劉穎，張佳蕾，李新國，張正，萬書波

（山東省農業(yè)科學院農作物種質資源研究所/山東省作物遺傳改良與生態(tài)生理重點實驗室/農業(yè)農村部華東地區(qū)作物栽培科學觀測實驗站，山東 濟南，250100）

氮素是限制作物生長和產量形成的重要元素，目前農作物高產所需氮源主要來自工業(yè)氮肥，其過量施用一直是我國農業(yè)發(fā)展中的突出問題[1，2]。與工業(yè)固氮相比，豆科根瘤菌共生固氮體系是農作物獲取氮素最有效、最經濟的途徑，共生固氮體系作為農業(yè)生態(tài)系統重要的氮素輸入途徑，不僅為作物提供清潔、高效的氮素營養(yǎng)，還改良了土壤結構、提升了土壤肥力[3，4]。因此，研究豆科作物氮素高效利用機理，對降低農業(yè)生產成本，促進農業(yè)可持續(xù)發(fā)展、保護生態(tài)環(huán)境具有重要意義[5]。

雖然豆科作物高效的生物固氮能力對減少氮肥投入、提高產量做出了重要貢獻，但外源氮素與結瘤固氮拮抗作用一直是研究難點，特別是高濃度氮對結瘤和根瘤固氮的抑制作用[6，7]。當土壤有效氮含量較高時，豆科植物固氮量受抑制，導致“氮阻遏”的出現，即在土壤有效氮含量較高時，固氮酶活性受抑制的情況[8]。目前，豆科作物如何感知環(huán)境中氮素濃度的變化，進而做出精細調控的機制尚不清楚。因此，揭示外源氮對根瘤固氮的調控機制，解析根瘤固氮與外源氮的協同效應，對發(fā)揮生物固氮潛力具有重要意義。本文總結了豆科作物共生固氮體系的建立、豆科植物-根瘤菌對外源氮的響應、微生物和根瘤菌共生效率的關系，系統闡述了豆科作物氮素高效利用的機理，擬為豆科作物高產高效提供一定的理論依據。

1 共生固氮體系的建立

豆科植物-根瘤菌共生固氮是目前效率最高的生物固氮方式，固氮量占生物固氮總量的一半以上，多年研究測定大豆、菜豆等豆科植物年固氮量為每公頃50～300 kg，三葉草、苜?？蛇_100～500 kg[9]。共生固氮是非常復雜且精細調控的過程，自1990 年起，已鑒定了近200 個基因參與共生固氮的調控，包括根瘤菌誘導信號通路的激活和根瘤原基形成所需轉錄因子的表達過程，以及特殊的根瘤結構的形成[10，11]。與此同時，根毛卷曲將根瘤菌包裹在里面，沿著侵染線被釋放到宿主細胞，內化的細菌被宿主植物生物膜包裹成細胞，形成類菌體。固氮作用主要發(fā)生在成熟根瘤的類菌體中，由固氮酶將N2轉化為NH4+[12]。多數豆科植物能通過這個結瘤機制形成具有固氮能力的根瘤，然而固氮植物在生態(tài)系統中所占的比例很小，固氮作用也受各種因素的影響[13，14]。一般來說，豆科作物根瘤固氮對氮素積累的貢獻率僅占40%～60%，外源氮的供應對根瘤數量、形態(tài)建成以及固氮能力也有較大的影響[15]。

2 豆科植物-根瘤菌對外源氮的響應

豆科植物-根瘤菌共生固氮無法滿足豆科高產栽培對氮素的需求，加入外源氮非常必要，但肥料氮的過量加入會對根瘤固氮產生強烈的抑制，即“氮阻遏”現象，高濃度外源氮對根瘤固氮的抑制作用是制約氮素高效利用的重要原因[16]。目前在豆科植物氮素的需求定量方面還缺乏研究，同時也包括最為關鍵的能引發(fā)根瘤菌“氮阻遏”效應的氮素閾值研究，導致現在的施肥技術難以精準吻合豆科植物對氮素的需求，因此，合理施用氮肥成為影響豆科植物發(fā)揮固氮功能的一個關鍵因素。

2.1 氮肥施用量對根瘤固氮的影響

一般認為作物合理施氮量為最高產量施氮量[17]，但豆科植物施氮特點和要求與其它非豆科作物不同，其高產施氮量不一定有利于高效固氮，由于結瘤植物的根瘤固氮是消耗能量的過程，當大量氮素進入土壤時，固氮植物會轉向耗能較小的方式，即吸收土壤有效氮[18，19]。王樹起等[20]等發(fā)現隨施氮量的漸進式增加，根瘤干重及數量均呈先增加后降低的趨勢，可見，較低水平施氮會促進豆科植物自身的固氮能力，且達到最大固氮效率，超過這個臨界則產生抑制作用。如石海等[21]等在大豆上的研究結果表明，54 mg·kg-1為促進根瘤形成和發(fā)揮最佳固氮功能的臨界氮水平。截至目前，我國豆科作物大多以最高產量施氮達到的水平作為目標產量，這樣造成氮肥損失略大。因此，準確判斷豆科作物經濟最佳施氮量及合理的施肥手段是提高豆科作物固氮能力的關鍵。目前判斷臨界氮水平的方式一般為植物體內的各種生理生化指標，例如根系形態(tài)相關指標、氮代謝關鍵酶活性、葉綠素含量和光合參數、固氮特性等影響氮素利用的活躍因素。其中，豆科植物固氮特性無疑是更嚴謹可靠的指標，固氮能力強也意味有較高的固氮效率。此外，15N示蹤技術可將外源氮與其它來源的氮區(qū)分開，能更準確地研究豆科植物體內不同的氮素來源與分配，使得植物固氮特性成為研究氮素利用率的關鍵指標。

圖1 根瘤菌-豆科植物共生體系的建立Fig.1 The establishment of symbiosis system of legume plant-Rhizobium

2.2 氮素形態(tài)對根瘤固氮的影響

氮素有多種化合態(tài)形式，不同形態(tài)氮素對豆科植物共生固氮體系結瘤固氮影響并不一致。以往研究表明[22]銨態(tài)氮在根毛變形前抑制結瘤，硝態(tài)氮則在根毛變形后至皮層細胞分裂前起抑制作用。與銨態(tài)氮相比，硝態(tài)氮對豆科植物結瘤的抑制作用更強，表現為銨態(tài)氮培養(yǎng)的植物的根瘤生長及固氮酶活性明顯高于硝態(tài)氮培養(yǎng)[23～25]。但Yamashita等[26]研究表明，1 mmol·L-1硝態(tài)氮、銨態(tài)氮對大豆根瘤生長和固氮活性的抑制作用相當。多數學者認為硝態(tài)氮對結瘤性狀及固氮酶活性的抑制作用高于銨態(tài)氮，說明不同氮素形態(tài)對豆科作物根瘤形成生物抑制存在多種作用機制，氮素濃度可在一定程度上影響兩者的抑制效果。

2.3 氮肥施用時期對根瘤固氮的影響

豆科作物不同生育期對氮素的響應具有特異性，喬云發(fā)等[27]認為生育前期施氮可抑制根瘤固氮，生育后期追施氮肥則減輕抑制作用。鄭永美等[28]研究則發(fā)現前期施用少量氮肥可提高根瘤固氮能力。在低氮條件下，根瘤主要吸收外源氮，這樣避免了根瘤發(fā)育與宿主植物競爭氮素，達到了促進根瘤發(fā)育的目的。但在豆科作物生長初期，正處于根瘤形成和發(fā)育階段，過低的土壤氮水平影響植株生長，進而影響結瘤過程和固氮能力[29]。董守坤等人[30]研究也表明，根瘤生長需要一定量的“啟動氮”，且氮濃度為50 mg·L-1時利于根瘤生長，在高于50 mg·L-1受到明顯抑制。生育中期以直接吸收根瘤固氮為主，較高濃度的外源氮對根瘤固氮產生抑制作用，生育后期，特別是生殖器官形成期，由于肥料氮的流失及根瘤的衰老，根瘤氮和土壤氮的供應不能滿足花生的生長需求，及時補充氮肥不僅可以緩解根瘤衰老，還促進干物質向莢果轉化[31]。因此，氮肥按需施用、精準投入是解決豆科植物氮素營養(yǎng)的關鍵。

3 根際微生物與根瘤菌共生效率的關系

豆科植物-根瘤菌共生是植物-微生物共生的一種重要類型，根瘤菌通過改變土壤微環(huán)境間接影響豆科作物的生長，同樣，豆科植物根際存在的特定微生物群落也影響根瘤菌的結瘤及共生固氮效率。以大豆為例，根際微生物群落主要以中華根瘤菌和慢生根瘤菌組成，加上土壤中細菌、真菌等微生物，共同組成了復雜的群落[32]。Pérez-Jaramillo等[33]對菜豆核心根際微生物群研究也發(fā)現，菜豆核心微生物群由61 個變形桿菌組成，其中根瘤菌屬為最豐富的菌，其次為慢生根瘤菌、伯克霍爾德菌、新生根瘤菌和鞘氨醇單胞菌。對天然土壤進行核心微生物群分析發(fā)現，變形桿菌、酸桿菌、疣狀菌、擬桿菌、放線菌和氯曲菌是最豐富的門。在變形桿菌屬中，拉爾斯通菌是最豐富的屬，其次才是伯克霍爾德菌和根瘤菌。土壤中存在數十億種的微生物，根瘤菌可與其宿主豆科植物的根際微生物競爭以建立共生關系，而且與天然土壤相比豆科植物選擇性地從土壤中富集與養(yǎng)分循環(huán)有關的根瘤菌，其根系分泌物的類型及總量均影響了微生物群落結構[34]。另外，研究發(fā)現一些根際微生物與根瘤中的慢生根瘤菌和中華根瘤菌的組成有關，一種根際細菌-芽孢桿菌可顯著影響根瘤菌的結瘤與固氮，Han 等[35]進一步研究發(fā)現，蠟狀芽孢桿菌特異性促進和抑制根瘤菌的生長，并緩解了鹽堿條件對中華根瘤菌結瘤的影響。因此，根際微生物群落在大豆根瘤菌-宿主相互作用中起關鍵作用，并為通過使用合成細菌群落提高這種共生體系的共生效率提供了框架，有益微生物和根瘤菌的聯合使用可有效促進豆科植物的結瘤共生，為以后合成細菌群落提高大豆-根瘤菌共生固氮效率提供了科學依據。

微生物間合作與競爭可能有利于豆科植物-根瘤菌的結瘤，根瘤菌與豆科植物建立共生關系的前提是選擇性識別、侵染，而侵染取決于根瘤菌與微生物的競爭力，還受不穩(wěn)定環(huán)境因素的影響。正如Mason 等[36]發(fā)現大豆快生和慢生根瘤菌在不同pH值土壤中生長的結瘤率有很大的差異。Zahran[37]也認為酸性土壤不利于豆科植物的生長，特別是土壤pH＜5 時，植物的結瘤效率大大降低，這與Wood等[38]研究結果基本一致。另外，長期大量氮肥輸入可能引起土壤酸化，固氮菌處于酸性環(huán)境會導致固氮酶水解過程的發(fā)色團發(fā)生變化，影響固氮反應的正常運行。Fan 等研究表明[39]，長期施肥可以通過降低與氮素固定效率呈正相關的關鍵物種和系統聚類固氮微生物的相對豐度，從而間接降低氮素固定效率。目前普遍認為，長期施肥增加了微生物總量、加劇微生物間的競爭，此時通過耗能的方式固氮不利于固氮菌的存活，根瘤菌的豐度隨之降低，進而降低共生固氮量。

4 豆科氮素高效利用的機制研究

4.1 生理機制

氮素高效利用主要取決于氮素吸收、運輸和利用能力，其中吸收利用效率起決定性的作用，而根系的發(fā)育能力和活性直接影響植物對氮素的吸收利用[40]。魏海燕等[41]研究表明，與低氮效率水稻品種相比，高氮效率水稻的根系發(fā)育能力更強，在玉米的研究中也發(fā)現根干重和根表面積存在差異是影響氮效率的原因[42]。以上研究均說明根系形態(tài)參數是評價植株氮效率主要的篩選指標，可見從根系角度研究氮效率差異，可在一定程度上為揭示氮高效機理提供依據。

植物吸收的氮肥需進一步同化成谷氨酸、谷氨酰胺等有機氮才能被植物利用，而豆科植物根瘤固氮中的固氮酶可將N2還原為氨，直接被植物吸收利用[43]。固氮酶活性是衡量豆科作物固氮效率的重要指標，與根瘤數、鮮重、根瘤固氮量、供氮比例、豆血紅蛋白含量呈正相關，增強根瘤菌侵染能力和根瘤生理活性，可顯著提高固氮酶活性[44]。另外，外源NO3--N 只有通過硝酸還原酶（NR）的催化還原為亞硝酸，由亞硝酸還原為氨才能被植物利用。NR 是植物NO3--N同化的關鍵酶，在植物氮代謝起著重要作用，氮高效品種對NO3--N 的同化能力相對較強[45]。

植物吸收同化NH4+-N的途徑有兩種：谷氨酰胺合成酶（GS）-谷氨酸合成酶（GOGAT）途徑和谷氨酸脫氫酶（GDH）途徑。GS、GOGAT 和GDH 是NH4+-N同化的關鍵酶，谷氨酰胺合成酶與氮效率間關系密切，呈顯著正相關關系[46]。由此可見，氮素高效吸收利用各環(huán)節(jié)緊密相連，提高根系對氮素的吸收能力、向收獲器官運輸能力以及地上部分對氮素的利用能力是提高氮肥利用率的重要措施。

4.2 分子機制

4.2.1 結瘤自主調控（AON）控制結瘤 豆科植物適當的結瘤數目能保證氮素的高效利用，根瘤數目過多將會額外消耗能量，對植物正常的生長發(fā)育造成不利影響，根瘤數目過少則不能維持生物固氮的需求，因此，豆科植物形成了一套系統性調控根瘤數量的負反饋調節(jié)機制，稱為結瘤自我調節(jié)（AON），主要通過地上-地下長距離信號傳導[47]。其基本過程如下：首先是激活過程，根毛接收結瘤因

子（NF）即被激活；其次地上-地下傳遞系統，根部產生信號分子被運至地上部，被地上部的類受體激酶識別后合成新的信號分子再運送至地下部，其中一類富含亮氨酸的類受體激酶CLE 家族識別接受來自根部信號分子（即RS），CLE-RS 通過木質部轉運至地上部，地上部識別后產生一種對于結瘤具有抑制作用的信號（SDI）運輸到根部，從而實現對根瘤數目的控制[48]。以往的研究表明[49]，AON 途徑涉及的基因如果發(fā)生突變，會出現超結瘤的表型，表現為過度固氮，消耗掉大量的光合產物，對自身生長發(fā)育產生消極影響。最新研究表明[50]，GmNINamiR172c-NNC1 分子模塊是結瘤與AON 信號通路的主要開關，動態(tài)精細控制大豆的最佳結瘤數。這種自調節(jié)的機制在結瘤過程中達到豆科植物能承受的閾值時開啟，保證了結瘤過程順利進行，為豆科作物共生固氮和氮素營養(yǎng)高效利用提供重要的保障。

4.2.2 NIN-like proteins（NLPs）轉錄因子介導硝酸鹽抑制結瘤 NIN（nodule inception）是共生和結瘤啟動必需的轉錄因子NIN 的同源蛋白NLP（NINlike protein）在調節(jié)硝酸鹽抑制結瘤共生的過程中有一定作用。在擬南芥基因組中發(fā)現了9個NLP基因[51]，作為響應硝酸鹽信號的核心轉錄因子，NLP7在感受到硝酸鹽后可從細胞質穿梭到細胞核，調控硝酸鹽信號相關基因的表達。Lin等人[52]還發(fā)現，蒺藜苜蓿中的5 個NLP基因可與NIN 蛋白相互作用，與擬南芥的NLP7一樣，NLP1也能響應硝酸鹽信號，從細胞質進入細胞核，通過PB1 結構域與NIN 形成復合體，并抑制NIN 影響下游因子CRE1，NF-YA1等的激活，最終抑制根瘤的形成及固氮?？梢奛LP1感受硝酸鹽信號之后，通過干擾NIN 的功能來抑制共生。此外，Nishida 等[53]在百脈根中也發(fā)現了NRSYM1（LjNLP4）不僅參與硝酸鹽抑制共生固氮過程，還參與抑制侵染線形成及根瘤發(fā)育。以上說明除了AON 途徑以外，豆科作物還通過其它途徑控制共生固氮過程，其中的分子機制還需要進一步探索。

5 氮素高效利用調控途徑

關于豆科作物氮素高效利用的研究，前人已開展了大量工作，對生產技術起到了很大指導作用，而對于不同生育期氮肥精準投入，充分發(fā)揮根瘤菌的固氮效應和外源氮的協同效應，全生育期提高氮肥利用率則研究甚少。提高豆科作物氮素利用率是合理施肥實踐中的長期任務，因此，確定豆科植物適宜目標產量，應以經濟最佳施氮量所得產量為參考，既能充分發(fā)揮作物固氮潛力，又盡量保持在最為關鍵的能引發(fā)根瘤菌“氮阻遏”效應的氮素閾值之下，如果目標產量過高，反而會造成減產，導致高投入低產出；如果目標產量過低，則不能發(fā)揮土壤、品種的產量潛力。其次，選用氮高效品種，依據不同基因型豆科作物對不同氮源的吸收利用特點及差異，選用根瘤固氮能力較高的氮高效品種。另外，確定合適的施氮時期及施氮量也很重要，應根據豆科作物不同生育期對氮素需求的特異性，明確生育前期能充分發(fā)揮根瘤固氮效應和促進植株生長的“起爆氮”最佳質量、生育中期導致“氮阻遏”效應的氮素閾值、補充固氮不足的最少氮素用量以及生育后期延緩植株衰老改善葉片生理機能并能提高莢果飽滿度的“后援氮”最優(yōu)用量。針對不同生育時期外源氮對根瘤固氮的影響，實現氮肥按需施用、最大發(fā)揮自生固氮潛能，可突破豆科作物氮肥高效利用理論研究瓶頸，對解決豆科作物氮肥減施增效的重大關鍵科技問題具有重要意義。