史慧君，董文麗，郭妍婷，袁圓圓，陳俊貞，楊 莉，冉多良，付 強

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)屬于黃病毒科()瘟病毒屬()，是一種線性、單股、正鏈、RNA病毒。該病毒不僅感染牛羊等家畜，在鹿、駱駝等野生動物中也有感染的報道，常造成高熱、腹瀉、白細胞減少、黏膜病、繁殖機能障礙和免疫抑制等，也會造成孕畜流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、產(chǎn)木乃伊胎和畸形胎。早期妊娠母畜感染NCP型BVDV后會生產(chǎn)持續(xù)性感染的犢牛，即PI牛，終生帶毒并不定期排毒，成為BVDV的重要傳染源。

哺乳動物的信號肽酶復(fù)合體由信號肽酶復(fù)合體亞基1(signal peptidase complex subunit 1，SPCS1)、SPCS2、SPCS3、SEC11A和SEC11C 5個亞基組成，其中SPCS1是微粒體信號肽酶復(fù)合物的重要組成部分，負責(zé)裂解許多分泌型和膜相關(guān)蛋白的細胞信號肽。SPCS1是影響西尼羅病毒(WNV)、日本腦炎病毒(JEV)、丙型肝炎病毒(HCV)、登革熱病毒(DENV)、寨卡病毒(ZIKV)、黃熱病病毒(YFV)等復(fù)制的重要宿主因子。Zhang等通過CRISPR/Cas9全基因組文庫篩選發(fā)現(xiàn)SPCS1對黃病毒科病毒的結(jié)構(gòu)蛋白切割和具有感染性病毒的產(chǎn)生等具有重要的作用。通過RNA干擾或CRISPR/Cas9敲低SPCS1表達將顯著性降低JEV、WNV、DENV、ZIKV、YFV和HCV等子代病毒的產(chǎn)生。BVDV與上述病毒同屬于黃病毒科，但BVDV復(fù)制是否受到SPCS1的影響，目前尚未有報道。本文利用CRISPR/Cas9敲低SPCS1蛋白，BVDV感染SPCS1敲低細胞后，使用熒光定量PCR定量BVDV 5′ 非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)mRNA水平、免疫熒光染色檢測BVDV雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)量、觀察BVDV感染致細胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)和測定子代病毒滴度等研究SPCS1對BVDV復(fù)制的影響，為BVDV的防控研發(fā)和感染機制的探究等提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒和質(zhì)粒

牛腎細胞(Madin-Darby bovine kidney cell，MDBK)、人胚腎細胞(human embryonic kidneys-293T，HEK-293T)購自上海細胞庫，BVDV TC毒株由本學(xué)院傳染病實驗室冉多良教授惠贈，該毒株為CP型、1b亞型，大腸桿菌感受態(tài)細胞Stbl3購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司，lentiCRISPR v2(52961)、pSPAX2(12260)和pMD2.G (12259)購自Addgene公司。

1.2 主要試劑和儀器

胎牛血清、馬血清、TRIzol、嘌呤霉素、聚凝胺、明膠、T4 DNA ligase購自Thermo Fisher Scientific，ECL顯色試劑盒、Western細胞裂解液、牛血清白蛋白BSA、Triton X-100、抗熒光淬滅劑和山羊血清購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，B I購自NEB公司，線性聚醚酰亞胺PEI(MW 40 000)購自美國Polysciences公司，核酸染料SYBR Green I和cDNA第一條鏈合成試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，鼠抗dsRNA J2單克隆抗體(貨號10010200)購自SCICONS公司，CoraLite488偶聯(lián)山羊抗鼠IgG(H+L)(貨號SA00013-1)、兔抗SPCS1多克隆抗體(貨號11847-1-AP)和HRP偶聯(lián)山羊抗兔IgG(H+L)(貨號SA00001-2)購自Proteintech公司，超微量分光光度計(Onedrop)購自南京五義科技有限公司，實時熒光定量PCR儀(7500 Fast)購自Applied Biosystems公司，激光共聚焦顯微鏡(LSM 510)購自ZEISS公司。

1.3 sgRNA設(shè)計

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中1基因(Gene ID：511453)序列，結(jié)合CHOPCHOP和Benchling等平臺，設(shè)計靶向1基因的sgRNA和陰性對照Scramble sgRNA，具體序列信息見表1，sgRNA由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 sgRNA的序列信息

1.4 sgRNA融合和克隆

sgRNA融合、sgRNA插入慢病毒載體lentiCRISPR v2、轉(zhuǎn)化、測序鑒定等參照Sanjana等報道，構(gòu)建成lentiCRISPR v2-SPCS1/Scramble sgRNA質(zhì)粒。

1.5 慢病毒包裝、感染和陽性細胞篩選

在6孔細胞培養(yǎng)板用0.1%明膠溶液包被30 min， 接種5×10個·孔HEK-293T細胞，待細胞密度約90%時，每孔加入2 μg lentiCRISPR v2-SPCS1/Scramble sgRNA、2 μg pSPAX2、1 μg pMD2.G和15 μL PEI，具體轉(zhuǎn)染步驟參照胡新艷等報道，轉(zhuǎn)染48 h收集慢病毒懸液，8 000 r·min離心5 min， 收集上清并用0.45 μm濾器過濾，獲得SPCS1 sgRNA和Scramble sgRNA慢病毒。取2 mL慢病毒懸液加入2 mL MDBK細胞(約5×10個)，混勻后加入4 μL聚凝胺(8 mg·mL)，置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，更換新鮮的細胞培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用終濃度為2 mg·mL的嘌呤霉素篩選陽性細胞，連續(xù)篩選5代次后，獲得SPCS1 KD和Scramble陽性細胞。

1.6 檢測SPCS1蛋白表達水平

分別收集5×10個SPCS1 KD和Scramble陽性細胞，1 000 r·min離心5 min，棄掉培養(yǎng)液后加入500 μL 含終濃度為1 mmol·LPMSF的RIPA裂解液，混勻后置于冰上靜置10 min，12 000 r·min4 ℃ 離心10 min，收集上清，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白濃度。分別取60 μg總蛋白進行Western blot檢測，一抗使用兔抗SPCS1多克隆抗體(1∶500稀釋)，二抗使用HRP偶聯(lián)山羊抗兔IgG(H+L)抗體(1∶5 000稀釋)，具體步驟參照胡新艷等文獻。

1.7 檢測SPCS1 KD細胞活性

將Scramble和SPCS1 KD細胞消化后計數(shù)，接種10個·孔的細胞于6孔細胞培養(yǎng)板中，各孔加入2 mL細胞培養(yǎng)液后，置于相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，分別在接種后12、24、36、48和72 h時，使用胰酶消化后加入臺盼藍溶液對細胞進行染色，活細胞計數(shù)，每個時間點平行重復(fù)計數(shù)4個孔。

1.8 熒光定量PCR檢測BVDV mRNA水平變化

分別接種相同數(shù)量的Scramble和SPCS1 KD細胞至6孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)8 h后感染10 000 TCID的BVDV，孵育2 h后更換成細胞維持液(5%馬血清+DMEM)；按照BVDV感染12、24、36和48 h后收集細胞及培養(yǎng)液，TRIzol裂解液處理細胞并提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄1 μg RNA成cDNA，利用熒光定量PCR檢測BVDV 5′UTR mRNA水平。熒光定量PCR引物、反應(yīng)體系及條件、標(biāo)準(zhǔn)曲線參照田瑞鑫等報道。

1.9 免疫熒光染色檢測BVDV dsRNA量

將單個細胞爬片放入24孔板中，用0.1%明膠溶液包被處理30 min后，分別接種相同數(shù)量的Scramble和SPCS1 KD細胞，BVDV感染步驟和感染時間同“1.8”；感染不同時間后收集細胞并依次使用4%多聚甲醛和0.5% Triton X-100處理細胞20 min； 加入新鮮配制的封閉液(0.5% Triton X-100、1% BSA、1%山羊血清)封閉1 h；加入1∶1 200稀釋的兔抗dsRNA mAb J2溶液，置于4 ℃孵育過夜；次日加入1∶200稀釋的CoraLite488偶聯(lián)山羊抗兔IgG(H+L)溶液，置于常溫靜置2 h；使用抗熒光淬滅劑封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察和分析綠色熒光標(biāo)記的dsRNA分布和熒光量。

1.10 觀察BVDV感染細胞CPE變化

用胰酶消化Scramble和SPCS1 KD細胞并進行細胞計數(shù)后，接種相同數(shù)量的細胞至6孔細胞培養(yǎng)板中，BVDV感染步驟和感染時間同“1.8”；感染不同時間后使用倒置顯微鏡觀察CPE變化。

1.11 測定子代病毒TCID50

細胞接種方法、病毒感染和感染時間等步驟同“1.8”，感染不同時間后反復(fù)凍融3次，收集病毒懸液后6 000 r·min4 ℃離心3 min，棄細胞沉淀后將病毒進行倍比稀釋，最終稀釋度為10、10、10……10，分別接種至細胞密度約70%的MDBK細胞中，每個稀釋度做8個重復(fù)試驗，孵育2 h后更換成5%馬血清的細胞維持液，繼續(xù)培養(yǎng)4～5 d觀察CPE情況，統(tǒng)計半數(shù)及以上細胞發(fā)生CPE的孔數(shù)，使用Reed-Muench法計算子代病毒TCID。

1.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié) 果

2.1 Western blot鑒定SPCS1蛋白敲低情況

用Western blot檢測SPCS1 KD細胞中SPCS1蛋白表達情況，同時使用細胞計數(shù)法檢測活細胞數(shù)量。結(jié)果如圖1所示，與對照Scramble的SPCS1蛋白表達量相比，SPCS1 KD細胞中的SPCS1蛋白表達量顯著性降低，表明成功獲得SPCS1敲低的細胞SPCS1 KD。與Scramble對照細胞相比，SPCS1 KD細胞的活性并未發(fā)生顯著性差異(圖2)，表明SPCS1敲低未影響MDBK細胞活性，為后續(xù)研究提供材料。

圖1 Western blot檢測SPCS1蛋白表達Fig.1 Western blot detection of SPCS1 protein expression

圖2 細胞活性檢測Fig.2 Detection of cell activity

2.2 熒光定量PCR檢測BVDV 5′UTR mRNA表達情況

熒光定量PCR檢測BVDV感染Scramble和SPCS1 KD細胞不同時間后BVDV 5′UTR mRNA表達情況。結(jié)果如圖3所示，BVDV感染SPCS1 KD細胞后，與對照Scramble相比，BVDV 5′ UTR mRNA的水平在不同時間段內(nèi)都極顯著下降(<0.01)，最高降低93.1%(BVDV感染48 h時)，表明敲低SPCS1顯著性影響B(tài)VDV mRNA復(fù)制。

2.3 免疫熒光染色檢測BVDV dsRNA量

SPCS1 KD和Scramble細胞感染BVDV不同時間后，免疫熒光染色檢測BVDV dsRNA量變化。結(jié)果如圖4所示，BVDV感染SPCS1 KD細胞不同時間后，與對照細胞Scramble相比，SPCS1 KD細胞中的綠色熒光明顯減少，表明BVDV dsRNA積累顯著性減少，證明敲低SPCS1會抑制BVDV的復(fù)制。

**.P<0.01圖3 熒光定量PCR檢測BVDV 5′UTR mRNA水平Fig.3 Detection of BVDV 5′UTR mRNA levels by real-time quantitative PCR

圖4 免疫熒光染色檢測BVDV dsRNA量(630×)Fig.4 Immunofluorescence staining to detect the amount of BVDV dsRNA (630×)

2.4 檢測BVDV感染后CPE情況

在Scramble和SPCS1 KD細胞中感染BVDV不同時間后，倒置顯微鏡下觀察BVDV感染不同細胞后致細胞CPE變化情況。結(jié)果如圖5所示，Scramble細胞感染BVDV 24 h后，細胞形態(tài)發(fā)生變化，呈現(xiàn)典型的CPE現(xiàn)象，如細胞聚集、變圓、皺縮、脫落死亡等，Scramble細胞被感染48 h時大部分發(fā)生細胞脫落；與Scramble細胞相比，BVDV感染SPCS1 KD細胞12、24、36 h時細胞的CPE不明顯，BVDV感染48 h時細胞才出現(xiàn)較弱的CPE。結(jié)果表明SPCS1敲低阻止BVDV復(fù)制，減少細胞內(nèi)BVDV數(shù)量，從而導(dǎo)致被感染的細胞CPE現(xiàn)象減弱。

圖5 BVDV感染不同時間段CPE情況Fig.5 CPE in different time periods of BVDV infection

2.5 子代病毒滴度測定

Reed-Muench法測定BVDV感染Scramble和SPCS1 KD細胞后不同時間段子代病毒滴度變化情況。結(jié)果顯示，BVDV感染SPCS1 KD細胞后24、36和48 h時與Scramble細胞相比，SPCS1 KD細胞的子代病毒滴度顯著性降低(<0.01)，BVDV感染48 h時子代病毒滴度降低最多，下降95.8%，表明SPCS1基因敲低影響B(tài)VDV胞內(nèi)復(fù)制，降低子代病毒顆粒的數(shù)量。

圖6 BVDV感染不同時間段子代病毒滴度測定Fig.6 Determination of viral titers of progeny in different time periods of BVDV infection

3 討 論

SPCS1與SPCS2、SPCS3、SEC11A和SEC11C等5個亞基，共成組成信號肽酶復(fù)合體。SPCS1在WNV、HCV、ZIKV、YFV、DENV和JEV等黃病毒科病毒復(fù)制過程中發(fā)揮重要的作用。Suzuki等報道發(fā)現(xiàn)SPCS1能與HCV結(jié)構(gòu)蛋白E2和非結(jié)構(gòu)蛋白NS2相互作用，進而影響膜相關(guān)的E2-NS2復(fù)合物產(chǎn)生，參與HCV包裝釋放等復(fù)制環(huán)節(jié)。Ma等研究發(fā)現(xiàn)SPCS1與JEV非結(jié)構(gòu)蛋白NS2B的兩個跨膜結(jié)構(gòu)域NS2B(1—49)和NS2B(84—131)相互作用，從而介導(dǎo)SPCS1與NS2B相互作用，影響JEV蛋白的翻譯后加工和病毒體的裝配。而同屬于黃病毒科的BVDV的復(fù)制是否也受SPCS1調(diào)控？本研究通過CRISPR/Cas9敲低SPCS1蛋白，結(jié)合熒光定量PCR、免疫熒光染色、CPE觀察和子代病毒滴度測定等發(fā)現(xiàn)，敲低SPCS1通過降低BVDV 5′UTR mRNA水平，減少dsRNA量，BVDV感染造成的CPE現(xiàn)象也有所減弱，降低子代病毒水平來抑制BVDV的復(fù)制，表明SPCS1敲低影響B(tài)VDV復(fù)制，進而證明SPCS1在BVDV復(fù)制過程中起到重要的作用。本研究進一步證明SPCS1在黃病毒科病毒復(fù)制的重要作用，SPCS1有望成為黃病毒科病毒防控的重要藥物靶點。

本課題組使用蛋白鄰近標(biāo)記技術(shù)篩選與BVDV離子通道蛋白p7互作的蛋白，這些蛋白可能參與到BVDV p7蛋白翻譯、折疊、加工、修飾、轉(zhuǎn)運、聚合等形成過程，經(jīng)基因編輯后發(fā)現(xiàn)SPCS1敲低顯著性影響B(tài)VDV復(fù)制，降低BVDV子代病毒顆粒的形成，表明SPCS1蛋白參與BVDV復(fù)制過程。黃病毒科p7蛋白與NS2蛋白共定位于宿主細胞膜，輔助病毒入侵和釋放。SPCS1蛋白是否影響p7和NS2蛋白共定位、互作和聚合成復(fù)合物等，尚不清楚，亟待研究探索。

4 結(jié) 論

使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲低SPCS1后顯著性影響B(tài)VDV復(fù)制。