張鳳梅，蔣愛月，向能軍，蔣昆明，楊 晨，李振杰，太志剛

(1.云南省煙草化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南 昆明 650231；2.昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500)

0 引 言

茶樹精油(Tea Tree Oil,TTO)是從桃金娘科千層葉(Melaleucaleucadendron)中提取得到的植物精油，具有抑菌抗炎、殺蟲等藥理活性，其香氣成分具有提神醒腦的功效，民間常用來治療傷風(fēng)感冒、鼻炎、咳嗽和哮喘等上呼吸道疾病，在食品、醫(yī)藥和煙草方面具有較廣的應(yīng)用范圍[1-2]，其主要化學(xué)成分為萜類化合物，如松油醇、松油烯、桉葉素、羥基萜烯和蒎烯等[3-4].基于其成分均為低沸點(diǎn)物質(zhì)，揮發(fā)性較強(qiáng)，加溫時(shí)，香氣揮發(fā)量增加，容易氧化，限制了其在藥品、食品和煙草方面的應(yīng)用.

增強(qiáng)茶樹精油的熱穩(wěn)定性，使其緩慢釋放香氣成分是解決以上問題的關(guān)鍵.查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)解決以上問題的方法主要有兩種，方法一是將香味成分與底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，所得產(chǎn)物于常溫下不釋放香氣，加溫時(shí)，化學(xué)鍵斷裂，香氣成分釋放出來，如糖苷類香料前體等物質(zhì).方法二是利用高分子材料，將香味成分包裹于其中，形成微米或納米級顆粒，如微膠囊、微球、環(huán)糊精包結(jié)物等，在常溫下，香氣成分得以有效保存，加溫時(shí)，香氣成分熱運(yùn)動(dòng)加劇，氣化，穿過高分子外壁，釋放出來[5-8].其中，方法一適用于單一香味成分，方法二對混合物或單一香味成分均適用，其中微膠囊因操作簡便，容易擴(kuò)大化生產(chǎn)，在食品、藥品和煙草方面具有較為廣泛的應(yīng)用[6].迄今為止，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道了茶樹油的微膠囊制備方法,并研究其穩(wěn)定性和釋放性能，如張曉明等人[9]采用復(fù)凝聚法，以多孔淀粉為載體，將茶樹精油吸附，再以海藻酸鈉-殼聚糖為壁材，控制凝聚pH值、乳化時(shí)間、包裹時(shí)間和攪拌轉(zhuǎn)速等因素，成功制備了茶樹精油微膠囊，還發(fā)現(xiàn)其熱穩(wěn)定性提高，在一定溫度點(diǎn)，其單日釋放率僅為0.04%，不僅保持了穩(wěn)定性，還有效提高其緩釋性能，又如龔圣等人[10]以甲醛和尿素為壁材，采用原位聚合法制備了茶樹油/脲醛樹脂微膠囊，所制得的微膠囊載藥量為45%，4 d 釋放量為68%，室溫條件下微膠囊釋放時(shí)長可達(dá)7d.

有別于復(fù)凝聚法或原位聚合法，單凝聚法只需一種壁材，通過調(diào)控體系無機(jī)鹽的濃度，使壁材析出、凝聚并發(fā)生包裹.因?yàn)閮H使用一種壁材，其操作方法較復(fù)凝聚簡單，控制壁材和體系內(nèi)無機(jī)鹽的濃度，就可調(diào)控壁材的凝聚速率，可操作性和可控性較強(qiáng)，具有包埋率高、成本低、易于擴(kuò)大化生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)[11]，目前已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道單凝聚法成功制備微膠囊的方法[12-15].本研究團(tuán)隊(duì)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，采用單凝聚法制備茶樹油微膠囊的研究報(bào)道較少，為進(jìn)一步拓展茶樹油應(yīng)用范圍，本文以明膠為壁材，采用單凝聚法，結(jié)合真空冷凍干燥制備茶樹油單壁微膠囊(TTEO /GE)，通過傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)、顯微鏡和掃描電鏡(SEM)觀察其形貌結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步通過熱重/熱差(TG/DSC)和熱釋放氣質(zhì)聯(lián)用(HR/GC-MS)研究其穩(wěn)定性和熱釋放性能.以上研究將為深入探討茶樹油微膠囊的單壁包裹及其應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

明膠(GE，凍力200)購自山東大凱生物科技有限公司，茶樹精油(TTEO)購自吉安市佰倫植物油有限公司，氫氧化鈉、乙酸、甲醛和無水硫酸鈉等試劑為分析純，購自國藥集團(tuán)有限公司.

Mettler電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)，wn-17m精確控溫高溫爐(南京利德盛機(jī)械公司)，t25組織搗碎機(jī)(德國IKA公司)，SZCL-2控溫磁力攪拌器(鞏義市予華儀器)，DOR YANG 7230G/723紫外可見分光光度計(jì)(渡揚(yáng)精密儀器(上海)有限公司)，Agilent 7890A-MS5977B氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國安捷倫科技有限公司)，LGJ﹣10真空冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)，F(xiàn)TIR-650S紅外光譜儀(賽默飛科技)，TG/DSC1 型熱重/ 差熱綜合熱分析儀 (瑞士 Mettler Toledo 公司)，SZX/SZ倒置光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯科技)，Quanta200掃描電子顯微鏡(美國FEI公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 TTEO/GE微膠囊的制備及形貌觀察

用分析天平精確稱取 2.502 0 g GE，將其置于50 mL蒸餾水中，升溫至60 ℃，浸泡10 min，使之膨脹、攪拌并溶解于水中，觀察分散程度，適當(dāng)延長或縮短浸泡時(shí)間，待其分散完全后保溫備用，得GE溶液.精確吸取2.850 mL TTEO，將其置于GE溶液中，以 12 000～15 000 r/min的轉(zhuǎn)速乳化8 min，得TTEO/GE乳劑，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為500 r/min，充分?jǐn)嚢瑁瑒蛩?，逐滴，加?0%乙酸水液，直至溶液pH為3.6，停止滴加，持續(xù)攪拌.緩慢勻速滴加20%的無水硫酸鈉溶液，采用分光光度計(jì)監(jiān)測溶液透光率，當(dāng)透光率數(shù)值由0忽躍至80%時(shí)，停止滴加，持續(xù)攪拌15 min，取適量樣品于載玻片上，采用倒置顯微鏡觀察成囊情況，進(jìn)一步加入10%硫酸鈉溶液，攪拌3 min，迅速冷卻至4 ℃，逐滴加入適量甲醛溶液(12.3 mol/L)，持續(xù)攪拌10 min，使用20%氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為8.5，攪拌30 min，過濾，用蒸餾水洗濾餅3次，將濾餅置于冷凍干燥機(jī)中，得到TTEO/GE微膠囊.

取少量TTEO/GE微膠囊置于載玻片上，取適量水將其分散均勻，于倒置顯微鏡下觀察TTEO/GE微膠囊的形貌，拍照記錄.進(jìn)一步使用導(dǎo)電雙面膠將TTEO/GE微膠囊固定在掃描電子顯微鏡的平臺上，去除多余TTEO/GE微膠囊.觀察其形貌，SEM的儀器條件為：真空度<10 Pa，保持3～4 min，噴金時(shí)間120 s，電壓5 kV，電流15 mA，樣品高度9.4 mm，放大倍數(shù)5 K.

1.2.2 FTIR測試

TTEO/GE微膠囊包合效應(yīng)采用FTIR光譜儀進(jìn)行測試，取適量溴化鉀置于研缽中，分別加入適量TTEO、TTEO/GE和GE混合研磨，壓片，空白調(diào)零.儀器條件為：掃描范圍 4 000 cm-1至400 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描3次.

1.2.3 包封率測試

TTEO/GE微膠囊包封率的測試按Toure等報(bào)道的方法進(jìn)行[16]，取40 mL蒸餾水置于100 mL燒杯中，將200 mg TTEO/GE微膠囊攪拌分散于其中，觀察其分散狀態(tài)，借助超聲儀器進(jìn)行分散，控制功率和時(shí)間，觀察TTEO/GE微膠囊形貌，確保其破壁完全.將10 mL正己烷加入分散液中，充分混合，超聲，靜置萃取 5 min，以 4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取出上層正己烷萃取液.重復(fù)以上操作3次，合并萃取液，定容.GC-MS測定并計(jì)算包埋率.儀器條件：HP-5MS(30 m×0.25 μm)毛細(xì)管柱，氦氣為載氣，流速 1 mL/min，氣化室溫度280 ℃，四級桿溫度150 ℃，離子源溫度230 ℃.柱溫升溫程序?yàn)椋浩鹗紲囟?0 ℃，保持5 min，升溫至280 ℃，升溫速率為3 ℃/min，于280 ℃保持10 min.經(jīng)分離得到的物質(zhì)采用EI離子源進(jìn)行全掃描檢測，掃描范圍45～500 amu，采集得到總離子流圖.

包封率(%)= (M/MO)×100

式中：M為茶樹精油在TTEO/GE微膠囊中的質(zhì)量，g；MO為初始添加的茶樹精油用量，g.

1.2.4 TG/DSC測試

調(diào)試儀器于800 ℃下保持10 min，排儀器內(nèi)部雜質(zhì)，將 12.121 9 mg TTEO/GE微膠囊置于熱重坩堝內(nèi).在氮?dú)饬髁繛?0 mL/min，起始溫度為30.1 ℃，最終溫度為800.5 ℃，升溫速率為10 ℃/min.

1.2.5 熱分解分析

于實(shí)驗(yàn)室自制熱分解罐中加入500 mg TTEO/GE微膠囊，旋緊內(nèi)蓋，壓緊外蓋，確保分解罐密閉，打開進(jìn)氣閥和出氣閥，使用氮?dú)庵脫Q罐內(nèi)空氣，關(guān)閉進(jìn)氣和出氣，將熱分解罐置于高溫爐內(nèi)以5℃/min的速率升溫至100 ℃，保持5 min，打開進(jìn)氣閥和出氣閥，進(jìn)氣口通入氮?dú)猓鰵饪谥糜?mL二氯甲烷吸收液中，吸收5 min，將吸收液定容至5 mL，密封保存.分別升溫至100 ℃、200 ℃、300 ℃、400 ℃和500 ℃，按以上操作程序得相應(yīng)吸收液.采用GC-MS測定吸收液中的化學(xué)成分，儀器條件與1.2.3一致，檢索譜庫版本為NIST14，面積歸一化法為定量方法.

2 結(jié)果與討論

2.1 TTEO/GE微膠囊的制備和形貌分析

因單凝聚法制備所得微膠囊為單層壁，通過調(diào)控芯壁比,即控制其壁材厚度，操作簡單，便于擴(kuò)大化生產(chǎn)[13].本研究以GE為囊材，通過加入20%無水硫酸鈉以降低GE的溶解度，以促使其凝聚，包裹TTEO乳球，加入10%無水硫酸鈉，避免體系中GE解聚，迅速降溫，甲醛固化，洗滌，冷凍干燥，最終得到TTEO/GE微膠囊.在顯微鏡下觀察微膠囊的形貌，如圖1所示，視野中TTEO/GE微膠囊呈球形，為單層壁材，且數(shù)量較多，范圍內(nèi)無絮狀物，此結(jié)果說明凝聚的明膠將TTEO乳球包裹完全.

圖1 TTEO/GE微膠囊鏡像圖 Fig.1 IM picture of TTEO/GE

為進(jìn)一步觀察TTEO/GE微膠囊的形貌及微觀尺寸，本研究采用SEM觀察了TTEO/GE微膠囊的微觀結(jié)構(gòu).如圖2所示，可明顯地看到球形TTEO/GE微膠囊，尺寸范圍為10～30 μm，表面光滑，形貌完整，無褶皺，與圖1相似的是，尺寸稍大的表面附著了部分小尺寸微膠囊，且微膠囊之間存在孔洞，可能是在真空冷凍干燥時(shí)形成氣孔所致.

圖2 茶樹精油微膠囊掃描電鏡圖 Fig.2 SEM picture of TTEO/GE

2.2 FTIR測試

如圖3所示，自上而下分別為明膠(GE)、茶樹精油(TTEO)、茶樹精油微膠囊(TTEO/GE)的傅里葉變換紅外光譜圖，TTEO的主要成分為蒎烯和蒈烯等，所以在 2 922 cm-1附近存在較強(qiáng)的不飽和C﹣H振動(dòng)吸收峰，在 1 676 cm-1附近出現(xiàn)了不飽和碳碳雙鍵振動(dòng)吸收峰；GE的片段為肽，其結(jié)構(gòu)中存在胺基、羰基和羥基，所以在 1 600 cm-1附近出現(xiàn)了較強(qiáng)的羰基吸收峰，在 3 428 cm-1處出現(xiàn)了較為寬的羥基和胺基吸收峰；TTEO/GE在 3 428 cm-1出現(xiàn)了較寬的羥基和胺基吸收峰，同時(shí)在 2 922 cm-1附近出現(xiàn)了較強(qiáng)的不飽和-C-H的吸收峰.綜上分析，證明此茶樹精油微膠囊制備成功.在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步對包埋率進(jìn)行了測試，通過攪拌和超聲破壁后，以正己烷為萃取劑反復(fù)進(jìn)行萃取，通過GC-MS對萃取液進(jìn)行了測試，最終，通過計(jì)算TTEO/GE微膠囊的包封率可達(dá)83.5%.以上結(jié)果說明添加無水硫酸鈉，降低GE的溶解度，促其凝聚和包裹，為防止GE再次解聚，本實(shí)驗(yàn)添加了無水硫酸鈉稀釋液以保持包封率.在此操作過程中，僅需控制無水硫酸鈉的濃度和凝聚溫度兩個(gè)條件即可實(shí)現(xiàn)包裹，與復(fù)凝聚法比較，單凝聚法操作方法簡單方便，操作周期短.

圖3 GE、TTEO和TTEO/GE微膠囊的紅外色譜圖 Fig.3 The FTIR spectra of GE,TTEO and TTEO/GE

2.3 TG/DSC分析

在成功制備TTEO/GE微膠囊的基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步研究其熱釋放性能，本研究首先進(jìn)行了熱重和熱差測試.如圖4所示，圖(a)為TTEO的熱重和熱差曲線圖，由曲線形貌判斷有物質(zhì)因吸熱產(chǎn)生氣體，TG曲線顯示TTEO的失重范圍為104.3～219.5 ℃，總失重量為83.3%，按照10 ℃/min的升溫速率計(jì)算，在此范圍內(nèi)平均重量變化率為7.2%/min，DSC曲線顯示在206～217 ℃范圍內(nèi)，有一個(gè)明顯的吸熱峰，推測在此溫度范圍內(nèi)，TTEO的失重率最大.圖(b)為TTEO/GE微膠囊的熱重和熱差曲線圖，TG顯示TTEO/GE微膠囊的失重范圍為129.8～452.4℃，總失重為64.3%，平均失重速率為2.0%/min.TTEO/GE微膠囊較TTEO的失重溫度范圍和失重溫度提高，在同等升溫速率下，平均失重速率由7.2%/min降至2.0%/min，以上結(jié)果表明TTEO/GE微膠囊的熱穩(wěn)定性不僅增加，而且在一定升溫速率下，其中的TTEO釋放速率降低，有效延長了釋放時(shí)間.

(a)茶樹油 (b)茶樹精油微膠囊注：黑線為TG，紅線為DSC圖4 茶樹精油微膠囊和茶樹精油熱重、熱差曲線Fig 4 TG/DSC curve of TTEO and TTEO/GE

2.4 熱分解分析

通過單凝聚法制備的TTEO/GE微膠囊熱失重范圍增加，為進(jìn)一步研究其熱穩(wěn)定性和熱釋放性，本研究測試了不同溫度點(diǎn)釋放的化學(xué)成分變化.有別于傳統(tǒng)聯(lián)機(jī)熱裂解儀，本課題組研發(fā)了離線熱分解罐.根據(jù)TG/DSC曲線，選取100 ℃、200 ℃、300 ℃、400 ℃和500 ℃作為釋放溫度，收集釋放的化學(xué)成分，通過GC-MS進(jìn)行測試，結(jié)果如圖5和表1所示.

圖5 茶樹精油微膠囊在不同溫度的熱釋放產(chǎn)物Fig.5 HR- GC-MS curve of TTEO/GE at different temperatures

表1 茶樹精油微膠囊熱裂解主要產(chǎn)物Tab.1 Pyrolysis product of TTEO/GE at different temperature

100 ℃、200 ℃、300 ℃、400 ℃和500 ℃下TTEO/GE微膠囊熱釋放的主要化學(xué)成分為蒈烯(Carene)、萜品烯(Terpinene)、異松油烯(Terpinolene)和4-萜品醇(4-Terpineol)等成分，此結(jié)果與文獻(xiàn)[3-4]報(bào)道相符，但其含量隨溫度升高而有明顯變化.在100 ℃時(shí)，蒈烯和萜品烯的含量分別為30.18%和41.08%，沒有發(fā)現(xiàn)4-萜品醇.當(dāng)溫度升高至200 ℃、300 ℃、400 ℃和500 ℃時(shí)，蒈烯含量降至20.98%～19.73%，萜品烯的含量降至33.49%～29.90%，4-萜品醇的含量升至18.62%.以上結(jié)果說明，茶樹精油被明膠包裹后，蒈烯、萜品烯和4-萜品醇在200～500 ℃ 范圍內(nèi)均可釋放，其熱釋放溫度范圍擴(kuò)寬，熱穩(wěn)定性增強(qiáng).此結(jié)論與TG/DSC測試結(jié)果一致.在100 ℃時(shí)，均釋放了定量蒈烯和萜品烯，推測有部分蒈烯和萜品烯殘留在TTEO/GE微膠囊的表面或縫隙中，低溫釋放出來.

3 結(jié) 論

通過熱重分析(TG/DSC)和熱緩釋-氣相色譜質(zhì)譜(HR/GC-MS)對茶樹油單壁微膠囊的穩(wěn)定性和熱釋放行為進(jìn)行了研究，得到如下結(jié)論：

1) 本研究采用單凝聚法制備了TTEO/GE微膠囊，通過加入高濃度無機(jī)鹽，降低體系中GE溶解度，使之凝聚成囊，從而形成單壁TTEO/GE微膠囊，操作過程簡單，影響因素較少，易擴(kuò)大化生產(chǎn).

2) 采用過IM、SEM和FTIR對所得TTEO/GE微膠囊的形貌和包合效應(yīng)進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)TTEO/GE微膠囊為單層壁材，呈光滑球狀，粒徑為10～30 μm.基于成功制備TTEO/GE微膠囊基礎(chǔ)上，通過TG/DSC和HR- GC-MS熱釋放行為研究，發(fā)現(xiàn)TTEO被明膠包裹后，其中的主要成分蒈烯、萜品烯和4-萜品醇在200～500℃范圍內(nèi)均可釋放，相比較TTEO，TTEO/GE微膠囊的熱失重速率從7.2%/min降至2.0%/min，其熱釋放溫度范圍擴(kuò)寬，熱釋放成分不變，熱穩(wěn)定性增強(qiáng).以上研究結(jié)果為TTEO在熱加工食品方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).