傅厚道，費明明,2，金 彤,2，胡 蔚,陳雪慧，余 靜，張 順,2

(1中國科學院大學寧波華美醫(yī)院·浙江 寧波 315000；2浙江省消化系統(tǒng)腫瘤診治及研究重點實驗室·浙江 寧波 315000)

肺癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，其死亡率位居所有癌癥之首[1]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占所有肺癌病例的80%～85%[2]。早期篩查的普及、手術與放化療技術的進步以及靶向治療藥物的相繼問世，提高了NSCLC的總體生存期，但對于失去了治愈機會的晚期NSCLC患者，其5年總生存率只有6%[3-5]。中醫(yī)藥在晚期NSCLC治療方面具有獨特的優(yōu)勢，能夠增強體能，提高生活質(zhì)量，延長總生存期，減少各種不良反應[6]。紅藍方(Honglan Decoction，HLD)是浙江省名中醫(yī)沈力基于腫瘤患者正虛邪實的病機特點[7]，以解毒攻邪、扶正抗癌為法創(chuàng)立的經(jīng)驗方，在減少放化療副反應、提高生存質(zhì)量、延緩疾病進展等方面獲得了較好療效，并使部分晚期患者能長期帶瘤生存[8]。本課題以人肺癌A549細胞系作為研究模型，觀察HLD體外對肺癌細胞增殖、周期和凋亡的影響，并檢測相關調(diào)控通路的因子變化，進而探討HLD治療NSCLC的可能分子生物學機制，為進一步的深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺癌細胞株A549：中國科學院上海細胞生物學研究所，SCSP-503。

紅藍方(HLD)：自制，水煎法制備，南方紅豆杉、絞股藍、浙貝母、白花蛇舌草、藤梨根、半枝蓮、枸杞子及杜仲等均組方藥味購自寧波明貝中藥業(yè)有限公司。F12培養(yǎng)基：Hyclone，SH30026.01B；胎牛血清：Gibco，10099-141；細胞周期檢測試劑盒：杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司，70-CCS012；細胞凋亡檢測試劑盒：BD，550911；BCA蛋白定量試劑盒：ThermoFisher，3227；CCK-8試劑盒：索萊寶，CA1210；活性氧檢測試劑盒：索萊寶，CA1410；線粒體膜電位檢測試劑盒：索萊寶，M8650；HRP-標記山羊抗兔：碧云天，A0208；所有抗體均購自CST公司：PAPR(5625)、Bcl-2(4223)、Mcl-1(94296)、P-Mcl-1(14765)、Bim(2993)、Bax(5023)、Bok(86875)、Noxa(14766)、β-actin(4970)。

1.2 儀器 RV 10 auto pro V旋轉蒸發(fā)儀：IKA；SpectraMax M5酶標儀：Molecular Devices；Axio Vert.A1熒光顯微鏡：Zeiss；蛋白質(zhì)電泳儀：Bio-Rad；Allegra X-12R離心機：Beckman。

1.3 方法

1.3.1 紅藍方水提液制備 紅藍方(HLD)：取南方紅豆杉6 g，絞股藍9 g，白花蛇舌草15 g，藤梨根15 g，半枝蓮15 g，山楂10 g。置于醫(yī)用不銹鋼鍋，浸泡過夜，加8 倍水煮沸30 min，倒出藥液，后加8 倍水煮沸20 min，再加5倍水煮沸20 min，將3 次藥液置于旋轉蒸發(fā)儀上80 ℃水浴中濃縮成約40 mL藥液，入真空干燥箱中干燥，得浸膏6 g，按100%濃度計算得率。取1 g紅藍方水提液浸膏，其中加入10 mL超純水，37 ℃水浴10 min，并于旋渦混合儀上混合助溶，充分溶解后，經(jīng)高速離心機1 200 r/min離心15 min，取上清液，再經(jīng)0.22μm微孔濾膜除菌，制成母液濃度100 g/L，置-80 ℃冰箱備用。

1.3.2 細胞活力和增殖能力檢測 CCK-8法。細胞5 000 個/孔接種于96 孔板中，設空白對照組、HLD組，每組6 個復孔。培養(yǎng)24 h后，HLD組按不同濃度加入(0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，CCK-8法檢測細胞活力。不同作用時間對A549細胞增殖的影響：細胞1 000 個/孔接種于96 孔板中。設空白對照組、HLD組，每組6 個復孔。培養(yǎng)24 h后，HLD組加入不同濃度方藥(1、2、4 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48 h后，CCK-8法檢測細胞活力。

1.3.3 細胞凋亡和周期的檢測 細胞傳代后貼壁過夜，實驗分為空白對照組、HLD組(1、2、4 g/L)，藥物處理24 h后，收集培養(yǎng)基中懸浮細胞以及貼壁的細胞并計數(shù)。細胞凋亡檢測：取1×106個細胞，加入5 μL AnnexinV-FITC混勻后，再加入5 μL Propidium Iodide混勻，對照組加入PBS，室溫避光孵育10 min，用流式細胞儀進行檢測。細胞周期檢測：取1×106個細胞，加入1 mL DNA staining solution和10 μL Permeabilization solution，渦旋振蕩5～10 s混勻。室溫避光孵育30 min。選擇最低上樣速度，流式細胞儀進行檢測。

1.3.4 細胞內(nèi)活性氧水平檢測 A549細胞用HLD(1、2、4 g/L)處理24 h，去除舊培養(yǎng)基，加入使用無血清培養(yǎng)基1∶1 000稀釋的DCFH-DA，37 ℃孵育20 min。用無血清細胞培養(yǎng)基洗滌細胞3 次，加入完全培養(yǎng)基，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。并用Image J軟件分析熒光強度。

1.3.5 細胞線粒體膜電位檢測 細胞用HLD(1、2、4 g/L)處理24 h，去除舊培養(yǎng)基。使用超純水和JC-1染色緩沖液配制JC-1染色工作液。加入1 mL完全培養(yǎng)基，加入1 mL JC-1染色工作液，充分混勻，37 ℃孵育20 min。用超純水和JC-1染色緩沖液配制洗滌液，冰浴。孵育結束后，使用洗滌液洗滌2次，加入2 mL完全培養(yǎng)基，熒光顯微鏡下觀察并拍照，并用Image J軟件分析熒光強度。

1.3.6 凋亡相關蛋白表達水平的檢測 Western Blot檢測。細胞用HLD(1、2、4 g/L)處理24 h，去除培養(yǎng)基，用預冷的PBS洗滌1 次，迅速加入蛋白裂解液，冰上放置20 min后超聲處理并提取總蛋白。所得蛋白樣品使用Western-blot檢測蛋白(PARP、Caspase-3、Bax、Bcl-2、Mcl-1、p-Mcl-1、BimEL、BimL、Bok、Noxa、β-actin)表達情況。曝光后的條帶使用image J軟件統(tǒng)計灰度，進行分析。

2 結果

2.1 HLD對A549細胞活力和增殖能力的影響 以不同濃度HLD處理24 h后，A549細胞活力隨著HLD濃度的增高而下降，IC50為4.8 g/L，見圖1A。以1、2、4 g/L的HLD處理6、12、24、48 h后，與空白對照組相比，不同濃度的HLD均抑制A549細胞增殖(P<0.001)，且抑制作用隨濃度升高和時間延長而增強。HLD能以時間和濃度依賴性的方式抑制肺癌A549細胞的增殖，見圖1 B。

圖1 各組A549細胞增殖的CCK-8檢測結果

2.2 HLD對A549細胞周期與凋亡的影響 不同濃度HLD處理A549細胞24 h，G2/M期細胞比例逐漸增加，說明HLD能將A549細胞周期阻滯在G2/M期；與空白對照組相比，不同濃度HLD均能誘導A549細胞的凋亡，且具有濃度依賴性。見圖2與表1。

表1 各組A549細胞周期占比及凋亡率比較

2.3 HLD對A549細胞內(nèi)活性氧水平的影響 熒光探針DCFH-DA本身不帶熒光，可自由穿過細胞膜，進入細胞后被脂酶水解成DCFH后不能穿透細胞膜。且DCFH可被細胞內(nèi)的活性氧氧化成有熒光的DCF，因此DCF的亮度代表細胞內(nèi)活性氧的水平，見圖3和表2。從圖3可見，隨著HLD濃度的增加，細胞內(nèi)的綠色熒光上升，表明細胞內(nèi)活性氧水平的上升，說明HLD能夠上調(diào)A549細胞內(nèi)活性氧水平。

圖3 HLD對A549細胞內(nèi)活性氧水平的影響

表2 各組A549細胞內(nèi)活性氧水平熒光強度比較

2.4 HLD對A549細胞線粒體膜電位的影響 JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位ΔΨm的熒光探針。在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，為JC-1單體，產(chǎn)生綠色熒光。使用紅綠熒光的相對比例能夠衡量線粒體去極化的比例，且線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的標志性事件，見圖4和表3。從圖5可見，隨著HLD處理濃度的增加，細胞內(nèi)紅綠熒光比例下降明顯，表明HLD能夠使細胞線粒體膜電位下降。

圖4 HLD對A549細胞線粒體膜電位的影響

表3 各組A549細胞內(nèi)JC-1熒光強度比較

2.5 HLD對A549細胞凋亡相關蛋白的調(diào)控作用 圖5可知，與空白對照組相比，不同濃度HLD組的凋亡標志蛋白Cleaved-PARP和Cleaved-Caspase-3蛋白均增加。線粒體途徑促凋亡蛋白BimL、Bax、Bok、Noxa升高，抗凋亡蛋白Bcl-2與磷酸化的Mcl-1水平降低，差異有統(tǒng)計學意義。

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

肺癌可歸屬于中醫(yī)“癥瘕”“積聚”范疇，基本病機為正虛邪實，以痰濕瘀毒為病理因素，以正虛為本，邪實為標[9-10]。臨證時雖因素體稟賦的差異和陰陽盛衰的偏頗導致具體的證候有所不同，但是在治療上仍要以補虛扶正和解毒抗癌兼顧為要。沈力主任醫(yī)師臨證五十載，學驗俱豐，其創(chuàng)立的紅藍方在增強放化療療效并減少毒副反應，預防腫瘤術后復發(fā)轉移，延緩疾病進展延長生存期等方面都取得了良好的療效。紅藍方中紅豆杉祛邪散結，絞股藍益氣補虛解毒，浙貝母、蛇舌草、藤梨根、半枝蓮清熱解毒，枸杞子、杜仲扶正固本，全方共奏扶正補虛益氣、解毒攻邪抗癌之效?，F(xiàn)代藥理研究顯示，紅豆杉水提物能促進肺癌細胞caspase-9/8/3及PARP的切割進而誘導其凋亡，且對正常細胞和組織影響很小[11]。絞股藍所含皂甙可以誘導體內(nèi)外NSCLC細胞凋亡，還能調(diào)節(jié)免疫[12-13]。蛇舌草及半枝蓮等藥物也在體內(nèi)外顯示出良好的抗腫瘤作用[14-15]。

對細胞死亡研究的深入發(fā)現(xiàn)了新的程序性死亡形式，包括自噬性死亡、鐵死亡、焦亡等，但目前的腫瘤臨床治療中，誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡仍然是治療起效的最主要機制[16]。線粒體途徑的凋亡由Bcl-2家族進行調(diào)控，后者分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白兩類。BimL、Bax、Bok、Noxa等屬于促凋亡蛋白，通過增加線粒體膜的通透性引發(fā)線粒體膜電位改變，并使細胞色素C和ROS從線粒體釋放，激活Caspase的級聯(lián)反應，最終切割并活化“凋亡執(zhí)行者”Caspase-3，對PARP等維持細胞存活的蛋白進行水解，使細胞進入凋亡的不可逆階段，而Bcl-2與Mcl-1屬于抗凋亡蛋白，通過拮抗促凋亡蛋白的功能，防止凋亡的發(fā)生。

本文結果顯示，經(jīng)HLD處理后A549細胞增殖減慢，凋亡增加，ROS水平上升，線粒體途徑促凋亡因子BimL、Bax、Bok、Nox上調(diào)，抗凋亡因子Bcl-2與P-Mcl-1下調(diào)，Caspase-3和PARP-1切割增加；表明HLD通過線粒體途徑誘導A549細胞發(fā)生凋亡。綜上，紅藍方以濃度和時間依賴的方式通過線粒體途徑誘導A549細胞發(fā)生凋亡，本文結果為紅藍方進一步的臨床和基礎研究提供基礎。