(xì)胞通過產(chǎn)生免疫球蛋白來發(fā)揮其在體液免疫中的作用，IgG、IgM 均為機(jī)體免疫功能評(píng)價(jià)的常用指標(biāo)〔17〕。關(guān)于低電離輻射對(duì)體液免疫的研究較少，目前認(rèn)為，低電離輻射可作為一種特殊的弱抗原，反復(fù)刺激B細(xì)胞的多克隆活化和誘導(dǎo)免疫球蛋白的形成，使機(jī)體體液免疫功能增強(qiáng)〔12〕。機(jī)體接受低電離輻射刺激后，可產(chǎn)生大量具有高親和力的IgG、IgM抗體〔18〕。本研究結(jié)果說明低電離輻射可提升患瘤機(jī)體免疫球蛋白水平。

低劑量電離輻射對(duì)機(jī)體的作用是復(fù)雜多變的，既有免疫興奮效應(yīng)同時(shí)也伴隨著有害效應(yīng)〔19〕。實(shí)驗(yàn)組家兔照射后第八天的免疫球蛋白、IL-4分泌水平相較于第四天，并無明顯差異，可能是因?yàn)殡婋x輻射在抑制免疫抑制的同時(shí)損傷了機(jī)體的T細(xì)胞，具體原因尚不清楚。對(duì)照組呈下降趨勢，可能是腫瘤導(dǎo)致T細(xì)胞亞群發(fā)生改變而使免疫功能處于抑制狀態(tài)〔20〕。

機(jī)體受到輻射后，可引起細(xì)胞水平甚至是器官水平的變化，而造血系統(tǒng)是最敏感的靶器官之一。有文獻(xiàn)報(bào)道，機(jī)體血液系統(tǒng)在短時(shí)期受到低電離輻射后會(huì)逐漸恢復(fù)，其機(jī)制可能在于低電離輻射對(duì)機(jī)體的生物學(xué)效應(yīng)，持續(xù)時(shí)間較短〔21，22〕。如何在運(yùn)用低電離輻射免疫興奮效益的基礎(chǔ)上最大程度地避免有害效應(yīng)，仍是一個(gè)值得長期探討的問題。

巨噬細(xì)胞在非特異性免疫中起重要作用，參與機(jī)體抗感染、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等過程〔23〕。低電離輻射可直接增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的反應(yīng)性，也可促進(jìn)淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌，從而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能〔24〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可證實(shí)低電離輻射對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的促進(jìn)作用。脾臟是外周免疫器官，為各種成熟淋巴細(xì)胞聚集和發(fā)生免疫反應(yīng)的場所，一定程度上可反映機(jī)體的免疫功能〔25～28〕。低電離輻射可促進(jìn)胸腺細(xì)胞和脾細(xì)胞多種蛋白的表達(dá)量升高，還可促進(jìn)其分泌多種細(xì)胞因子，參與免疫調(diào)節(jié)〔18〕；其對(duì)提高機(jī)體免疫功能可表現(xiàn)為細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)改變，如作用于胸腺、脾臟后，其增殖特性發(fā)生適應(yīng)性變化，細(xì)胞周期縮短，增殖加快〔29〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示低電離輻射促進(jìn)脾臟淋巴細(xì)胞與脾細(xì)胞的增殖分化。

綜上，低電離輻射對(duì)免疫系統(tǒng)的影響主要表現(xiàn)為免疫活性細(xì)胞數(shù)量及其細(xì)胞因子的分泌水平、免疫球蛋白的分泌水平、抗體形成能力和細(xì)胞因子調(diào)節(jié)等一系列細(xì)胞及分子水平變化，最終導(dǎo)致機(jī)體免疫功能改變，并且對(duì)機(jī)體免疫功能有正向調(diào)節(jié)作用。