郭家媚 ， 趙允清 ， 邵明珠 ， 吳同壘 ， 張志強 ， 李蘊玉 ， 張艷英 ， 李佩國 ， 張召興,2

(1.河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室 ， 河北 秦皇島 066004 ； 2.河北旅游職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系 ， 河北 承德 067000)

禽沙門菌病 (Avian salmonellosis)是危害養(yǎng)雞業(yè)的主要細菌性疾病之一，臨床中常見沙門菌病主要包括雞白痢、禽傷寒和雞副傷寒3種[1-2]。禽沙門菌病可以引起不同日齡的雞發(fā)病，其中雛雞發(fā)病率和死亡率均較高，成年雞多為慢性和隱性經(jīng)過，常不出現(xiàn)癥狀，但可導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降，引發(fā)其他疾病[3-5]。沙門菌寄生于人和動物的腸道內(nèi)，絕大多數(shù)對人和動物具有致病性，且成為禽產(chǎn)品污染的主要來源之一[6]。相關(guān)研究表明，沙門菌引起的中毒病例約占細菌性食物中毒的40%，該菌在自然界中廣泛存在，且對人類的健康具有很大的威脅，成為公共衛(wèi)生問題[7]。

沙門菌屬型復(fù)雜，其中菌體表面脂多糖、鞭毛抗原分別攜帶的O、H抗原等，抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且不易分型，生化反應(yīng)、血清型分型及傳統(tǒng)的分型方法存在較大的局限性[8]。傳統(tǒng)的分型方法不能滿足區(qū)分不同來源的沙門菌菌株之間同源性。脈沖場凝膠電泳技術(shù)(Pulsed field gel electrophoresis,PFGE)具有重復(fù)性好、分辨率高、易于標化等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于細菌分子分型中[9-10]。本試驗從患病蛋種雞體內(nèi)分離到了12株沙門菌，并對分離的12株沙門菌致病性、血清分型、分子分型等生物學(xué)特性進行鑒定，為進一步分析蛋種雞源沙門菌及開展分子流行病學(xué)溯源提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 秦皇島地區(qū)蛋種雞養(yǎng)殖場，采集患病蛋種雞的肝臟、卵黃、心血等病料組織。

1.2 主要試劑 沙門菌血清因子，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；API 20E試劑盒，購自法國梅里埃生物科技公司；沙門菌科瑪嘉培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基，均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；2×TaqMasterMix、10×M Buffer、0.1%BSA、限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、細胞懸浮緩沖液(CSB)、細胞裂解緩沖液(CLB)、TE緩沖液、20%十二烷基硫酸鈉，均購自寶生物工程(大連)有限公司；DL-2 000 DNA Marker，購自北京中科瑞泰生物科技有限公司；沙門菌H9812(Marker)、7%綿羊脫纖血培養(yǎng)基，均由河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室提供。

1.3 主要儀器 PCR儀FGEN02TD型，英國Techne公司產(chǎn)品；CHEF MAPPER脈沖場凝膠電泳儀、Bio-Rad型凝膠成像系統(tǒng)，美國Rio-Rad公司產(chǎn)品；生物培養(yǎng)箱DHP-9082型，上海一恒科技有限公司產(chǎn)品。

1.4 試驗動物 種蛋由河北科技師范學(xué)院動物科技學(xué)院動物生產(chǎn)實訓(xùn)基地提供，1日齡白來航雛雞由本實驗室孵化，飼養(yǎng)至14日齡，經(jīng)檢測無沙門菌感染，再進行致病性試驗。

1.5 細菌的分離與培養(yǎng) 采集的患病蛋種雞的肝臟、卵黃、心血等病料組織無菌條件接種于7%綿羊脫纖血培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)12～18 h，挑取優(yōu)勢單個菌落接種于沙門菌科瑪嘉培養(yǎng)基進行鑒別培養(yǎng)，挑取沙門菌科瑪嘉培養(yǎng)基單個菌落，接種于營養(yǎng)肉湯中進行純化培養(yǎng)后進行染色鏡檢。

1.6 API 20E試劑盒鑒定 取分離純化的疑似沙門菌的菌株，按照試劑盒說明書將分離菌株懸浮液接種API 20E試條，37 ℃培養(yǎng)18～24 h后，根據(jù)細菌編碼表判讀結(jié)果。

1.7 細菌的PCR鑒定 按細菌提取試劑盒說明書提取基因組DNA，設(shè)計16S rRNA基因序列通用引物F:5′-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3′/R:5′-GTGGCGGACGGGTGAGTAA-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，進行PCR檢測，將分離菌株的PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，測序結(jié)果與GenBank中登錄的沙門菌參考株的基因序列進行同源性比對。

1.8 致病性試驗 參考文獻[11]報道的方法，分別設(shè)攻毒組和對照組，每一株菌為1個攻毒組，將分離菌株培養(yǎng)至對數(shù)期計數(shù)，每一株分離菌株腹腔注射5只試驗雛雞，劑量為0.2 mL(108CFU/mL)；對照組給予等量的無菌PBS。攻毒12 h后開始觀察，試驗期為7d，試驗期間觀察并記錄雛雞發(fā)病和死亡情況，對死亡的雛雞進行細菌分離鑒定。

1.9 血清分型檢測 按照沙門菌血清因子說明書，采用玻板凝集試驗對分離的12株沙門菌進行血清型鑒定。

1.10 PFGE分型檢測 參考文獻[8-9]報道的方法，對分離的12株沙門菌進行PFGE分型，用凝膠成像分析系統(tǒng)在紫外燈下獲取凝膠圖像，將獲得的凝膠圖像送中國疾病預(yù)防控制中心傳染病所腹瀉病室進行聚類分析。采用BioNumerics軟件繪制沙門菌分離株的系統(tǒng)進化樹，分析遺傳變異性。

2 結(jié)果

2.1 細菌的分離與培養(yǎng) 疑似沙門菌分離菌株在7%綿羊脫纖血培養(yǎng)基上長出圓形光滑、邊緣整齊、稍隆起、淺白色的菌落，不溶血；在沙門菌科瑪嘉培養(yǎng)基上長出圓形光滑、邊緣整齊、大小一致的紫紅色菌落；革蘭染色為陰性的兩端鈍圓桿狀菌，大小(0.5～0.8)μm×(1.0～2.0)μm。

2.2 API 20E生化鑒定 利用API 20E 試條對12株分離菌株進行鑒定，結(jié)果顯示，12株分離菌株均為沙門菌，并命名為C1、36、C13、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11和C12。

2.3 細菌的PCR鑒定 結(jié)果如圖1所示，分離的12株分離菌株用細菌的16S rRNA基因序列通用引物均擴增出1 492 bp左右的目的基因。12株分離菌株P(guān)CR產(chǎn)物測序結(jié)果與GenBank中登錄的12株沙門菌參考株的基因序列同源性在97.9%～99.0%。

圖1 沙門菌分離菌株的PCR擴增

2.4 致病性試驗 攻毒組的白來航雛雞在攻毒后24～96 h出現(xiàn)精神沉郁、采食量減少、腹瀉，個別的雛雞出現(xiàn)無癥狀死亡。無菌采集死亡雛雞的病料組織，成功分離到沙門菌。直到7 d試驗結(jié)束，對照組白來航雛雞未出現(xiàn)明顯臨床癥狀。經(jīng)統(tǒng)計分析，12株分離株對白來航雛雞具有一定致病性，均為致病性沙門菌。致病性試驗結(jié)果表明，分離的12株沙門菌致病性沒有差異性。

2.5 血清分型檢測 采用玻板凝集試驗對分離的12株沙門菌進行血清型鑒定，結(jié)果顯示，除菌株36未測出血清型外，其余11株沙門菌分離菌株屬于4個血清型，其中菌株C1為O4(B)群無動力沙門菌；菌株C3、C4為雞沙門菌；菌株C5、C6、C7、C8、C9為病牛沙門菌；菌株C10、C11、C12為腸炎沙門菌。

2.6 PFGE分型檢測 用PFGE對12株沙門菌分離菌株進行分子分型，結(jié)果如圖2所示，12株沙門菌用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ酶切后進行PFGE電泳，其中菌株36 PFGE帶型不明顯，其余11株沙門菌株可得出不同的PFGE圖譜，每株約產(chǎn)生10～20條電泳帶。

圖2 沙門菌分離株的PFGE圖譜

沙門菌聚類分析結(jié)果如圖3所示，其中菌株36 PFGE帶型不明顯未進行聚類分析，其余11株分離菌株之間的相似度為56%～100%，11株試驗菌可分為5個不同的型別，其中菌株C13、C4與菌株C5、C6、C7、C8相似度均為100%，菌株C9與菌株C10、C11相似度為100%，其余菌株相似度較低。11株沙門菌分離株的聚類分析圖中，以75%的相似度為界，可以分為 A、B、C和 D共4個簇。A 簇包括病牛沙門菌和腸炎沙門菌，B 簇均為病牛沙門菌，而C 簇也只有1種血清型，即雞沙門菌，D簇只有1株沙門菌，血清型為O4群無動力沙門菌。相同的血清型可能具有聚為 1 簇的趨勢。不同血清型間的相似度高。菌株C9(病牛沙門菌)和菌株C10(腸炎沙門菌)的相似度為100%，而菌株C8和菌株C9(同為病牛沙門菌)的相似度只有70%。

圖3 11株沙門菌分子分型聚類圖

3 討論

沙門菌是一類廣泛分布于自然界人獸共患的病原菌之一，該菌可以通過多種途徑污染食品、水源及畜產(chǎn)品等，引起人類的食物中毒、急性腸胃炎和動物腹瀉等疾病，對人類及動物健康構(gòu)成極大危害[5-6]。禽沙門菌是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，經(jīng)過一定途徑進入宿主體內(nèi)，在小腸上皮細胞內(nèi)定殖，并隨著吞噬細胞擴散至其他組織器官，該菌可以通過水平傳播，也可以通過垂直傳播，帶菌和隱形感染的種雞是沙門菌主要宿主的傳染源，可以長期帶毒和排毒，導(dǎo)致沙門菌病在種雞、雛雞中廣泛流行[12-13]。因此，在蛋種雞養(yǎng)殖過程中應(yīng)該注意沙門菌病的凈化與控制，減少該病的發(fā)生與流行。

在養(yǎng)殖過程中，種雞群雞白痢凈化主要通過全血玻板凝集試驗檢測，此方法簡單便于操作，但只能檢出含有 O抗原的沙門菌，會造成其他類型沙門菌感染的漏檢，而細菌分離鑒定可以解決其他類型的沙門菌感染的漏檢情況[4-6]。本試驗采用API20E、PCR和人工感染致病性試驗從患病的蛋種雞病料組織分離得到12株致病性沙門菌，為了更好地控制該病，對其血清分型、分子分型等生物學(xué)特性進行鑒定，結(jié)果顯示，除菌株36未測出血清型外，其余11株沙門菌分離株屬于4種血清型，其中 C1為O4(B)群無動力沙門菌，菌株C13、C4為雞沙門菌，菌株C5、C6、C7、C8、C9為病牛沙門菌，菌株C10、C11、C12為腸炎沙門菌。本試驗在患病的蛋種雞體內(nèi)分離到病牛沙門菌，國內(nèi)罕見報道。本試驗結(jié)果與費中杰[2]、吳曉君[3]、徐耀輝等[4]的報道存在一定差異性，可能與地區(qū)分布、雞的種源、場環(huán)境、飼料、鼠類及其他媒介生物攜帶沙門菌等有關(guān)。本試驗分離的5株病牛沙門菌可能對種雞群具有潛在威脅，需引起注意。

為了更好地了解養(yǎng)殖場中沙門菌的流行情況，建立起常態(tài)監(jiān)測具有重要意義。本試驗利用PFGE方法對分離的12株致病性沙門菌分子分型進行溯源分析，結(jié)果顯示，除菌株36因PFGE帶型不明顯未進行聚類分析外，其余11株沙門菌分離株包含4種血清型，可分成4種PFGE指紋圖譜，各帶型間親緣關(guān)系較遠，不同血清型的菌株之間的相似度在56%～100%，相同的血清型可能具有聚為 1 簇的趨勢，不同血清型菌株之間具有較高的相似度，11株沙門菌具有相同血清型的菌株中具有不同的PFGE圖譜，不同血清型的沙門菌菌株可同屬一種PFGE指紋圖譜，如5株病牛沙門菌可分為2個型別，C9株病牛沙門菌與C10株腸炎沙門菌圖譜更為相似。因而說明了PFGE指紋圖譜與血清學(xué)型別無相關(guān)性，相同血清型的沙門菌分離菌株其PFGE圖譜不一定相同，PFGE可進一步區(qū)分各菌株間的微小差別，因而在沙門菌病流行病學(xué)調(diào)查及監(jiān)測中發(fā)揮重要作用。沙門菌的PFGE分型結(jié)果能夠為不同來源的沙門菌數(shù)據(jù)庫的建立提供更詳細的資料，本試驗為蛋種雞源沙門菌疾病的進一步凈化與防控提供了科學(xué)依據(jù)。