任吉蓮 崔靈芝 郝小夏 李曉顏 常彥祥

(1山西醫(yī)科大學汾陽學院醫(yī)學檢驗系，山西 汾陽 032200；2山西省腫瘤醫(yī)院干部診療科；3山西省汾陽醫(yī)院檢驗科；4西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院)

非小細胞肺癌(NSCLC)是全世界癌癥死亡的主要原因之一，每年約有超過100萬人因NSCLC死亡〔1〕。在最近的幾十年中，由于診斷、手術和聯(lián)合治療等方法的改進，NSCLC患者的生存率有了顯著提高。由于NSCLC有極高的復發(fā)率和轉移率，5年生存率僅為15%〔2〕。因此深入研究NSCLC發(fā)生發(fā)展的分子機制，確定新的治療靶點,對于改善NSCLC患者的治療現(xiàn)狀具有重要意義。

微小RNA(miRNA)由18～25個核苷酸組成，是一類內源性核糖調節(jié)因子，可通過RNA干擾途徑調節(jié)基因表達〔3〕。研究報道人類miRNA在細胞增殖、凋亡和分化中發(fā)揮生理作用〔4〕。某些miRNA可能是癌癥診斷和預后的標志物〔5〕。研究表明miR-488在多種腫瘤中表達異常，可作為抑癌基因〔6,7〕。研究表明miR-488通過真核起始因子(eIF)3a介導的NER信號通路抑制NSCLC細胞的增殖和順鉑敏感性〔8〕。但miR-488對NSCLC的具體作用機制仍不清楚。本文旨在探究miR-488對NSCLC A549干樣特性和裸鼠移植瘤生長的影響。

1 材料和方法

1.1實驗動物 10只Balb/c裸鼠購自北京維通利華維通利華動物科技有限公司，雄性，5周齡，體重(20±2)g，許可證號：SCXK(京)2015-0001，在特定的無病原體條件下飼養(yǎng)。

1.2試驗試劑 DMEM培養(yǎng)基(12100-046)、青-鏈霉素(15140-122)、胎牛血清(26400-036)、胰蛋白酶(15050-057)和F12培養(yǎng)基(21700-075)購自美國Gibco公司；LipoRNAiTM轉染試劑(C0535)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(P0012)、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(C1062M)、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(C1091)購自上海碧云天生物技術研究所；anti CD44(ab157107)、干細胞轉錄因子(SOX)2(ab97959)、八聚體結合因子(OCT)4(ab18976)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3(ab13847)、Caspase-9(ab52298)購自美國Abcam公司。

1.3細胞培養(yǎng) 人支氣管上皮細胞BEAS-2B、人腺癌細胞PC-9、人肺黏液上皮樣癌細胞H292，人非NSCLC細胞A549來源于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，將細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h更換新鮮培養(yǎng)基，1∶2傳代。選用對數(shù)生長期細胞為實驗細胞。

1.4細胞處理及分組 按照1×105個/孔的密度將細胞接種于6孔板內，待60%融合度時更換為無血清培養(yǎng)基。采用LipoRNAiTM轉染試劑將mimic-NC和miR-488 mimic組轉染至A549細胞，將細胞隨機分為3組：Control組、mimic-NC組和miR-488 mimic組。

1.5RT-PCR 用Trizol法從BEAS-2B細胞、PC-9細胞、H292細胞和A549細胞中提取總RNA，用Nanodrop 分光廣度計測定吸光度(A260/A280)，按照試劑盒說明書進行cDNA的合成和PCR的擴增，PCR擴增的條件為：94℃ 2 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)，最后72℃延長10 min。于凝膠成像系統(tǒng)中檢測表達情況。

1.6成球實驗 將各組細胞經流式細胞儀計數(shù)后鋪至超低黏附96孔板。每孔100 μl F12成球培養(yǎng)基，含10個活細胞，各鋪10個復孔。靜置培養(yǎng)14 d后倒置顯微鏡下觀察細胞成球率及細胞成球直徑。細胞成球率=每孔細胞成球球數(shù)目總數(shù)/每孔細胞數(shù)×100%。

1.7流式細胞儀檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的各組A549細胞，接種于5孔板中，用流式細胞儀按Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行檢測，計算各組A549細胞細胞凋亡率。

1.8Western印跡 取各組待測細胞，加含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，用BCA試劑盒提取總蛋白并測定蛋白質含量。提取等量的蛋白質樣品，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白，轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，加入相應的一抗(CD44、SOX2、OCT4、Caspase-3、Caspase-9)，4℃過夜孵育后用磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)清洗并加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的Ⅱ抗室溫孵育1 h。加入電化學發(fā)光(ECL)試劑曝光顯影，凝膠成像系統(tǒng)分析膠片灰度值并計算相對表達量。以GAPDH為上樣量參照，重復3個獨立的實驗。

1.9裸鼠移植瘤模型的建立 參照鄭興等〔9〕方法，取對數(shù)期生長的Control組、miR-488 mimic組細胞用胰蛋白酶消化后調整為細胞濃度為5×105個/ml，取100 μl細胞懸液接種于BALB/c裸鼠右腋窩，建立實體腫瘤模型。2 w后通過頸椎脫位法處死裸鼠，取腫瘤組織稱重。

1.10免疫組化 取各組裸鼠腫瘤組織石蠟切片，按照試劑盒說明書進行免疫組化染色，采用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒顯色，蘇木素復燃，鹽酸酒精分色，在光學顯微鏡下觀察CD44的表達情況，隨機選取5個不同視野，計算陽性表達率。陽性表達率=陽性細胞/細胞總數(shù)×100%。重復3個獨立的實驗。

1.11TUNEL染色 取各組裸鼠腫瘤組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，將切片用蛋白酶K消化，按TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行染色。細胞核內出現(xiàn)深棕色顆粒為陽性細胞，采用光學顯微鏡觀察并拍照，隨機選取5個不同視野，計算細胞凋亡率。

1.12統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、秩和檢驗。

2 結 果

2.1miR-488在BEAS-2B、PC-9、H292、A549細胞中表達水平 與BEAS-2B細胞miR-488水平(1.02±0.03)比較，PC-9、H292、A549細胞均顯著降低(0.53±0.01，0.47±0.02，0.26±0.03，P<0.05)，且A549細胞miR-488表達最低，因此本實驗選擇A549細胞進行后續(xù)實驗。

2.2miR-488表達水平 與Control組和mimic-NC組(1.00±0.00，1.03±0.05)相比，miR-488 mimic組miR-488 mRNA水平顯著升高(58.00±9.00，P<0.05)。

2.3轉染miR-488 mimic降低A549細胞成球直徑、成球率 與Control組和mimic-NC組相比，miR-488 mimic組細胞成球直徑、成球率顯著降低(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 細胞成球實驗

表1 轉染miR-488 mimic對A549細胞成球直徑、成球率的影響

2.4轉染miR-488 mimic下調A549細胞CD44、SOX2、OCT4蛋白表達水平 與Control組和mimic-NC組相比，miR-488 mimic組CD44、SOX2、OCT4蛋白水平均顯著降低(P<0.05)。見圖2,表2。

圖2 Western印跡檢測CD44、SOX2、OCT4蛋白表達

表2 轉染miR-488 mimic對A549細胞CD44、SOX2、OCT4蛋白表達水平的影響

2.5轉染miR-488 mimic促進A549細胞凋亡 與Control組和mimic-NC組細胞凋亡率〔(5.0±2.5)%、(4.8±2.2)%〕相比，miR-488 mimic組升高，差異有統(tǒng)計學意義〔(27.8±3.0)%，P<0.05〕。見圖3。

圖3 流式細胞儀檢測細胞凋亡

2.6轉染miR-488 mimic上調Caspase-3、Caspase-9蛋白表達水平 與Control組和mimic-NC組相比，miR-488 mimic組Caspase-3、Caspase-9蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見圖4，表3。

圖4 Western印跡檢測Caspase-3、Caspase-9蛋白表達

表3 轉染miR-488 mimic對A549細胞Caspase-3、Caspase-9蛋白表達水平的影響

2.7轉染miR-488 mimic對肺癌裸鼠移植瘤模型的影響 與Control組相比，miR-488 mimic組腫瘤重量、CD44陽性表達率顯著降低，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖5，表4。

圖5 轉染miR-488 mimic對肺癌裸鼠移植瘤模型CD44陽性陽性表達率和腫瘤細胞凋亡的影響(免疫組化，×200)

表4 轉染miR-488 mimic對肺癌裸鼠移植瘤模型的影響

3 討 論

NSCLC是一種常見的惡性腫瘤，嚴重威脅著人們的健康和生命。尋找能早期診斷NSCLC的生物學標志物具有重要意義。miRNA是由19～25個核苷酸組成的非編碼小分子單鏈RNA。miRNA通過細胞內復雜的信號網絡，不僅參與調控細胞的多種生命活動，還在腫瘤細胞增殖、耐藥等許多重要的生物學過程中發(fā)揮調控作用。miRNA的表達與多種腫瘤的預后相關，可作為腫瘤的標志物〔10〕。

腫瘤干細胞是存在于腫瘤組織中具有自我更新能力的細胞，其可分化成不同家族的腫瘤細胞構成整個腫瘤〔11〕。腫瘤細胞獲得干細胞表型后具有較強的成球能力，并分化成其他類型的腫瘤細胞，腫瘤干細胞表型的獲得是惡性腫瘤重要的生物學特性，也是腫瘤復發(fā)的重要因素之一〔12〕。研究表明NSCLC的發(fā)生發(fā)展、復發(fā)轉移、抗輻射及耐藥性等惡性表型特征都與NSCLC干細胞相關〔13〕。肺癌干細胞凋亡能力低于普通的肺癌細胞〔14〕。CD44、SOX2與OCT4作為NSCLC干細胞標志物，在維持干細胞多能性方面起著重要作用，其參與腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲、轉移、耐藥、復發(fā)等過程〔15〕。劉罡等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)miR-34a靶向調節(jié)CD44抑制NSCLC干細胞成球和侵襲能力。項保利等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)轉錄因子OCT4和SOX2在NSCLC病灶內表達度高。本研究結果提示轉染miR-488 mimic抑制A549細胞干樣特性。

凋亡是細胞的程序化死亡，使生物體在其正常發(fā)育的過程中殺死和去除不需要的細胞，細胞凋亡紊亂是癌癥發(fā)生發(fā)展的關鍵〔18〕。Caspase在細胞凋亡的啟動和執(zhí)行中起關鍵作用，Caspase-9是凋亡級聯(lián)反應的啟動子，也是線粒體凋亡途徑的關鍵蛋白酶，Caspase-3是凋亡的主要執(zhí)行者，酶切Caspase-9可進一步激活Caspase-3，Caspase-3可通過破壞細胞的完整性和裂解核酸酶使細胞凋亡〔19〕。Wei等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)miR-488通過靶向高遷移率族核小體結構域(HMGN)5促進RCC細胞凋亡。Jin等〔20〕研究發(fā)現(xiàn)miR-448靶向Rab2B上調Caspase-3、Caspase-9表達誘導PANC-1細胞凋亡。本研究結果提示轉染miR-488 mimic促進A549細胞凋亡，抑制裸鼠移植瘤生長。

綜上，miR-488抑制A549細胞干樣特性，促進凋亡，抑制NSCLC裸鼠移植瘤的生長，提示miR-488可成為潛在的NSCLC基因治療靶點。