李盛瓊，楊光友，李徳珍，陳和強，華瑞其，高 露，尹 杰，袁東波，楊天俊，黃雅琳，魏秋霞，陽愛國，侯 巍

（1.四川省動物疫病預防控制中心，四川成都 610041；2.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，四川成都 611130；3.道孚縣動物疫病預防控制中心，四川道孚 626400；4.甘孜州動物疫病預防控制中心，四川甘孜 626700；5.富順縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川富順 643200；6.雅安市養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中心，四川雅安 625000）

包蟲?。蝌什。┦怯杉毩＜蚪{蟲寄生于動物（人）的肝臟、肺臟等器官引起的一種人獸共患病，嚴重影響我國畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康[1-3]，我國將其列為二類動物疫病進行防控。包蟲病主要流行于我國北方和西南地區(qū)，其中西南地區(qū)主要集中于高海拔農(nóng)牧區(qū)。經(jīng)濟發(fā)展相對滯后，基層動物防疫體系薄弱，是造成包蟲病流行的主要因素[4]。四川省是牦牛養(yǎng)殖大省，截至2021 年末，全省包蟲病疫區(qū)縣共存欄牦牛420.6 萬頭，牦牛存欄量大，疫苗需求量也大。為探索更為科學、經(jīng)濟的免疫方案，本研究開展了不同劑量包蟲病基因工程疫苗EG95 免疫牦牛的效果試驗，使用間接ELISA血清抗體檢測方法，評價了不同免疫劑量對牦牛包蟲病的保護效果，以期為四川省乃至全國的牦牛包蟲病防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 選取甘孜州道孚縣玉科鎮(zhèn)某養(yǎng)殖戶1 歲左右未免疫包蟲病疫苗牦牛50 頭，隨機平均分為A、B、C、D、E 5 組，每組10 頭，在同等生產(chǎn)條件下進行飼養(yǎng)管理。

1.1.2 試驗疫苗 包蟲病基因工程疫苗EG95（批號2021007-1），每頭份含有EG95 抗原50 μg，購自重慶澳龍生物制品有限公司。

1.1.3 儀器和試劑 96 孔酶標儀，購自Bio-Rad公司；37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，購自上海福瑪實驗設備有限公司；微量移液器，購自Transferpette 公司；一次性移液器吸頭，購自Axygen 公司；牛棘球蚴（EG95）ELISA 抗體檢測試劑盒（批號20211004），購自重慶澳龍生物制品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 不同劑量免疫 采取頸部皮下注射方式，分別按照1、2、3、4、5 頭份劑量對A、B、C、D、E 5 組試驗牦牛進行免疫，間隔28 d 后同等劑量二免。免疫后觀察牦牛有無嘔吐、抽搐、休克等應激反應和過敏反應，同時監(jiān)測牦牛的體溫變化。首免前及二免后15 d 分別采集試驗組牦牛血液分離血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 血清抗體檢測 采用間接ELISA 方法對試驗血清進行IgG 檢測，按照牛棘球蚴（EG95）ELISA 抗體檢測試劑盒說明書進行結果判定：當樣品OD450nm≤0.3 時，判定為所檢樣品對細粒棘球蚴（包蟲）感染無保護力；當0.3 ＜樣品OD450nm≤0.6 時，判定為所檢樣品抗體水平較低，保護力低下；當樣品OD450nm＞0.6 時，判定為所檢樣品抗體水平較高，有較強保護力。

2 結果與分析

2.1 免疫應激反應

首次免疫后，試驗D 組、E 組牦牛在免疫后1 d 分別有1 頭牦牛出現(xiàn)精神沉郁、不愿走動、采食量下降等免疫應激癥狀，免疫部位未發(fā)生潰爛，上述2 頭牦牛分別在免疫后2、3 d 恢復正常；所有試驗牦牛免疫1 周內體溫無明顯變化，無試驗動物死亡情況。

二次免疫后，5 組試驗牦牛的呼吸、精神、采食等指標均無明顯變化，所有試驗組動物免疫1 周內體溫無明顯波動。

2.2 免疫抗體陽性率

首免前采集5 組試驗牦牛的血液進行血清學免疫抗體檢測，結果均未檢測出包蟲病陽性抗體；二免后15 d，再次采集5 組試驗動物血液進行免疫抗體檢測，發(fā)現(xiàn)A、B、C 組牦牛的抗體陽性率分別為30%、40%、50%，與E 組的90%存在顯著性差異（P＜0.05），D 組抗體陽性率為80%，與E 組無顯著性差異（P＞0.05）。具體檢測結果見表1。

表1 牦牛免疫后血清抗體檢測結果

2.3 免疫抗體合格率

經(jīng)檢測，E 組有7 頭牦牛的樣品OD450nm＞0.6，抗體合格率為70%。A 組和B 組牦牛的樣品OD450nm均＜0.6，無抗體合格樣本；C 組有1 頭牦牛的樣品OD450nm＞0.6，抗體合格率為10%，與E 組差異顯著（P＜0.05）；D 組有4 頭牦牛的樣品OD450nm＞0.6，抗體合格率為40%，與E 組存在顯著性差異（P＜0.05）。具體結果見表1 和圖1。

3 討論

牦牛養(yǎng)殖是四川省藏族地區(qū)農(nóng)牧民的重要收入來源之一，而四川省牧區(qū)也是包蟲病的重要流行區(qū)，包蟲病流行嚴重影響了當?shù)匦竽翗I(yè)發(fā)展和農(nóng)牧民收入增長。加快推進牦牛包蟲病免疫防控，建立健全畜間防控體制機制，是解決農(nóng)牧民增收，加快鄉(xiāng)村振興的重要技術手段。

細粒棘球絳蟲EG95 重組蛋白可以誘導機體產(chǎn)生特異性抗體，有效抵抗棘球蚴感染。以EG95 蛋白為基礎研制的基因工程亞單位疫苗在多種動物及不同國家和地區(qū)的臨床試驗和田間試驗中均表現(xiàn)了良好的預防效果[5-6]。Heath 等[7-8]進行牛（免疫劑量分別為50、250 和500 μg EG95 抗原）和牦牛（免疫劑量為50 μg EG95 抗原）免疫保護試驗發(fā)現(xiàn)：在二次免疫（250 μg EG95 抗原）后，免疫保護率達90%，并能維持12 個月；在二次免疫12 個月后進行三免，保護率提高到99%。牦牛是生活在高寒高海拔地區(qū)的特殊畜種。陽愛國等[9]試驗了包蟲病基因工程EG95 疫苗（免疫劑量分別為250和500 μg EG95 抗原）對牦牛的免疫效果、安全性，并調查該疫苗在不同性別、不同年齡、不同海拔地區(qū)牦牛間存在的免疫差異性，結果發(fā)現(xiàn)各試驗組牦牛在免疫抗體產(chǎn)生時間、群體陽性率等方面無顯著差異（P＞0.05），且該疫苗適用于不同海拔地區(qū)牦牛使用，安全性高并可產(chǎn)生較高的抗體水平。

本研究試驗了不同劑量（分別含有50、100、150、200、250 μg EG95 抗原）包蟲病基因工程亞單位疫苗EG95 對牦牛的免疫效果，發(fā)現(xiàn)當免疫劑量為250 μg 時，抗體合格率顯著高于其他劑量組，群體抗體陽性率和合格率均較為理想。因此，建議對適齡牦牛進行二次免疫，每次的免疫劑量為250 μg EG95 抗原，間隔28 d。