范韋佟，廖彩岑，周 艷，劉 丹，李蓉濤，李洪梅

(昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500)

0 引 言

赤芍(Paeoniae Radix Rubra)來自毛茛科(Ranunculaceae)植物川赤芍(Paeonia veitchii)或芍藥(P.lactiflora)，根部入藥，具有清熱涼血，散瘀止痛的功效[1]，廣泛分布在我國云南、四川、西藏等地[2].研究表明，赤芍的化學(xué)成分包括萜類及其苷、黃酮及其苷，以及多種酚酸、揮發(fā)油等物質(zhì)，其中以蒎烷型單萜及其苷類為特征成分[3].赤芍中各種苷類化合物統(tǒng)稱芍藥總苷，是赤芍的主要活性成分[4].

赤芍作為中醫(yī)常用藥，應(yīng)用歷史悠久.現(xiàn)代藥理研究表明，赤芍的藥理活性包括保護肝臟、抗炎、抗腫瘤、保護心血管和神經(jīng)等作用[5].其中，向楚兵等[6]研究發(fā)現(xiàn)，赤芍的水煎液對二甲苯所致的小鼠耳廓急性炎癥有顯著抑制作用，楊琪偉等[7]發(fā)現(xiàn)赤芍的乙醇提取物對角叉菜膠致大鼠足趾腫脹有較好的抗炎效果.但現(xiàn)階段研究多集中于赤芍的提取物，對單體化合物的活性研究鮮有報道.一氧化氮 (NO) 是一種具有生物學(xué)調(diào)控作用的信使分子，在受到炎癥介質(zhì)刺激后會大量增加.利用檢測NO含量的方法可以對化合物的抗炎活性進行評價.為了從赤芍中尋找發(fā)揮抗炎作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本文對赤芍乙酸乙酯相的化學(xué)成分和NO抑制作用進行了系統(tǒng)研究.

1 實驗部分

1.1 藥材來源

藥材為赤芍切片，2021年4月采購于昆明新螺螄灣藥材市場 (鑒定人：昆明理工大學(xué)陳宣欽副教授)，標本 (No.KUMST20210406)現(xiàn)存放在昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院.

1.2 儀器設(shè)備和試劑材料

核磁共振儀(Bruker AV Ⅲ-600)用于核磁共振譜測定.Spectra Max M2多功能讀板機(Moleccular Devices公司)和CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermofisher公司)用于NO抑制實驗.硅膠(80～100和200～300目，青島海洋化工廠)和羥丙基葡聚糖凝膠(SephadexLH-20，Pharmacia公司)用于柱色譜分離和純化樣品.5%H2SO4-EtOH溶液(自配)用作顯色劑，噴灑后適當加熱.胎牛血清(Gibco公司)、DMEM培養(yǎng)基(Thermofisher公司)、青霉素和鏈霉素(上海源培生物科技有限公司)、MTT和DMSO(Solarbio公司)、L-NMMA(BeyoTime公司)、脂多糖(Sigma公司)用于NO抑制實驗.

1.3 分離流程

30 kg 赤芍藥材，先粉碎至一定粒徑，然后用95%EtOH/H2O室溫提取(3次)，第1次浸泡 48 h，第2次、第3次分別浸泡 24 h.將3次提取液合并，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮去除乙醇，浸膏利用EtOAc/H2O萃取(3次)，減壓回收乙酸乙酯后得乙酸乙酯相 690 g.乙酸乙酯相經(jīng)硅膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇(150∶1-0∶1)為流動相進行梯度洗脫，得到5個部分，即A-E.Fr.A經(jīng)反復(fù)柱層析分離純化得到化合物1(384.5 mg),2(80.6 mg),3(2.0 mg),4(20.0 mg),8(29.1 mg),9(3.7 mg)和10(3.0 mg).Fr.B經(jīng)反復(fù)柱層析分離純化得到化合物5(13.4 mg),6(2.4 mg),7(365.0 mg),11(9.8 mg),12(19.0 mg)和13(12.0 mg).化合物1-13的結(jié)構(gòu)如圖1所示.

圖1 從赤芍中分離得到的化合物1-13的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of compounds 1-13 isolated from Paeoniae Radix Rubra

1.4 抗炎活性評價

RAW 264.7細胞的培養(yǎng)條件：DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%青/鏈霉素雙抗溶液)、37 ℃、5% CO2.將對數(shù)生長期細胞接種于96孔板(3×104/孔)培養(yǎng) 24 h，然后加入待測化合物 (3.125-50 μM).實驗設(shè)置4個組，分別為模型組、實驗組、陽性對照組和空白組，每組分別設(shè)置3個復(fù)孔.于化合物處理 24 h 后收集細胞上清液，加入Griess試劑震蕩 10 min(避光)，利用酶標儀檢測波長 540 nm 處的吸光值，計算NO生成抑制率，并使用SPSS 20數(shù)據(jù)計算IC50值.

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1:C17H18O6,黃色油狀物.1H-NMR(600 MHz,methanol-d4):δH2.54(1H,d,J=12.0 Hz,Ha-2),2.78(1H,d,J=12.0 Hz,Hb-2),2.86(1H,brs,H-4),2.25(1H,dd,J=13.5,2.6 Hz,Ha-5),2.37-2.41(2H,overlap,Hb-5,H-7),4.25(1H,dd,J=11.4,6.1 Hz,Ha-8),4.04(1H,dd,J=11.3,8.8 Hz,Hb-8),5.41(1H,s,H-9),1.25(3H,s,CH3-10),8.00(2H,d,J=7.3 Hz,H-2′和6′),7.47(2H,t,J=7.7 Hz,H-3′和5′),7.60(1H,t,J=7.7 Hz,H-4′);13C-NMR(150 MHz,methanol-d4):δC78.7(s,C-1),46.7(t,C-2),211.1(s,C-3),46.4(d,C-4),34.1(t,C-5),101.4(s,C-6),43.0(d,C-7),62.8(t,C-8),99.5(d,C-9),20.5(q,C-10),129.7(s,C-1′),129.2(d,C-2′和6′),128.3(d,C-3′和5′),133.0(d,C-4′),166.2(s,C-7′).EI-MS:m/z319[M+H]+.以上波譜數(shù)據(jù)與paeoniflorigenone[8-9]數(shù)據(jù)一致.

化合物2:C10H14O2,無色油狀物.1H-NMR(600 MHz,methanol-d4):δH2.46(1H,t,J=5.8 Hz,H-1),5.92(1H,brs,H-3),2.60(1H,m,H-5),2.08(1H,d,J=9.3 Hz,Ha-6),2.92(1H,m,Hb-6),1.00(3H,s,CH3-8),1.53(3H,s,CH3-9),4.24(2H,m,H2-10);13C-NMR(150 MHz,methanol-d4):δC45.2(d,C-1),175.0(s,C-2),116.7(d,C-3),205.3(s,C-4),58.1(d,C-5),40.8(t,C-6),54.4(s,C-7),20.9(q,C-8),25.4(q,C-9),62.8(t,C-10).EI-MS:m/z166[M]+.以上波譜數(shù)據(jù)與(-)-10-hydroxyverbenone[10-11]數(shù)據(jù)一致.

化合物3:C10H16O2,無色油狀物.1H-NMR(600 MHz,methanol-d4):δH1.93(1H,t,J=3.7 Hz,H-1),5.85(1H,s,H-3),1.88(1H,d,J=17.1 Hz,Ha-5),2.61(1H,d,J=17.0 Hz,Hb-5),3.82(1H,dd,J=11.9,3.7 Hz,Ha-7),3.76(1H,dd,J=11.9,3.7 Hz,Hb-7),1.97(3H,s,CH3-8),1.06(3H,s,CH3-9),0.93(3H,s,CH3-10);13C-NMR(150 MHz,methanol-d4):δC53.3(d,C-1),164.3(s,C-2),126.1(d,C-3),201.5(s,C-4),47.9(t,C-5),34.8(s,C-6),60.1(t,C-7),22.7(q,C-8),25.9(q,C-9),28.0(q,C-10).EI-MS:m/z168[M]+.以上波譜數(shù)據(jù)與crocusatin C[12]數(shù)據(jù)一致.

化合物4:C10H14O3,白色粉末.1H-NMR(600 MHz,methanol-d4):δH1.39(1H,dd,J=5.5,3.7 Hz,Ha-3),1.57(1H,ddd,J=9.7,5.4,1.5 Hz,Hb-3),2.01(1H,brdd,J=9.5,3.5 Hz,H-4),2.35(1H,d,J=19.2 Hz,Ha-6),2.46(1H,dd,J=19.3,1.3 Hz,Hb-6),1.33(3H,s,CH3-7),4.03(1H,d,J=9.9 Hz,Ha-9),3.97(1H,d,J=9.9 Hz,Hb-9),1.43(3H,s,Me-10);13C-NMR(150 MHz,methanol-d4):δC85.6(s,C-1),53.2(s,C-2),13.3(t,C-3),33.1(d,C-4),212.5(s,C-5),48.7(t,C-6),19.2(q,C-7),74.4(s,C-8),79.3(t,C-9),25.1(q,C-10).ESI-MS:m/z183[M+H]+.以上波譜數(shù)據(jù)與paeonisothujone[13]數(shù)據(jù)一致.

化合物5:C10H14O4,白色粉末.1H-NMR(600 MHz,methanol-d4):δH2.48(1H,dd,J=10.9,7.1 Hz,Ha-2),2.02(1H,dd,J=14.0,11.0 Hz,Hb-2),4.99(1H,ddd,J=9.3,7.7,6.0 Hz,H-3),2.76(1H,ddd,J=10.4,7.4,3.9 Hz,H-4),2.92(1H,dd,J=16.2,7.5 Hz,Ha-5),2.53(1H,dd,J=15.0,2.0 Hz,Hb-5),2.37(1H,dd,J=13.9,6.1 Hz,H-7),1.21(3H,d,J=7.0 Hz,CH3-9),1.39(3H,s,CH3-10);13C-NMR(150 MHz,methanol-d4):δC74.6(s,C-1),41.1(t,C-2),73.3(d,C-3),38.6(d,C-4),36.3(t,C-5),210.4(s,C-6),43.0(d,C-7),179.2(s,C-8),12.5(q,C-9),23.5(q,C-10).EI-MS:m/z198[M]+.以上波譜數(shù)據(jù)與paeonilactone A[14]數(shù)據(jù)一致.

化合物6:C10H12O4,白色粉末.1H-NMR(600 MHz,methanol-d4):δH2.33(1H,dd,J=14.6,5.6 Hz,Ha-2),2.12(1H,dd,J=14.7,6.3 Hz,Hb-2),5.05(1H,m,H-3),3.73(1H,m,H-4),2.91(1H,dd,J=16.4,7.1 Hz,Ha-5),2.73(1H,dd,J=16.4,5.0 Hz,Hb-5),6.19(1H,d,J=2.7 Hz,Hb-9),5.71(1H,d,J=2.7 Hz,Ha-9),1.30(3H,s,CH3-10);13C-NMR(150 MHz,methanol-d4):δC74.8(s,C-1),39.8(t,C-2),72.3(d,C-3),38.0(d,C-4),37.4(t,C-5),209.7(s,C-6),138.9(s,C-7),170.4(s,C-8),121.1(t,C-9),23.2(q,C-10).EI-MS:m/z196[M]+.以上波譜數(shù)據(jù)與paeonilactone B[14]數(shù)據(jù)一致.

化合物7:C17H18O6,白色粉末.1H-NMR(600 MHz,CDCl3):δH2.64(1H,dd,J=14.1,6.0 Hz,Ha-2),1.95(1H,dd,J=14.1,10.4 Hz,Hb-2),4.98(1H,ddd,J=10.4,7.6,6.0 Hz,H-3),3.17(1H,m,H-4),2.92(1H,dd,J=16.3,7.8 Hz,Ha-5),2.79(1H,dd,J=15.1,5.2 Hz,Hb-5),2.81(1H,m,H-7),4.78(1H,dd,J=11.8,3.4 Hz,Ha-9),4.58(1H,dd,J=11.7,4.7 Hz,Hb-9),1.46(3H,s,CH3-10),3.71(1H,s,OH);13C-NMR(150 MHz,CDCl3):δC73.9(s,C-1),42.1(t,C-2),73.4(d,C-3),38.8(d,C-4),35.8(t,C-5),210.4(s,C-6),43.4(d,C-7),173.6(s,C-8),60.8(t,C-9),25.0(q,C-10),133.6(s,C-1′),129.7(d,C-2′和C-6′),129.0(d,C-3′和C-5′),128.6(d,C-4′),166.1(s,C-7′).EI-MS:m/z196[M-C6H5COOH]+.以上波譜數(shù)據(jù)與paeonilactone C[14]數(shù)據(jù)一致.

化合物8:C22H30O4,紅色粉末.1H-NMR(600 MHz,CDCl3):δH1.13(1H,td,J=13.2,4.0 Hz,Ha-1),1.96(1H,dt,J=13.0,3.6 Hz,Hb-1),1.66(1H,m,Ha-2),1.77(1H,m,Hb-2),3.30(1H,dd,J=11.7,4.6 Hz,H-3),0.89(1H,dd,J=12.2,2.1 Hz,H-5),1.73(1H,m,Ha-6),1.52(1H,td,J=13.2,4.0 Hz,Hb-6),1.71(1H,m,Ha-7),2.04(1H,m,Hb-7),2.06(1H,m,H-9),6.43(1H,dd,J=10.1,2.5 Hz,H-11),6.88(1H,dd,J=10.1,3.4 Hz,Ha-12),0.83(3H,s,CH3-18),0.93(3H,s,CH3-19),0.80(3H,s,CH3-28),1.03(3H,s,CH3-29),1.21(3H,s,CH3-30);13C-NMR(150 MHz,CDCl3):δC38.0(t,C-1),26.7(t,C-2),78.6(d,C-3),38.9(s,C-4),54.8(d,C-5),17.9(t,C-6),33.3(t,C-7),40.0(s,C-8),56.1(d,C-9),37.1(s,C-10),141.8(d,C-11),120.3(d,C-12),147.1(s,C-13),50.7(s,C-14),201.3(s,C-15),180.8(s,C-16),151.2(s,C-17),19.0(q,C-18),18.3(q,C-19),15.1(q,C-28),27.8(q,C-29),19.4(q,C-30).EI-MS:m/z358[M]+.以上波譜數(shù)據(jù)與芍藥二酮[15]數(shù)據(jù)一致.

化合物9:C10H10O3,棕色粉末.1H-NMR(600 MHz,methanol-d4):δH7.17(1H,d,J=2.0 Hz,H-2),6.85(1H,d,J=8.2 Hz,H-5),7.26(1H,dd,J=8.2,2.0 Hz,H-6),7.59(1H,d,J=15.7 Hz,H-7),6.66(1H,dd,J=15.7,7.9 Hz,H-8),9.57(1H,d,J=7.9 Hz,H-9),3.90(3H,s,OCH3);13C-NMR(150 MHz,methanol-d4):δC126.2(s,C-1),110.6(d,C-2),150.3(s,C-3),148.1(s,C-4),115.2(d,C-5),123.8(d,C-6),155.0(d,C-7),125.3(d,C-8),194.8(d,C-9),55.0(q,OCH3).EI-MS:m/z178[M]+.以上波譜數(shù)據(jù)與4-hydroxy-3-methoxycinnamaldehyde[16]數(shù)據(jù)一致.

化合物10:C10H12O4,白色粉末.1H-NMR(600 MHz,CDCl3):δH7.55(1H,s,H-2),6.98(1H,d,J=8.2 Hz,H-5),7.48(1H,d,J=8.2 Hz,H-6),5.13(1H,q,J=7.0 Hz,H-8),1.46(3H,d,J=7.0 Hz,CH3-9),3.98(3H,s,OCH3);13C-NMR(150 MHz,CDCl3):δC125.8(s,C-1),110.4(d,C-2),151.2(s,C-3),146.9(s,C-4),114.1(d,C-5),124.0(d,C-6),200.7(s,C-7),68.8(d,C-8),22.9(q,C-9),56.1(q,OCH3).EI-MS:m/z196[M]+.以上波譜數(shù)據(jù)與evofolin A[17]數(shù)據(jù)一致.

化合物11:C10H14O3,無色油狀.1H-NMR(600 MHz,methanol-d4):δH6.77(1H,s,H-2),6.70(1H,d,J=8.0 Hz,H-5),6.62(1H,d,J=8.0 Hz,H-6),2.69(1H,dd,J=13.4,6.6 Hz,Ha-7),2.55(1H,dd,J=13.4,6.5 Hz,Hb-7),1.31(1H,m,H-8),1.12(3H,d,J=6.2 Hz,CH3-9),3.83(3H,s,OCH3);13C-NMR(150 MHz,methanol-d4):δC130.4(s,C-1),112.6(d,C-2),147.3(s,C-3),144.4(s,C-4),114.6(d,C-5),121.5(d,C-6),44.8(t,C-7),68.7(d,C-8),21.4(q,C-9),54.9(q,OCH3).EI-MS:m/z182[M]+.以上波譜數(shù)據(jù)與1-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-2-丙醇[18]數(shù)據(jù)一致.

化合物12:C10H14O3,無色晶體.1H-NMR(600 MHz,methanol-d4):δH6.78(1H,s,H-2),6.71(1H,d,J=8.1 Hz,H-5),6.64(1H,d,J=8.1 Hz,H-6),2.60(2H,t,J=7.3 Hz,H-7),1.81(2H,m,H-8),3.57(2H,t,J=6.5 Hz,H-9),3.84(3H,s,OCH3);13C-NMR(150 MHz,methanol-d4):δC133.5(s,C-1),111.7(d,C-2),147.4(s,C-3),144.0(s,C-4),114.6(d,C-5),120.4(d,C-6),31.3(t,C-7),34.4(t,C-8),60.9(t,C-9),54.9(q,OCH3).ESI-MS:m/z181[M-H]-.數(shù)據(jù)比對發(fā)現(xiàn)，化合物12與二氫松柏醇[19]結(jié)構(gòu)一致.

化合物13:C20H24O5,黃色油狀物.1H-NMR(600 MHz,methanol-d4):δH7.46(1H,d,J=2.0 Hz,H-2),6.86(2H,d,J=8.3 Hz,H-5,H-5′),7.52(1H,dd,J=8.3,2.0 Hz,H-6),3.31(1H,m,H-8),1.20(3H,d,J=6.8 Hz,Me-9),6.65(2H,overlap,H-2′,H-6′),2.24(1H,dd,J=12.7,7.0 Hz,Ha-7′),2.72(1H,dd,J=12.7,3.7Hz,Hb-7′),2.13(1H,m,H-8′),0.85(3H,d,J=6.4 Hz,H-9′),3.72和3.87(6H,s,2×OCH3);13C-NMR(150 MHz,methanol-d4):δC129.3(s,C-1),110.6(d,C-2),147.8(s,C-3),151.8(s,C-4),123.2(d,C-5),114.5(d,C-6),204.4(s,C-7),44.6(d,C-8),16.7(q,C-9),54.7(q,OCH3),132.2(s,C-1′),121.2(d,C-2′),147.2(s,C-3′),144.1(s,C-4′),112.1(d,C-5′),114.4(d,C-6′),38.4(d,C-7′),38.6(t,C-8′),13.0(q,C-9′),55.0(q,OCH3).EI-MS:m/z344[M]+.以上波譜數(shù)據(jù)與cinnamophilin[20]數(shù)據(jù)一致.

2.2 抗炎活性評價

本文所采用的抗炎活性評價模型為脂多糖 (LPS) 誘導(dǎo)的RAW 264.7小鼠單核巨噬細胞體外炎癥模型，陽性對照為總一氧化氮合成酶抑制劑 (L-NMMA).化合物1-13的體外抗炎活性評價結(jié)果(見表1)顯示，化合物1,6,7和8對一氧化氮 (NO) 生成具有顯著抑制作用，活性強于陽性對照，IC50值分別為15.48、6.10、6.71和5.51 μM，具有較好的抗炎活性.

表1 化合物1,6-8和10的NO抑制活性Tab.1 Inhibition of NO production for compounds 1,6-8 and 10

3 結(jié) 論

本文對赤芍進行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，通過不同的分離材料和技術(shù)，結(jié)合現(xiàn)代波譜學(xué)方法，從中共分離鑒定了13個化合物，分別為paeoniflorigenone (1),(-)-10-hydroxyverbenone (2)，crocusatin C (3)，paeonisothujone (4)，paeonilactone A (5)，paeonilactone B (6)，paeonilactone C (7)，芍藥二酮 (8),4-hydroxy-3- methoxycinnamaldehyde (9)，evofolin A(10)，1-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-2-丙醇(11)，二氫松柏醇(12)和cinnamophilin (13).其中，化合物3和9-13為首次從該植物中分離得到.另外，化合物1,6-8和10對LPS誘導(dǎo)的NO生成具有顯著抑制作用，IC50值分別為15.48、6.10、6.71、5.51 和25.50 μM.該結(jié)果為赤芍的進一步開發(fā)利用奠定了理論依據(jù).