陶雨佳，李蕾，任宗梁，盧城，宮青濤，邢興華，江海東*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部作物生理生態(tài)與生產(chǎn)管理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京210095；2.江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 徐州,221131）

干旱脅迫是重要的非生物脅迫因子，不但影響植物的生長(zhǎng)代謝，而且嚴(yán)重時(shí)能導(dǎo)致作物產(chǎn)量下降50%[1,2]。大豆作為重要的油料作物，其生長(zhǎng)需水量高，根系不發(fā)達(dá)，受干旱影響極為明顯，對(duì)產(chǎn)量與品質(zhì)都造成了嚴(yán)重?fù)p害[3]。因此，提高大豆抗旱性，對(duì)降低干旱造成的產(chǎn)量損失具有重要意義。

干旱脅迫會(huì)加速活性氧（ROS）的生成引起“氧化爆發(fā)”，導(dǎo)致蛋白質(zhì)、DNA、脂質(zhì)和其它細(xì)胞組分的損傷，從而影響正常的細(xì)胞功能，造成代謝功能障礙以致植物死亡[4]。一般認(rèn)為ROS 只是有毒的有氧代謝副產(chǎn)物，可以通過酶和非酶系統(tǒng)的共同作用清除[5,6]。而越來越多的研究表明，ROS 作為重要的信號(hào)分子參與植物生長(zhǎng)、發(fā)育，響應(yīng)非生物和生物應(yīng)激刺激，以及程序性細(xì)胞死亡等過程[7～9]。ROS 是否會(huì)起到破壞、保護(hù)或信號(hào)傳導(dǎo)的作用取決于ROS的產(chǎn)生和清除在適當(dāng)?shù)奈恢煤蜁r(shí)間之間的微妙平衡[10]。與其他活性氧相比H2O2穩(wěn)定性最高，因此作為信號(hào)分子研究最多[11～14]。但是近年來對(duì)大豆抗旱性的研究中多采用中度或重度干旱處理，或雖然進(jìn)行了抗性鍛煉，也只是研究作物對(duì)中重度干旱脅迫響應(yīng)及其機(jī)理。在這種情況下，H2O2的信號(hào)作用與毒害作用混合在一起，不能清楚地闡明H2O2信號(hào)的作用機(jī)制。逆境條件下會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)細(xì)胞和組織功能的紊亂。在這樣的生存條件下，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)是極其重要的[15]。在實(shí)驗(yàn)室前期研究中發(fā)現(xiàn)弱干旱下抗旱大豆品種科豐1號(hào)的大豆葉片中會(huì)積累H2O2，并持續(xù)一段時(shí)間，而在敏感品種南農(nóng)99-6 中則不積累，這暗示著科豐1 號(hào)在弱干旱下形成了一種提高抗旱性的H2O2穩(wěn)態(tài)[16,17]。因此模擬自然界中干旱發(fā)生進(jìn)程，研究前期弱干旱下H2O2的含量變化對(duì)大豆干旱脅迫的調(diào)控作用，有助于我們深入了解H2O2在植物應(yīng)對(duì)逆境的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的作用，并進(jìn)而通過調(diào)節(jié)氧化還原水平來提高大豆抗旱性，為大豆抗旱栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試大豆（Glycine mɑx）品種為科豐1 號(hào)，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家大豆改良中心提供。

1.2 方法

在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)牌樓試驗(yàn)基地正常土培供試大豆長(zhǎng)至三葉期，將大豆幼苗洗脫傷害后在26℃（12 h 光照/12 h 黑暗）光照培養(yǎng)箱中用Hoagland 營養(yǎng)液水培緩苗3 d。再通過聚乙二醇（PEG-6000）模擬干旱脅迫處理。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)0.5%和5%PEG 溶液對(duì)科豐1 號(hào)分別造成弱、強(qiáng)干旱脅迫，因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)置4 個(gè)處理，3 次重復(fù)，分別為：（1）CK：Hoagland 營養(yǎng)液正常水培；（2）弱-強(qiáng)脅迫（WS）處理：0.5%PEG 溶液培養(yǎng)1 d 后轉(zhuǎn)入5%PEG 溶液培養(yǎng)；（3）強(qiáng)脅迫（S）處理：正常水培1 d后轉(zhuǎn)入5%PEG溶液培養(yǎng)；（4）弱脅迫（W）處理：0.5%PEG 溶液培養(yǎng)2 d。用Hoagland 營養(yǎng)液分別配制濃度為0.5%和5%的PEG-6000 處理液。處理共2 d，各處理分別于處理后第0、3、12、24和48 h取樣。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 葉片相對(duì)含水量測(cè)定 葉片相對(duì)含水量=[（鮮質(zhì)量-干質(zhì)量）/（飽和質(zhì)量-干質(zhì)量）]×100%[18]。

1.3.2 生理生化指標(biāo)測(cè)定 丙二醛（MDA）含量測(cè)定采用趙世杰等[19]的改進(jìn)方法；過氧化氫（H2O2）含量測(cè)定采用試劑盒（南京建成生物工程研究所提供）；超氧陰離子自由基（O2-）產(chǎn)生速率測(cè)定方法采用羥胺法[20]；SOD 活性測(cè)定采用NBT 法[21]；POD 活性采用愈創(chuàng)木酚法[21]；CAT 活性測(cè)定采用紫外吸收法[21]；抗壞血酸過氧化物酶（APX）和谷胱甘肽還原酶（GR）粗酶提取液及測(cè)定參照施海濤[22]的方法；單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）和脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）提取和測(cè)定參考Krivosheeva 等[23]的方法；谷胱甘肽過氧化物酶活性（GPX）活性測(cè)定參考Barbara 等[24]的方法；抗壞血酸（ASA）及還原型谷胱甘肽（GSH）的含量參照Renu 等[25]及Wang 等[26]的方法。

1. 4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用3 次重復(fù)的平均值，采用Excel 2019 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用SPSS 17.0 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，運(yùn)用Sigmaplot 12.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同干旱處理對(duì)大豆葉片形態(tài)的影響

如圖1 所示，正常培養(yǎng)下，大豆葉片呈正常狀態(tài)。24 h 時(shí)的W 處理（圖1C）中大豆葉片相較于CK處理，葉片邊緣略微發(fā)黃，未造成顯著傷害。48 h時(shí)的W 和WS 處理（圖1D 和E）中的大豆葉片出現(xiàn)明顯卷曲，失綠現(xiàn)象，兩處理受干旱脅迫傷害程度無明顯差異。此時(shí)，48 h 時(shí)的S 處理（圖1F）中大豆葉片顯著卷曲，失綠嚴(yán)重，干旱脅迫傷害程度顯著高于W和WS處理。

圖1 不同干旱處理下大豆葉片形態(tài)Fig.1 Soybean leaf morphology under 4 drought treatments

2.2 不同干旱處理對(duì)大豆葉片相對(duì)含水量的影響

如圖2 所示，弱干旱脅迫（0.5%PEG 溶液）處理3 h 內(nèi)，大豆葉片相對(duì)含水量對(duì)比CK 顯著降低（P＜0.05，下同），之后又迅速回升，24 h時(shí)略高于CK，差異不顯著。強(qiáng)干旱脅迫（5%PEG 溶液）處理后，隨著干旱時(shí)間的持續(xù)，WS 處理中的葉片相對(duì)含水量進(jìn)一步降低顯著低于CK，但要高于S和W處理。

圖2 不同干旱處理下大豆葉片相對(duì)含水量Fig.2 Relative water content in soybean leaves under 4 drought treatments

2.3 不同干旱處理對(duì)大豆葉片抗氧化系統(tǒng)的影響

2.3.1 對(duì)葉片MDA 含量的影響 如圖3 所示，弱干旱脅迫處理3 h 內(nèi)，大豆葉片中MDA 含量迅速降低，顯著低于CK，雖然之后開始上升但在24 h 時(shí)仍低于CK。WS處理中1 d強(qiáng)干旱脅迫處理后MDA 含量雖然相對(duì)CK顯著上升，但W和S處理均大幅度升高，48 h時(shí)MDA含量顯著高于WS處理。

圖3 不同干旱處理下大豆葉片MDA含量Fig.3 MDA content in soybean leaves under 4 drought treatments

2.3.2 對(duì)葉片活性氧水平的影響 如圖4A 所示，正常培養(yǎng)下，大豆葉片中O2-產(chǎn)生速率沒有發(fā)生明顯波動(dòng)。弱干旱脅迫處理后，相較于CK 輕微促進(jìn)了葉片中O2-的產(chǎn)生速率。WS處理中強(qiáng)干旱脅迫處理后，葉片中O2-的產(chǎn)生速率繼續(xù)平緩上升。S 和W 處理中葉片中O2-的產(chǎn)生速率迅速增加，48 h時(shí)顯著高于WS處理。

如圖4B 中所示，正常培養(yǎng)下，大豆葉片中H2O2含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。弱干旱脅迫處理3 h內(nèi)，大豆葉片中的H2O2含量迅速上升并在3 h時(shí)達(dá)到峰值，隨后開始下降但含量明顯高于CK。WS 處理中強(qiáng)干旱脅迫處理后H2O2含量再次增加但與CK差異不顯著。此時(shí)W 和S 處理中H2O2含量呈急劇上升的趨勢(shì)，48 h時(shí)含量顯著高于WS處理。

圖4 不同干旱處理下大豆葉片O2-產(chǎn)生速率及H2O2含量Fig.4 O2-production rate and H2O2 content in soybean leaves under 4 drought treatments

2.3.3 對(duì)葉片SOD、POD 和CAT 活性的影響 如圖5A所示，弱干旱脅迫處理后，對(duì)比CK促進(jìn)了大豆葉片中SOD 酶活性大幅度增加。強(qiáng)干旱脅迫處理后，隨著干旱程度的加深，WS 處理中的SOD 活性繼續(xù)平緩上升。此時(shí)S 和W 處理葉片中SOD 活性雖然對(duì)比CK明顯增加，但48 h時(shí)顯著低于WS處理。

圖5 不同干旱處理下大豆葉片SOD、POD和CAT活性Fig.5 SOD，POD and CAT activities in soybean leaves under 4 drought treatments

如圖5B 所示，正常培養(yǎng)下，大豆葉片中的POD活性維持在一定水平。弱干旱脅迫處理后，大豆葉片中的POD 活性略有升高。強(qiáng)干旱脅迫處理后，WS 處理中的POD 活性迅速上升，與CK 差異極顯著。雖然S 和W 處理中POD 活性均有增加，但在48 h時(shí)低于WS處理。

如圖5C 所示，弱干旱脅迫處理后，大豆葉片中的CAT 活性急劇升高后又迅速降低。強(qiáng)干旱脅迫處理后，WS 處理對(duì)比CK 葉片中CAT 活性再次大幅度增加，此時(shí)S處理中CAT活性迅速降低，W 處理中CAT 活性 略微增加，48 h 時(shí)WS 處理中CAT 活性高于S和W處理，差異極顯著。

2.3.4 對(duì)葉片抗壞血酸和谷胱甘肽含量的影響如圖6A 所示，正常培養(yǎng)下，大豆葉片中的AsA 含量沒有明顯變化。弱干旱脅迫處理后，促進(jìn)了大豆葉片中AsA含量的顯著增加。強(qiáng)干旱脅迫處理后，WS處理中AsA 含量大幅度提高，與CK 差異顯著。隨著處理時(shí)間的持續(xù)，S 和W 處理也有不同程度的增加，但增加幅度均低于WS處理。

如圖6B 所示，正常培養(yǎng)下，大豆葉片中的GSH含量無明顯波動(dòng)。弱干旱脅迫時(shí)促進(jìn)了大豆葉片中GSH 含量的顯著升高。強(qiáng)干旱脅迫處理后，WS處理中GSH 含量上升幅度不大，但W 和S 處理都快速上升，48 h時(shí)GSH含量顯著高于WS處理。

圖6 不同干旱處理下大豆葉片AsA和GSH含量Fig.6 AsA and GSH contents in soybean leaves under 4 drought treatments

2.3.5 對(duì)大豆葉片APX 和GPX 活性的影響 如圖7A 所示，正常培養(yǎng)下，大豆葉片中的APX 活性呈上升趨勢(shì)。整個(gè)處理中隨脅迫程度的加深，WS 處理中APX 活性對(duì)比CK 持續(xù)性增加。后期處理中，S和W 處理中的APX 活性雖然也升高了但顯著低于WS處理。

如圖7B 所示，正常培養(yǎng)下，大豆葉片中的GPX活性呈先上升后下降的趨勢(shì)。弱干旱脅迫處理后，大豆葉片中的GPX 活性迅速上升后下降，強(qiáng)干旱脅迫處理后，WS 處理相對(duì)于CK 再次大幅度增加且極顯著高于S和W處理。

圖7 不同干旱處理下大豆葉片APX和GPX活性Fig.7 APX and GPX activities in soybean leaves under 4 drought treatments

2.3.6 對(duì)大豆葉片MDHAR、DHAR 和GR 活性的影響 如圖8A 所示，弱干旱脅迫處理后，大豆葉片中MDHAR 活性相對(duì)于CK 迅速增加，隨后開始降低。在強(qiáng)干旱脅迫處理后，WS、S 和W 處理中MDHAR 活性都快速上升與CK 產(chǎn)生顯著差異，在48 h時(shí)WS處理中MDHAR活性略高于S和W處理。

如圖8B 所示，弱干旱脅迫處理后，顯著提高了大豆葉片中DHAR 活性并維持一段時(shí)間后再開始降低。強(qiáng)干旱脅迫處理后，WS 處理中的DHAR 活性再次升高，與CK差異極顯著。此時(shí)S和W處理都有不同程度的降低，但均略高于CK 而顯著低于WS處理。

如圖8C 所示，弱干旱脅迫處理后，相較于CK，大豆葉片中GR 活性顯著上升并持續(xù)了一段時(shí)間。強(qiáng)干旱脅迫處理后，WS 處理中GR 活性再次大幅度升高，對(duì)比CK 差異極顯著。此時(shí)S 和W 處理中GR活性雖有增加但顯著低于WS處理。

圖8 不同干旱處理下大豆葉片MDHAR、DHAR和GR活性Fig.8 Activities of MDHAR，DHAR and GR in soybean leaves under 4 drought treatments

3 討論與結(jié)論

作物會(huì)隨著干旱時(shí)間和程度的加深產(chǎn)生越來越多的活性氧，活性氧的積累會(huì)導(dǎo)致膜脂過氧化，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，影響作物正常生長(zhǎng)與發(fā)育等[27]。在惡劣環(huán)境條件下維持水分狀況是保證植物正常生長(zhǎng)的普遍現(xiàn)象，相對(duì)含水量是植物最重要的干旱脅迫指標(biāo)，可作為耐旱性的指標(biāo)[28]。在本研究中，大豆幼苗在強(qiáng)干旱（S）處理24 h 后，O2-產(chǎn)生速率和H2O2含量增加，活性氧水平升高，導(dǎo)致MDA含量升高，細(xì)胞受到傷害，相對(duì)含水量下降，葉片顯著卷曲失綠。而在弱干旱（W 和WS）處理24 h 后，O2-產(chǎn)生速率、H2O2含量、MDA 含量和葉片萎蔫程度都低于S 處理，表明受傷害程度與脅迫強(qiáng)度成正比，這與前人結(jié)果一致[29]。但是與CK 處理相比，O2-產(chǎn)生速率、H2O2含量雖顯著高于CK，MDA 含量卻顯著低于CK，相對(duì)含水量略高于CK，但差異不顯著，表明此時(shí)植株未受傷害或傷害較小。而隨著時(shí)間的延續(xù)，W 處理在48h 出現(xiàn)較大傷害，但葉片卷曲失綠程度仍低于S處理，而WS處理在強(qiáng)脅迫下傷害程度與W處理差別不大，遠(yuǎn)低于S處理。

活性氧的傷害水平除了與氧化損傷標(biāo)記（脂質(zhì)過氧化）做比較，還必須與抗氧化劑標(biāo)記（即抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)）相結(jié)合，才能較好地衡量氧化脅迫[30]?？寡趸冈诳刂芌OS過度積累和維持細(xì)胞氧化還原平衡方面起著重要作用[31]，Noctor 等認(rèn)為稱之為“ROS 處理酶”或者“ROS 相關(guān)酶”更為準(zhǔn)確[32]。抗壞血酸是豐富而穩(wěn)定的抗氧化劑，具有適當(dāng)?shù)难趸€原電位，并維持一個(gè)普遍的還原狀態(tài)，通過整合代謝信息和環(huán)境刺激來調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的反應(yīng)[33]，是氧化還原中樞的關(guān)鍵角色，在氧化還原穩(wěn)態(tài)和信號(hào)傳導(dǎo)中也發(fā)揮重要作用[34]。在本試驗(yàn)WS處理中，弱干旱脅迫3 h 時(shí)出現(xiàn)H2O2峰值，增加幅度持續(xù)至12 h，基本保持穩(wěn)定（20%左右）。與此相應(yīng)，此時(shí)間段內(nèi)MDA 含量低于CK，抗氧化酶（SOD、POD、CAT、APX、GPX）酶活性、AsA 含量、DHAR 和GR 酶活性相對(duì)CK 處理保持增長(zhǎng)，且增加幅度變化較小。非酶類和酶類H2O2清除劑調(diào)節(jié)了H2O2水平[35]，兩者共同作用下與H2O2形成了一種緩沖體系，形成并維持了H2O2穩(wěn)態(tài)，起著信號(hào)作用，使得強(qiáng)干旱處理24 h 后，WS 處理植株中各種抗氧化酶活性顯著高于S 處理，O2-產(chǎn)生速率、H2O2含量和MDA 含量顯著低于S處理，明顯提高了植株相對(duì)含水量，說明WS處理增強(qiáng)了大豆的抗旱性。

但H2O2穩(wěn)態(tài)的持續(xù)有其時(shí)效性。在本實(shí)驗(yàn)中，弱干旱脅迫24 h 時(shí)，H2O2含量增幅減小，雖然SOD、POD、APX 活性和AsA 以及GSH 含量仍高于CK，但此時(shí)部分酶活性如CAT、MDHAR、DHAR、GR 和GPX 活性開始降低，均低于CK，說明在相同脅迫強(qiáng)度下H2O2穩(wěn)態(tài)不能長(zhǎng)時(shí)間保持，其信號(hào)作用會(huì)逐步減弱并消失。因此比較W處理在24h和48 h時(shí)的抗氧化系統(tǒng)可以發(fā)現(xiàn)，48 h 時(shí)SOD、CAT、APX、GR 酶活性和GSH 含量無明顯增加，POD 酶活性和AsA 含量小幅度上升，GPX 和DHAR 酶活性逐漸下降，表明抗氧化能力下降，氧化傷害增加。而WS 處理表現(xiàn)優(yōu)于W 處理，說明新的外界刺激會(huì)進(jìn)一步加強(qiáng)H2O2穩(wěn)態(tài)。

綜上所述，在弱干旱脅迫條件下內(nèi)源H2O2產(chǎn)生積累，并與抗氧化劑形成緩沖體系，在抗氧化酶的共同作用下形成持續(xù)的穩(wěn)態(tài)，從而形成信號(hào)提高強(qiáng)干旱下大豆的抗氧化能力，增強(qiáng)了大豆的抗旱性。但這種信號(hào)作用具有時(shí)效性，在沒有新的外界刺激的情況下會(huì)逐漸減弱。