王健春，郭 宇，薩茹拉，高登軍，劉占喜，曹際娟，葛忠源，李雷斌，孫 雨

（1.天津市動物疫病預防控制中心，天津 300000；2.內蒙古自治區(qū)動物疫病預防控制中心，內蒙古呼和浩特 010010；3.大連民族大學，遼寧大連 116600；4.中聯(lián)瑞（北京）生物科技有限責任公司，北京 102600；5.廣西大學動物科學技術學院，廣西南寧 530004；6.中國動物疫病預防控制中心，北京 102600）

山羊痘和綿羊痘統(tǒng)稱羊痘，分別由山羊痘病毒（goatpox virus，GPV）和綿羊痘病毒（sheeppox virus，SPV）引起。GPV 和SPV 均屬于痘病毒科（Poxviridae）脊椎動物痘病毒亞科（Chordopoxvirinae）山羊痘病毒屬（Capripoxvirus，CaPV）[1-2]。我國在新修訂的《一、二、三類動物疫病病種名錄》中將其列為二類動物疫病，世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）將其列入須通報動物疫病名錄。感染動物表現(xiàn)為發(fā)熱，皮膚、黏膜、器官表面廣泛性丘疹或結節(jié)，皮膚水腫，淋巴結腫大，消瘦，產乳量大幅度降低，嚴重時死亡。羊痘給養(yǎng)殖業(yè)帶來較大危害，嚴重阻礙國際貿易開展。山羊痘最早于公元前200 年在歐洲被發(fā)現(xiàn)，綿羊痘最早于13 世紀在英國被發(fā)現(xiàn)。羊痘是動物痘病中最為嚴重的一種，一般發(fā)病率為50%～80%，病死率20%～80%，其中對羔羊的致死率可達100%[2]。世界各地均有羊痘發(fā)病和流行的相關報道，目前在中東地區(qū)流行較為嚴重[1]。羊痘可通過節(jié)肢動物機械性接觸傳播，蚊子、蒼蠅和蜱等均可能是疫情跨地域遠距離擴散的“幫兇”，這無疑加大了羊痘的防治難度[3-4]。

P32 抗原是CaPV 的特有結構蛋白，由痘病毒的H3L同源基因所編碼，是位于病毒膜表面的一種主要結構蛋白。P32 蛋白的相對分子質量約為32 ku，位于CaPV 基因組的64～65 kb 處，由第74號ORF 編碼，具有多個抗原決定簇和B 細胞抗原表位[5]。動物感染CaPV 后，在感染早期先產生針對P32 蛋白的中和抗體，然后才產生針對其他結構蛋白的抗體。P32 蛋白是所有CaPV 分離株共有的，特異性高、免疫原性強的結構蛋白[4-6]。為獲得在Sf9 細胞中高效表達的P32 蛋白，本研究將編碼CaPV P32 抗原的核苷酸序列優(yōu)化為適合在Sf9細胞中表達的偏好密碼子，去除氨基酸序列跨膜區(qū)，利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)，成功表達純化、制備出了重組CaPV P32 蛋白，并建立了檢測CaPV 抗體的間接ELISA（Indirect-ELISA，I-ELISA）方法。

1 材料和方法

1.1 主要材料

Sf9 昆蟲細胞、DH10Bac 感受態(tài)大腸桿菌、CaPV-P32 pFastBacHTA 質粒，由中國動物疫病預防控制中心保存。

1.2 主要試劑

SF900 II SFM 昆蟲細胞培養(yǎng)基、Cellfectin?II Reagen 轉染試劑，購自美國Thermo Fisher 公司；2×PCR mix buffer、質粒提取試劑盒、DNA Marker、Plasmid Mini Kit，購自天根生化科技（北京）有限公司；慶大霉素、氨芐青霉素、X-gal、四環(huán)素、IPTG、6×His mAb、家兔抗山羊IgGHRP，購自北京索萊寶科技有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒、鎳瓊脂糖凝膠，購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 轉染質粒設計與構建

利用SignalIP、TMHMM 跨膜區(qū)預測系統(tǒng)、GeneBank、DNAMan 和GenScript 等分子生物學軟件，分析并預測了經典CaPV（Genbank 登錄號AFH08294.1）P32 的跨膜區(qū)序列、疏水區(qū)序列和稀有密碼子。優(yōu)化稀有密碼子為Sf9 細胞偏好的真核表達密碼子，并合成P32 蛋白編碼基因核苷酸序列；將合成的核苷酸序列轉至pFastBacHTA 重組載體中，構建CaPV-P32-pFastBacHTA 重組質粒；使用DNAMan 軟件設計P32 蛋白編碼基因擴增引物CaPV-P32-F 和CaPV-P32-R（表1），由生工生物工程股份有限公司合成。

表1 P32 蛋白編碼基因引物與M13 通用引物序列信息

1.4 重組質粒PCR 擴增與鑒定

分別使用合成的CaPV-P32-F/CaPV-P32-R為上下游引物，以重組構建的質粒CaPV-P32-pFastBacHTA 為模板進行PCR 擴增，對擴增產物進行測序。

1.5 重組穿梭質粒構建與藍白斑篩選

使用LB 平板培養(yǎng)基（50 μg/mL 卡那霉素、10 μg/mL 四環(huán)素，7 μg/mL 慶大霉素、40 mg/L IPTG、100 mg/L X-GAL）。提取重組質粒CaPVP32-pFastBacHTA 并轉化至DH10Bac 細菌感受態(tài)細胞，劃線接種至LB 平板培養(yǎng)基中，37 ℃條件下避光培養(yǎng)48 h，挑取培養(yǎng)基中的白色菌落。將提取轉座后的質粒，以1.3 中構建的CaPV-P32 上、下游引物擴增驗證CaPV-P32-pFastBacHTA 質粒的轉座情況，對鑒定為陽性的質粒進行測序。

1.6 包裝重組桿粒病毒并傳代

制備Sf9 昆蟲細胞，將密度為2×106的對數生長期Sf9 昆蟲細胞鋪于細胞培養(yǎng)瓶中。細胞貼壁后，按照Bac-to-Bac 轉座重組技術，將篩選白斑提取質粒后的Bacmid-CaPV-P32 轉染至Sf9 昆蟲細胞中，28 ℃條件下，培養(yǎng)96 h；將培養(yǎng)的細胞反復凍溶3 次，離心后取上清液體凍存，記為P1 代病毒；從P2 代病毒開始，每代病毒轉染細胞培養(yǎng)72 h，細胞培養(yǎng)瓶中加入2 mL 的不含雙抗的SF900 II 型細胞培養(yǎng)基；按照MOI 值為5 的標準傳代接毒細胞，傳至P5 代后反復凍溶離心區(qū)，取上清作為種毒備用，-80 ℃保存。

1.7 重組目的蛋白表達與鑒定

將構建的質粒轉染Sf9 細胞后進行重組目的蛋白表達與鑒定。在收集培養(yǎng)的細胞沉淀中加入細胞裂解液，4 ℃條件下靜置30 min；使用超聲破碎儀超聲破碎10 min，使用離心機4 ℃條件下，12 000 r/min 離心12 min；將離心后的上清液過濾后，使用Ni-Berpharose FF 純化試劑盒，對蛋白進行初步粗純化，用SDS-PAGE 電泳觀察蛋白條帶；根據蛋白條帶的分子量大小、電泳后蛋白條帶清晰度、電泳背景等情況，初步分析粗提蛋白的表達量以及蛋白純度，并使用Nanodrop 和BCA 蛋白定量試劑盒檢測粗提蛋白濃度。

1.8 重組蛋白AKTA 系統(tǒng)高效純化

粗提后的大量重組蛋白需要通過AKTA 系統(tǒng)進行高效純化。使用高壓泵將細菌破碎后，以16 000 r/min、4℃條件高速離心40 min，收集上清液體，用0.22 μm 的濾膜過濾；將預裝的鎳柱連入AKTA 系統(tǒng)，使用20 mmol/L Tris、150 mmol/L Nacl，pH7.2 的緩沖液平衡預裝鎳柱；將過濾好的上清液體通過上樣環(huán)上樣進入AKTA 系統(tǒng)，使用20 個柱體積的含有50 mmol/L 咪唑溶液的雜質洗滌液清洗鎳柱中的雜蛋白，用濃度為500 mmol/L的咪唑洗脫緩沖液收集目的蛋白；將收集后的目的蛋白上樣AKTA 系統(tǒng)的分子篩，對粗純后的蛋白進行精細純化。

1.9 P32 抗體間接ELISA 檢測方法建立與優(yōu)化

1.9.1 基本檢測條件建立與優(yōu)化 將AKTA 精細純化后的抗原進行梯度稀釋并包被于ELISA 酶標板中，按照棋盤滴定法確定包被抗原的最優(yōu)包被濃度與血清稀釋度；將牛血清白蛋白（BSA）封閉液，按照不同濃度稀釋后封閉ELISA 酶標板，確定最優(yōu)封閉濃度；使用棋盤滴定交叉方法確定待檢血清與酶標二抗的最佳稀釋濃度與作用時間；計算陽性樣本與陰性樣本的P/N值，以P/N最大值所對應的檢測條件作為P32 抗體間接ELISA 檢測方法的最佳反應條件。

1.9.2 Cut-off臨界值確定 使用本研究建立的CaPV-P32 ELISA 抗體檢測方法，對經血清抗體中和試驗鑒定的350 份臨床陰性羊血清進行檢測，并統(tǒng)計分析相應的血清抗體OD450值，使用SPSS 軟件計算血清抗體的平均OD450值及對應的標準偏差值（SD）。Cut-off臨界值確定：當OD450＞＋4SD 判為陽性，OD450＜＋4SD 時判為陰性。

1.9.3 特異性檢測 使用小反芻獸疫病毒抗體陽性血清、羊O 型口蹄疫病毒抗體陽性血清、羊A型口蹄疫病毒抗體陽性血清、山羊關節(jié)炎與腦炎病毒抗體陽性血清、綿羊梅迪維斯納病毒抗體陽性血清、羊口瘡病毒抗體陽性血清，對本研究建立的間接ELISA 方法進行特異性驗證，根據檢測的OD450值與Cut-off臨界值來判定建立的檢測方法與其他羊病毒是否有非特異性交叉反應。

1.9.4 敏感性檢測 使用建立的間接ELISA 檢測方法，對購自英國WOAH 參考實驗室的CaPV 標準抗體陽性血清（血清中和效價為1:512）進行檢測。將CaPV 標準抗體陽性血清從1:8 的稀釋度開始倍比稀釋后檢測，根據計算結果得出陽性臨界值時的最大血清稀釋度。計算結果同血清中和試驗的中和效價結果進行比對。

1.9.5 重復性檢測 使用建立的間接ELISA 檢測方法，將10 份不同中和抗體效價的CaPV 抗體陽性血清，分別在同批次（批內）和不同批次（批間）的酶標板上進行重復性驗證，每個試驗平行驗證5次，根據檢測結果計算批內、批間變異系數（CV）。

1.9.6 臨床血清樣品檢測 用建立的間接ELISA檢測方法結合血清中和試驗，對中國動物疫病預防控制中心（農業(yè)農村部獸醫(yī)診斷中心）保存的480份臨床血清樣品進行檢測，計算敏感性符合率、特異性符合率以及總符合率。

2 結果與分析

2.1 CaPV-P32-pFastBacHTA 重組質粒構建

使用特異性引物的PCR 擴增結果（圖1）顯示，擴增得到與預期大小一致的產物片段（354 bp）。通過測序驗證，擴增產物與目的基因片段相符，表明成功構建了CaPV-P32-pFastBacHTA 重組質粒。

2.2 重組轉座子Bacmid-CaPV-P32 PCR 擴增

將提取后的轉座子質粒Bacmid-CaPV-P32 使用PCR 方法進行擴增驗證，對鑒定為陽性的質粒進行測序。擴增結果（圖2）顯示，得到與預期大小一致的產物片段；測序驗證結果（圖3）顯示，轉座后陽性質粒與目的基因片段相符，表明重組穿梭質粒構建成功。

2.3 Bacmid-CaPV-P32 致細胞病變結果觀察

在顯微鏡下觀察P5 代次的Bacmid-CaPV-P32桿狀病毒感染Sf9 細胞，發(fā)現(xiàn)未感染組的Sf9 細胞生長良好，而桿狀病毒Bacmid-CaPV-P32 感染組Sf9 細胞發(fā)生了明顯的增殖抑制，細胞聚攏呈拉鏈狀，細胞變圓、變大，細胞質內出現(xiàn)黑色顆粒及雜質等細胞病變（圖4）。

2.4 不同代次桿狀病毒目的基因檢測

使用桿狀病毒的CaPV-P32-F/CaPV-P32-R 為上、下游引物，對P3、P4、P5 代重組桿狀病毒感染的Sf9 細胞，提取基因組進行目的基因片段的PCR 擴增，以檢測各代次病毒DNA 序列中是否包含P32 序列片段。通過檢測發(fā)現(xiàn)，P32 蛋白編碼基因目的序列已成功與桿狀病毒基因組發(fā)生整合，并持續(xù)存在于各代次的病毒基因組中（圖5）。

2.5 重組蛋白表達與Western Blot 鑒定

將純化后的重組CaPV-P32 蛋白上樣進行SDS-PAGE 電泳鑒定，經考馬斯亮藍染色、脫色液脫色后，獲得了大小約32 ku 且純度較高的重組CaPV-P32 蛋白（圖6）。SDS-PAGE 電泳后，對純化后的重組CaPV-P32 蛋白通過Western Blot試驗鑒定反應原性。Western Blot 結果顯示，重組CaPV-P32 蛋白在PVDF 轉印膜上顯示出相對分子質量約為32 ku 的目的條帶（圖7），顯示了重組CaPV-P32 蛋白具有較好的反應原性。

2.6 CaPV-P32 間接ELISA 檢測方法建立與優(yōu)化

2.6.1 蛋白最佳包被濃度、一抗血清稀釋度與二抗稀釋度優(yōu)化 經對包被蛋白CaPV-P32 濃度及一抗血清稀釋度試驗驗證，在CaPV-P32 抗原濃度1 μg/mL、4 ℃條件下作用18 h，3%BSA、4 ℃條件下封閉24 h，一抗血清稀釋度1:50，反應45 min 時，計算得出的P/N值最大；當酶標二抗稀釋度為1:30 000，37 ℃條件下反應45 min，底物反應10 min 時，P/N值最高。

2.6.2 陰陽性臨界值（Cut-off值）確定 使用本研究建立的CaPV-P32 ELISA 抗體檢測方法，對經血清抗體中和試驗鑒定的350 份臨床陰性羊血清進行檢測，得到OD450平均值（X）為0.130，SD 為0.051，Cut-off值為X+4SD=0.334。

2.7 ELISA 檢測方法指標驗證

2.7.1 特異性 使用建立的CaPV-P32 ELISA 抗體檢測方法分別檢測了小反芻獸疫病毒抗體陽性血清、羊O 型口蹄疫病毒抗體陽性血清、羊A 型口蹄疫病毒抗體陽性血清、山羊關節(jié)炎與腦炎病毒抗體陽性血清、綿羊梅迪維斯納病毒抗體陽性血清、羊口瘡病毒抗體陽性血清，檢測得到的OD450值分別 為0.090、0.105、0.077、0.082、0.112、0.107，均小于Cut-off值0.334，說明重組CaPV-P32 抗原對上述羊病毒的抗體陽性血清無非特異性交叉反應，所建立的方法特異性較好。

2.7.2 敏感性 使用建立的CaPV-P32 ELISA抗體檢測方法對購買自英國WOAH 參考實驗室的CaPV 標準抗體陽性血清（血清中和效價為1:512）進行檢測，發(fā)現(xiàn)稀釋度在1:1 024 倍時仍為陽性，表明建立的ELISA 檢測方法具有較高的敏感性，高于傳統(tǒng)的血清中和試驗。

2.7.3 重復性 使用建立的間接ELISA 檢測方法將10 份不同中和抗體效價的CaPV 抗體陽性血清分別在批內和批間的酶標板上進行重復性驗證，發(fā)現(xiàn)批內檢測的重復性變異系數與批間重復性變異系數指標均小于10%（表2），表明所建立的ELISA檢測方法變異較小、重復性好、抗原穩(wěn)定性較高，可用于不同抗體效價樣本不同批次的CaPV 抗體檢測。

表2 間接ELISA 檢測方法的重復性驗證結果

2.7.4 臨床樣品測試 使用建立的間接ELISA 檢測方法對中國動物疫病預防控制中心（農業(yè)農村部獸醫(yī)診斷中心）保存的480 份臨床血清樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)樣本陽性率為67.50%，而用羊痘病毒血清中和試驗檢測的樣本陽性率為68.75%，兩種方法的敏感性符合率為98.18%；用ELISA 方法檢測的樣本陰性率為29.17%，而羊痘病毒血清中和試驗檢測的樣本陰性率為31.25%，兩種方法的特異性符合率為93.33%。兩種方法的總符合率為96.67%。結果見表3。

表3 臨床血清樣品的對比測試結果 單位：份

3 討論

羊痘目前尚無有效藥物治療方法，對其防控國內外主要采取疫苗免疫、病原與抗體監(jiān)測、種群凈化等綜合措施，因此疫苗免疫后的中和抗體監(jiān)測與疫苗免疫效果評價尤為重要。針對羊痘診斷，WOAH 陸生動物手冊（Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals）3.8.12 章羊痘診斷方法中涉及電鏡觀察、病毒分離、常規(guī)PCR檢測、中和試驗、間接免疫熒光抗體檢測等。國內現(xiàn)行行標《綿羊痘和山羊痘診斷技術》（NY/T 576—2015），包含病毒分離、電鏡檢查、包涵體檢查、中和試驗、PCR 檢測等技術。這些方法大多操作復雜，試驗周期較長，敏感性不高，結果判定受人為主觀性因素影響大[7-9]；而常規(guī)PCR 檢測方法對引物特異性要求較高，容易被污染。

血清抗體間接ELISA 方法，試驗材料易獲取，對試驗環(huán)境、設備及人員要求較低，檢測速度快，且敏感性高于中和試驗，結果判定更為簡單，在臨床檢測和大面積疫苗免疫抗體監(jiān)測等方面具有重要價值，對疫情的緊急處理及防控意義重大，適合于大面積推廣應用。本研究所建立的檢測CaPV-P32抗體的間接ELISA 方法可準確檢測動物血清中的保護性中和抗體水平，特異性強、準確性高，可較為客觀地評價羊痘疫苗免疫動物的抗體免疫保護水平。建立敏感性高、特異性強、高通量、操作簡便的CaPV-P32 中和抗體ELISA 檢測方法，對于大批量臨床樣本抗體檢測、基層樣本篩查以及加快羊痘凈化進程等方面具有重要價值[8-12]。

建立穩(wěn)定的CaPV-P32 抗體ELISA 檢測方法的核心是表達與純化出具備天然結構的CaPV P32蛋白。原核表達系統(tǒng)雖然操作簡單，蛋白表達量高，但是表達出的抗原往往是包涵體結構，不具有天然結構，因而使抗原與動物體內抗體結合的匹配性出現(xiàn)差異。因此，大腸桿菌等原核表達系統(tǒng)表達出的CaPV-P32 包涵體抗原無法較好地識別、親和動物體內的中和抗體，很容易造成檢測敏感性不高或者非特異性反應原因導致的假陽性樣本增高等現(xiàn)象。昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)作為經典的真核抗原表達系統(tǒng)具有原核表達系統(tǒng)無法比擬的優(yōu)勢，可以為表達的重組蛋白提供甲基化、糖基化、磷酸化、翻譯折疊等翻譯后修飾，從而使表達的蛋白質結構與生物活性更接近于病毒的天然結構蛋白。桿狀病毒表達系統(tǒng)表達外源蛋白是通過多角體啟動子發(fā)生作用，在大量表達外源插入目的蛋白的同時，不影響病毒在Sf9 細胞中的增殖。本研究將編碼CaPV P32 抗原的核苷酸序列優(yōu)化為適合在Sf9 細胞中表達的偏好密碼子，去除輸水的跨膜區(qū)序列，質粒轉座后瞬時轉染Sf9 昆蟲細胞形成桿狀病毒，利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)成功表達制備出了更接近病毒天然結構的重組CaPV P32 蛋白，為開發(fā)商品化的CaPV中和抗體ELISA 檢測試劑盒奠定了基礎。

目前國內檢測CaPV 抗體使用的ELISA 試劑盒大多為國外進口，成本高、進口周期長，給基層動物疫病防控工作帶來了較大困難。本研究建立的CaPV-P32 抗體ELISA 檢測方法與傳統(tǒng)的血清中和抗體檢測方法相比，符合率高達96.67%，在保證檢測方法特異性的同時，檢測敏感性比血清中和檢測方法更高。同時本研究建立的CaPV-P32 抗體ELISA 檢測方法適合于高通量檢測，可進一步完善為成熟產品，用于基層羊痘疫苗免疫效果評價、疫情監(jiān)控等，因而具有較好的市場應用前景。