劉偉，孫彥

（天津大學(xué)化工學(xué)院系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300350）

引 言

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是最常見的神經(jīng)退行性疾病之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康，給社會(huì)和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界范圍內(nèi)約有5000萬人受AD的影響，我國(guó)約有600 萬的AD 患者，預(yù)計(jì)到2050 年全世界患病人數(shù)將達(dá)1.52 億[1]。因此亟需開發(fā)能夠治愈AD 的藥物或手段。臨床上，AD 患者表現(xiàn)為認(rèn)知能力的下降、記憶力的衰退、情緒和性格的改變、語言功能障礙等。AD 的致病原因較為復(fù)雜，各種因素均能誘發(fā)AD，宏觀上有年齡、基因、病毒感染、糖尿病、腦部創(chuàng)傷等因素；微觀層面如Tau蛋白過磷酸化、淀粉樣蛋白(amyloid β-protein, Aβ)的沉積、金屬離子穩(wěn)態(tài)失衡等[2]。其中，Aβ 級(jí)聯(lián)假說受到了廣泛的研究和認(rèn)可[3-5]。Aβ 級(jí)聯(lián)假說認(rèn)為，細(xì)胞外Aβ 病理性的沉積是引發(fā)神經(jīng)損傷的關(guān)鍵因素。Aβ 單體能夠自發(fā)聚集形成纖維狀的聚集體，并在其纖維化的過程中產(chǎn)生大量異質(zhì)的寡聚體。Aβ 寡聚體和纖維對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性，導(dǎo)致突觸功能受損，從而引發(fā)功能性障礙。因此，調(diào)控Aβ 的聚集已成為治愈AD的關(guān)鍵。

近年來，在Aβ 聚集及其調(diào)控方面已進(jìn)行了廣泛的研究[6]，但由于Aβ 聚集過程呈現(xiàn)復(fù)雜的多尺度性，目前對(duì)寡聚體結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)尚不充分，因此制約著Aβ 聚集抑制劑的開發(fā)。為此本文綜述了以Aβ 聚集及其調(diào)控為核心的相關(guān)介尺度過程。首先，簡(jiǎn)要介紹Aβ 的產(chǎn)生和聚集過程以及與介尺度科學(xué)的關(guān)系。隨后，按照不同的分類標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)總結(jié)Aβ 聚集過程中產(chǎn)生的各種介尺度寡聚體，以及Aβ 寡聚體的細(xì)胞損傷機(jī)制。然后，對(duì)目前廣泛研究的Aβ 抑制劑，如小分子類、多肽類、蛋白類、納米類抑制劑進(jìn)行歸納和闡述。最后，討論AD 治療以及Aβ 抑制劑目前存在的挑戰(zhàn)和需要重點(diǎn)研究的方向。本綜述將不僅增強(qiáng)對(duì)介尺度結(jié)構(gòu)的共性認(rèn)識(shí)，更為設(shè)計(jì)有效的Aβ 聚集抑制劑乃至治愈AD 提供參考。

1 Aβ的產(chǎn)生和聚集過程

Aβ 多肽由淀粉樣前體蛋白(Aβ precursor protein, APP)水解切割得到。APP 存在于谷氨酸能神經(jīng)元表面，含695～770個(gè)氨基酸殘基，在維持突觸可塑性、神經(jīng)元正常的生理功能方面具有重要作用。在淀粉樣生成途徑中，APP經(jīng)β-分泌酶和γ-分泌酶的水解，產(chǎn)生39～43 個(gè)氨基酸殘基的Aβ 片段；而在非淀粉樣生成途徑中，由于APP會(huì)經(jīng)α-分泌酶的水解，因此不會(huì)產(chǎn)生Aβ 片段（圖1）[7]。在大腦內(nèi)，Aβ40占80%～90%，而Aβ42占5%～10%。由于Aβ42比Aβ40多含有2 個(gè)疏水性的氨基酸，因此，Aβ42具有更高的聚集傾向。此外由Aβ42聚集所產(chǎn)生寡聚體的細(xì)胞毒性也比Aβ40大。在正常生理?xiàng)l件下，Aβ能被胰島素降解酶和腦啡肽酶降解；未被降解的Aβ 會(huì)穿越血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)[8]。Aβ 單體具有一定的生理活性，能保護(hù)成熟的神經(jīng)元免受興奮性毒性死亡，還能夠調(diào)節(jié)電壓門控鉀通道。但是Aβ 一旦發(fā)生聚集，會(huì)產(chǎn)生較大的神經(jīng)毒性，誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡。

研究表明，Aβ 的聚集過程符合“核依賴聚集動(dòng)力學(xué)”，根據(jù)表征聚集體中β-sheet 含量的硫黃素T(thioflavin T, ThT)熒光實(shí)驗(yàn)可將聚集過程分為成核期、生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期三個(gè)階段[9]。聚集始發(fā)于Aβ 單體的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。首先是Aβ 單體暴露出疏水性的基團(tuán)，兩個(gè)單體之間通過自身識(shí)別位點(diǎn)經(jīng)二聚化作用結(jié)合到一起，形成反平行β-sheet 結(jié)構(gòu)的二聚體(dimer)[10]。二聚體不斷發(fā)生構(gòu)象的轉(zhuǎn)變，和其他單體或者二聚體通過疏水和氫鍵作用組裝形成亞穩(wěn)態(tài)的寡聚體，并形成“聚集核”，此過程被稱為初級(jí)成核(primary nucleation)過程。隨后，以上述形成的“聚集核”作為單體或寡聚體結(jié)合的模板，聚集形成大量的原纖維，從而進(jìn)入聚集加速的生長(zhǎng)期。在生長(zhǎng)階段，聚集體的β-sheet 結(jié)構(gòu)快速增加。最后，進(jìn)入穩(wěn)定期，形成大量成熟的Aβ 纖維[11]。此外，形成的原纖維或者纖維聚集體會(huì)斷裂形成新的碎片，這些碎片化的纖維能作為新的“聚集核”，促進(jìn)Aβ 寡聚體的富集并加速Aβ 的聚集，此過程被稱為二次成核(secondary nucleation)過程（圖1）。雖然Aβ 的纖維化大致符合上述聚集路徑，但是具體聚集的分子機(jī)理不僅與Aβ 亞型相關(guān),還與初始結(jié)構(gòu)、溶解度等多種因素有關(guān)[12]。

上述Aβ聚集反應(yīng)是包含多種結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性生物反應(yīng)過程，屬于介尺度科學(xué)的研究范疇。如圖1所示，Aβ的聚集經(jīng)歷了單體的構(gòu)象轉(zhuǎn)換，多種不同分子量、形態(tài)結(jié)構(gòu)寡聚體的形成，以及最終的成核并生長(zhǎng)為纖維的過程。其中單體為單元尺度，核和纖維為系統(tǒng)尺度，而不同的Aβ中間體則是介于單元與系統(tǒng)尺度之間的介尺度[13]。Aβ聚集過程是多種介尺度結(jié)構(gòu)競(jìng)爭(zhēng)與協(xié)調(diào)共同作用的結(jié)果，且Aβ中間體形態(tài)的多樣性、結(jié)構(gòu)的多尺度性以及反應(yīng)的多變性導(dǎo)致Aβ聚集研究的復(fù)雜性[14]。為此，亟需解析蛋白質(zhì)聚集過程中耦合連接的關(guān)鍵介尺度結(jié)構(gòu)、闡明Aβ介尺度結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律、建立Aβ聚集的介尺度動(dòng)態(tài)模型，以針對(duì)性地調(diào)控關(guān)鍵介尺度結(jié)構(gòu)的形成，從而實(shí)現(xiàn)Aβ聚集的調(diào)控以及AD治療的目標(biāo)。

圖1 Aβ產(chǎn)生和聚集過程中的介尺度科學(xué)問題Fig.1 Schematic illustration of mesoscience in the production and aggregation of Aβ

2 介尺度Aβ寡聚體的分類及其性質(zhì)

與其他復(fù)雜性系統(tǒng)類似，盡管Aβ 聚集過程呈現(xiàn)出不同的層次，但每個(gè)層次的邊界尺度上系統(tǒng)的行為相對(duì)簡(jiǎn)單，易于表征和分析[13]。如聚集的初始條件為在體內(nèi)累積大量的Aβ 單體，聚集的最終狀態(tài)是形成富含β-sheet 結(jié)構(gòu)的纖維狀A(yù)β 聚集體。而在它們之間的介尺度層次上，系統(tǒng)性行為非常復(fù)雜，缺乏成熟的理論描述。因此對(duì)于介尺度Aβ 寡聚體結(jié)構(gòu)與行為的定量描述與調(diào)控是介尺度科學(xué)研究的核心問題，也是耦合Aβ 聚集過程多尺度問題的關(guān)鍵之處。但目前的實(shí)驗(yàn)手段很難對(duì)Aβ 聚集過程中介尺度寡聚體結(jié)構(gòu)進(jìn)行精確的描述，因此難以闡明介尺度結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)形成的機(jī)理?，F(xiàn)階段對(duì)介尺度Aβ 寡聚體的研究呈現(xiàn)出顯著的跨學(xué)科、跨領(lǐng)域特征，目前主要通過生物物理學(xué)技術(shù)、成像手段、計(jì)算機(jī)模擬等方法進(jìn)行模糊的描述，且結(jié)果具有很大的局限性。其中常見的分析方法有通過分子量大小進(jìn)行區(qū)分的SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)；根據(jù)Aβ 寡聚體半徑大小區(qū)分的尺寸排阻色譜(size-exclusion chromatography, SEC)；成像技術(shù)包括電鏡(electron microscopy,EM)、原子力顯微鏡(atomic force microscopy, AFM)成像；結(jié)構(gòu)解析手段包括X 射線衍射(X-ray diffraction)、固態(tài)核磁共振技術(shù)(solid-state nuclear magnetic resonance techniques,ssNMR)；特異性抗體對(duì)寡聚體特定構(gòu)象的識(shí)別等[7]。以下通過分子量、形貌、結(jié)構(gòu)、構(gòu)象等原則對(duì)介尺度Aβ寡聚體進(jìn)行分類和性質(zhì)總結(jié)。

2.1 按分子量分類

按分子量的不同，Aβ 寡聚體可分為二聚體、三聚體(trimer)、四聚體(tetramer)等。電泳是區(qū)分不同分子量蛋白質(zhì)聚集體的常規(guī)手段，但由于Aβ 寡聚體的亞穩(wěn)態(tài)性，在電泳過程中會(huì)發(fā)生Aβ 的自組裝，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果?？赏ㄟ^光誘導(dǎo)蛋白交聯(lián)(photoinduced cross-linking of unmodified proteins,PICUP)技術(shù)來穩(wěn)定寡聚體的結(jié)構(gòu)，以終止介尺度寡聚體動(dòng)態(tài)組裝過程[12]。通過PICUP 并隨后電泳后發(fā)現(xiàn)，不同類型的Aβ 所組裝形成的寡聚體各不相同：Aβ42能夠形成五聚體(pentamer)、六聚體(hexamer)，進(jìn)一步會(huì)形成類似于原纖維的串珠結(jié)構(gòu)；而Aβ40則會(huì)聚集成二聚體、三聚體、四聚體[12]。其中二聚體是毒性寡聚體的基本構(gòu)件分子，三聚體可以組裝形成分子量為56 kDa 的Aβ*56 或者Aβ 十二聚體(dodecamer)。Aβ42十二聚體能夠進(jìn)一步組裝形成線性的前原纖維(preprotofibrils)，因此認(rèn)為Aβ42十二聚體是Aβ42纖維形成的種子[15]。

寡聚體會(huì)通過減弱長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)過程(long-term potentiation,LTP)來影響記憶。LTP通過長(zhǎng)時(shí)間強(qiáng)化神經(jīng)信號(hào)來促進(jìn)記憶的形成，因此LTP 的減弱常與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及記憶的衰退有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，來自于7PA2 細(xì)胞的三聚體能夠減弱LTP。同樣，通過SEC分離AD 患者大腦提取物得到的二聚體也能夠衰減LTP，影響大鼠的記憶[7]。在AD 轉(zhuǎn)基因小鼠的腦內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了Aβ 十二聚體，當(dāng)把分離得到的十二聚體注射入大鼠的腦內(nèi)后，通過水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)十二聚體也會(huì)導(dǎo)致記憶的下降。雖然二聚體、三聚體、十二聚體中哪種寡聚體的毒性最大有待進(jìn)一步的探索，但目前一般認(rèn)為高分子量(high molecular weight,HMW)寡聚體的毒性強(qiáng)于低分子量(low molecular weight,LMW)的寡聚體[16]。

2.2 按形貌、結(jié)構(gòu)分類

介尺度寡聚體按形貌分類可分為球形、環(huán)形等。球形結(jié)構(gòu)的Aβ 寡聚體包括Aβ 衍生擴(kuò)散配體(Aβ-derived diffusible ligands, ADDLs)、淀粉樣球體(amylospheroids,ASPDs)、球聚體(globulomers)等。

ADDLs 是在AD 患者的腦內(nèi)檢測(cè)到具有擴(kuò)散性的球形寡聚體，粒徑5～6 nm，分子量10～100 kDa，可以被ADDLs 特異抗體NUx 和纖維特異性抗體OC 識(shí)別[17-18]。ADDLs 不僅可以和成熟的神經(jīng)元結(jié)合，產(chǎn)生神經(jīng)毒性并誘導(dǎo)神經(jīng)元自噬；還能減少神經(jīng)元上的胰島素受體并影響胰島素的正常信號(hào)。此外，ADDLs能夠誘導(dǎo)Tau蛋白過磷酸化并抑制LTP。

ASPDs 是粒徑10～15 nm、分子量158～669 kDa的完美球形結(jié)構(gòu)[19]。由商業(yè)化Aβ在體外培養(yǎng)5 h形成。也存在于AD 患者的腦內(nèi)，是不參與Aβ 纖維形成(off-fibril pathway)的寡聚體。ASPDs 不與寡聚體抗體A11 和纖維抗體OC 產(chǎn)生反應(yīng)，因此其構(gòu)象與Aβ二聚體、Aβ十二聚體不同。HMW 的ASPDs在神經(jīng)退行的早期階段通過影響Tau 蛋白激酶Ⅰ/GSK-3β 誘導(dǎo)細(xì)胞毒性[20]。近期的研究表明，蛋白酶體抑制會(huì)使興奮性神經(jīng)元中的ASPDs 水平升高，導(dǎo)致ASPDs從軸突轉(zhuǎn)移至樹突。ASPDs會(huì)進(jìn)一步分泌并結(jié)合至附近的Na+/K+-ATPase α3(NAKα3)神經(jīng)元，引起NAKα3神經(jīng)元的死亡[21]。

Globulomers 是2005 年發(fā)現(xiàn)的一種高度穩(wěn)定的水溶性球形寡聚體，分子量60 kDa[22]。這種寡聚體可以由Aβ 與SDS 或脂肪酸培養(yǎng)得到，并在AD 患者和轉(zhuǎn)基因Tg2576 小鼠腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)了此種寡聚體。與Aβ 纖維不同，Globulomers 同時(shí)含有平行和反平行的β-sheet 結(jié)構(gòu)。其通過減弱LTP，抑制AD 患者突觸的活躍度來影響認(rèn)知[22]。

環(huán)形Aβ 原纖維(annular protofibrils, APFs)具有環(huán)形或者孔形的結(jié)構(gòu)，直徑18～25 nm，可以穩(wěn)定數(shù)月，并且能夠被環(huán)形抗原纖維抗體檢測(cè)[23]。北極突變型(E22G)Aβ40和野生型Aβ40均可以形成APFs。Aβ42原纖維寡聚體在親水-疏水的界面的作用下也能夠形成APFs。在脂質(zhì)膜的環(huán)境中APFs 能夠形成β-桶(β-barrel)狀結(jié)構(gòu)。

盡管研究者對(duì)Aβ 寡聚體的形貌有初步的了解，但由于Aβ 寡聚體的多尺度性、暫態(tài)性和復(fù)雜性，原子尺度寡聚體結(jié)構(gòu)的解析還存在較大的困難。通常需要計(jì)算機(jī)模擬和實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法來確定特定寡聚體的結(jié)構(gòu)[24]。圖2 列舉了通過計(jì)算機(jī)模擬或者結(jié)構(gòu)解析的手段得到的幾種常見的寡聚體結(jié)構(gòu)，包括：二聚體、五聚體、六聚體、Globulomers、β-barrel、環(huán)形孔(annular pore)等[25-27]。

圖2 Aβ寡聚體的結(jié)構(gòu)[25-27]Fig.2 Structures of Aβ oligomers[25-27]

2.3 按構(gòu)象分類

不同介尺度寡聚體的構(gòu)象各不相同，寡聚體的構(gòu)象與其生物學(xué)效應(yīng)最為相關(guān)，通常利用特異性抗體來識(shí)別區(qū)分不同生物功能的寡聚體。常見的抗體有A11、KW1、OC等。

A11 抗體能特異性地與可溶性Aβ 寡聚體相結(jié)合，不與Aβ 單體或纖維產(chǎn)生作用[28]。A11也可與其他淀粉樣蛋白所形成的寡聚體結(jié)合，如胰島淀粉樣蛋白(islet amyloid polypeptide,IAPP)、α-突觸核蛋白(α‐synuclein)、溶菌酶等。因此，A11 抗體能識(shí)別特定的寡聚體構(gòu)象，而與氨基酸序列無關(guān)，此構(gòu)象被認(rèn)為是蛋白質(zhì)聚集引起細(xì)胞毒性的關(guān)鍵、通用型的寡聚體構(gòu)象。

KW1 抗體能識(shí)別寡聚體中反平行β-sheet結(jié)構(gòu)[29]。研究發(fā)現(xiàn)，KW1 能夠與Aβ 寡聚體表面的疏水性區(qū)域（如Aβ18-20片段）產(chǎn)生反應(yīng)。在人的大腦內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了KW1 陽性的寡聚體，此種寡聚體會(huì)導(dǎo)致突觸的功能性障礙。

OC 抗體能夠識(shí)別可溶性Aβ 寡聚體和纖維。其中能與OC 作用的寡聚體被稱為纖維寡聚體(fibrillar oligomers)，是因?yàn)檫@些寡聚體的構(gòu)象與纖維類似，含有平行的β-sheet 結(jié)構(gòu)(inregister parallel β-sheet structure)。而與之相反，與A11 作用的寡聚體為原纖維寡聚體(prefibrillar oligomers)，其中含有反平行的β-sheet結(jié) 構(gòu) (out-of-register anti-parallel β -sheet structure)。由于原纖維寡聚體需要經(jīng)過構(gòu)象轉(zhuǎn)變才能形成纖維寡聚體，因此纖維寡聚體的聚集速度比原纖維寡聚體快9 倍[30]。

3 Aβ寡聚體的細(xì)胞損傷機(jī)制

雖然Aβ 介尺度結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步解析，其動(dòng)態(tài)組裝機(jī)理尚不明確，但大量的研究表明可溶性Aβ寡聚體具有較高的神經(jīng)毒性，其在AD 的發(fā)病中起關(guān)鍵作用。由于Aβ 寡聚體結(jié)構(gòu)和性質(zhì)以及體內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性，寡聚體在細(xì)胞層面誘導(dǎo)毒性以及激活神經(jīng)細(xì)胞死亡的機(jī)理有待進(jìn)一步明確。目前普遍認(rèn)為寡聚體通過以下三條途徑對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷[31]：(1)寡聚體與細(xì)胞膜和膜受體產(chǎn)生相互作用，引起細(xì)胞膜的穿孔和細(xì)胞信號(hào)通路的改變；(2)寡聚體進(jìn)入細(xì)胞后在細(xì)胞內(nèi)積累，影響細(xì)胞器的功能和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)；(3)寡聚體在細(xì)胞間傳播，導(dǎo)致淀粉樣斑塊的形成以及引發(fā)AD病理過程（圖3）。

圖3 Aβ寡聚體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性[31]Fig.3 Cytotoxicity triggered by Aβ oligomers[31]

3.1 Aβ寡聚體與細(xì)胞膜和膜受體的相互作用

細(xì)胞膜的完整性對(duì)于細(xì)胞活性的維持至關(guān)重要。研究表明，反平行β-sheet 構(gòu)象的Aβ 寡聚體與孔蛋白結(jié)構(gòu)相似，因此Aβ 寡聚體能夠引起細(xì)胞膜的穿孔。并且隨著Aβ 的纖維化，穿孔的細(xì)胞膜最終完全解體。在轉(zhuǎn)基因Tg2576 小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，Aβ 二聚體能夠與細(xì)胞膜上的脂質(zhì)筏(lipid rafts)產(chǎn)生相互作用并累積，形成局部較高的濃度，促進(jìn)纖維化過程。由于脂質(zhì)筏由膽固醇、GM1-神經(jīng)節(jié)苷脂、鞘脂和突觸受體組成，是神經(jīng)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)中心，因此Aβ 寡聚體在脂質(zhì)筏處的累積不僅會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的解體，還會(huì)干擾信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致記憶下降。

此外，Aβ 寡聚體能夠與許多受體產(chǎn)生作用，調(diào)控下游信號(hào)通路，引起突觸的功能性障礙以及神經(jīng)退化。與Aβ 能發(fā)生作用的受體有N-甲基-D-天冬氨酸受體(N‐methyl D‐aspartate receptors,NMDARs)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)受體、胰島素受體(insulin receptors)、細(xì)胞內(nèi)朊蛋白(cellular prion protein,PrPc)等。

3.2 Aβ寡聚體對(duì)細(xì)胞內(nèi)過程的影響

胞外的Aβ 可通過膜受體或神經(jīng)元的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。此外，細(xì)胞器膜上APP 產(chǎn)生的Aβ 也可以直接在胞內(nèi)累積。許多細(xì)胞器都是Aβ 產(chǎn)生和聚集的位點(diǎn)，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、核內(nèi)體、自噬體、溶酶體等。胞內(nèi)Aβ 寡聚體能夠引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力的升高、Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡、線粒體損傷、蛋白質(zhì)的水解以及細(xì)胞的凋亡。

Aβ 寡聚體通過激活磷脂酶C 的信號(hào)使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上Ca2+濃度失衡，導(dǎo)致Ca2+由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向細(xì)胞質(zhì)釋放，隨之激活Caspase 3 凋亡通路。Aβ 寡聚體與線粒體膜作用，會(huì)引起細(xì)胞色素C 的釋放，啟動(dòng)凋亡過程。線粒體膜的解聚不僅代表線粒體功能的喪失，呼吸作用受到影響，還與突觸功能異常以及記憶的損傷有關(guān)。當(dāng)Aβ 寡聚體與溶酶體作用時(shí)，會(huì)導(dǎo)致溶酶體膜的透化，增強(qiáng)溶酶體酶的外排，引起細(xì)胞凋亡。

3.3 Aβ寡聚體的傳播

來自胞外或胞內(nèi)的Aβ 均可通過播種效應(yīng)(seeding effect)在腦內(nèi)擴(kuò)散。Aβ 寡聚體種子也可以通過細(xì)胞到細(xì)胞的傳播機(jī)制進(jìn)行擴(kuò)散，受胞內(nèi)體運(yùn)輸系統(tǒng)(endosomal trafficking system)的調(diào)控。此外，研究發(fā)現(xiàn)在不同Aβ亞型中，Aβ42傳播性最強(qiáng)。寡聚體細(xì)胞到細(xì)胞的傳播會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生較大溶酶體囊泡，從而影響供體和受體細(xì)胞的溶酶體功能。

4 Aβ聚集的調(diào)控

由于Aβ 寡聚體是Aβ 聚集過程中毒性最高的組分，因此抑制Aβ 纖維化、調(diào)控聚集過程中關(guān)鍵毒性介尺度結(jié)構(gòu)的形成是減弱神經(jīng)損傷最為有效、直接的途徑。此外，也可通過抑制β-分泌酶的活性來減少Aβ 單體的生成，利用胰島素降解酶、腦啡肽酶等清除Aβ 單體，或重塑Aβ 聚集體等方式來調(diào)控Aβ 聚集所產(chǎn)生的毒性，以達(dá)到治療AD 的目的。由于Aβ 介尺度結(jié)構(gòu)和聚集過程的復(fù)雜性，目前的調(diào)控/抑制劑雖然能夠減弱細(xì)胞毒性，對(duì)于其作用和調(diào)控機(jī)理的研究還有待進(jìn)一步深入，以下就常見的調(diào)控/抑制劑包括小分子類、多肽類、蛋白類和納米類調(diào)控/抑制劑等進(jìn)行介紹和歸納總結(jié)[32]。

4.1 小分子類抑制劑

天然小分子抑制劑具有分子量小、Aβ親和性高等優(yōu)點(diǎn)。迄今為止已經(jīng)鑒定了兩類小分子抑制劑：多酚類和非多酚類小分子。多酚類小分子含有一個(gè)或多個(gè)酚羥基，根據(jù)“π-stacking”理論，多酚類化合物的苯環(huán)可能競(jìng)爭(zhēng)性地與Aβ 的芳香基團(tuán)發(fā)生作用，類似于三明治式地夾雜在兩個(gè)氨基酸苯環(huán)殘基之間，阻止Aβ 單體間π-π 相互作用。此外，多酚類化合物可能通過疏水性相互作用抑制淀粉樣纖維的生長(zhǎng)。常見的多酚類抑制有：茶多酚((-)-Epigallocatechin-3-gallate, EGCG)、白 藜 蘆 醇(Resveratrol)、姜黃素(Curcumin)、巴西木素(Brazilin)、蘇木精(Hematoxylin)等（圖4）。非多酚類小分子包括生物堿、黃酮類、苷類、吩嗪等。

圖4 調(diào)控Aβ聚集的小分子抑制劑Fig.4 Small molecules that show the modulation capability of Aβ aggregation

來自于綠茶提取物的EGCG 是研究最為廣泛的小分子抑制劑，已進(jìn)入臨床Ⅲ期試驗(yàn)。EGCG 不僅能抑制Aβ 的纖維化，還能夠解聚成熟的Aβ 聚集體，使之形成大量無定形、非毒性的Aβ 寡聚體[33-34]。當(dāng)金屬離子（如Cu2+、Zn2+等）存在時(shí)，EGCG 又能與金屬離子、Aβ 形成三元復(fù)合物，抑制金屬離子誘導(dǎo)的Aβ 聚集，有效緩解Aβ-金屬所引起的細(xì)胞毒性[35]。 通過等溫滴定量熱(isothermal titration calorimetry, ITC)實(shí)驗(yàn)測(cè)定EGCG 與不同Aβ 片段結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)后發(fā)現(xiàn)，疏水相互作用和氫鍵結(jié)合發(fā)生于Aβ 的不同區(qū)域。氫鍵結(jié)合主要發(fā)生于Aβ1-16片段，而疏水相互作用主要作用于Aβ17-42片段[36]。此外，分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果表明，EGCG 能夠?qū)⑺肿訌腁β 的表面排開，并直接與Aβ 產(chǎn)生作用[37]。研究顯示，非極性作用對(duì)EGCG-Aβ結(jié)合能的貢獻(xiàn)大于71%，而極性作用對(duì)其結(jié)合的貢獻(xiàn)較小。Aβ 中有12 個(gè)氨基酸殘基均能夠與EGCG 產(chǎn)生作用，包括Phe4、Arg5、Phe19、Phe20、Glu22、Lys28、Gly29、Leu34～Gly37、Ile41。非極性相互作用主要由疏水性氨基酸殘基(Phe、Met、Ile)的側(cè)鏈和一些非疏水性氨基酸殘基(Lys28、Gly29)的主鏈提供，而極性相互作用主要由Aβ 的主鏈(Gly29、Gly37)提供。Ahmed 等[38]進(jìn)一步利用NMR 技術(shù)對(duì)EGCG 重塑Aβ寡聚體的分子機(jī)理進(jìn)行了探究。發(fā)現(xiàn)EGCG 對(duì)Aβ組裝體的調(diào)控符合Hill-Scatchard模型。當(dāng)與EGCG結(jié)合后，Aβ寡聚體溶劑暴露程度降低。此過程擾亂了Aβ 單體與原纖維的接觸，從而阻斷了表面催化的二次成核過程，降低了毒性聚集體的生成。

從中草藥丹參中提取得到的丹參酮(Tashinone)，已廣泛應(yīng)用于治療心血管、心肌梗死、中風(fēng)等疾病。研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用；能夠有效抑制Aβ 聚集，解聚成熟的Aβ 纖維，并減少Aβ 聚集誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。對(duì)于Ⅱ型糖尿病相關(guān)的人胰島淀粉樣多肽(human islet amyloid polypeptide,hIAPP)的聚集，丹參酮也具有較強(qiáng)的抑制作用[39]。

巴西木素(Brazilin)是來源于蘇木(Caesalpinia sappan)的一種天然多酚類化合物，具有Aβ 聚集抑制和纖維解聚的雙重性功能。在低濃度下，巴西木素的抑制能力強(qiáng)于EGCG。研究表明，巴西木素能夠?qū)β 單體和纖維轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定形的聚集體，阻止一次成核和纖維催化的二次成核過程。分子模擬結(jié)果顯示，巴西木素能通過疏水和氫鍵作用與Aβ組分結(jié)合，抑制其纖維化；并通過氫鍵作用干擾D23～K28 分子間鹽橋的形成，進(jìn)而重塑Aβ 纖維[40]。此外，巴西木素還能夠抑制來自于前列腺酸性磷酸酶39 肽(prostatic acidic phosphatase, PAP248-286)的聚集，有效降低被HIV 感染的風(fēng)險(xiǎn)[41]。與巴西木素的結(jié)構(gòu)類似，另一種來自于蘇木的天然小分子化合物蘇木精(Hematoxylin)，也是有效的Aβ聚集抑制劑[42]。蘇木精能減少聚集過程中β-sheet 結(jié)構(gòu)的形成，誘導(dǎo)Aβ 形成反平行結(jié)構(gòu)，改變聚集路徑，顯著緩解由Aβ聚集所致的細(xì)胞毒性。

小分子類抑制劑雖然能在體外有效抑制Aβ 的聚集、解聚Aβ 纖維，但小分子類抑制劑的專一性差、體內(nèi)循環(huán)時(shí)間短、穩(wěn)定性不足、易被降解和代謝，上述缺點(diǎn)限制了小分子抑制劑的體內(nèi)應(yīng)用。因此，需要設(shè)計(jì)適宜的藥物遞送體系，以提高小分子的生物利用度。

4.2 多肽類抑制劑

多肽類抑制劑具有易于合成修飾、生物相容性好、特異性高、分子量小、無免疫原性、理化性質(zhì)簡(jiǎn)單、可通過理性設(shè)計(jì)得到等優(yōu)勢(shì)[43]，因此近年來多肽藥物發(fā)展迅速。目前，已有60 多種多肽藥物上市，近140 種正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，至少500 種處于臨床前評(píng)估階段。Aβ多肽類抑制劑通常來自于Aβ自身序列，或根據(jù)特定原則構(gòu)建的多肽庫，隨后利用分子對(duì)接或者分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法進(jìn)行篩選，并通過試驗(yàn)的手段驗(yàn)證得到。此外，還可以對(duì)先導(dǎo)肽進(jìn)行衍生、改造，以得到抑制能力更強(qiáng)、功能性更多的多肽抑制劑（表1）。

表1 基于Aβ核心疏水區(qū)設(shè)計(jì)的多肽抑制劑總結(jié)Table 1 Summarization of peptide-inhibitors designed from the central hydrophobic core of Aβ

基于Aβ 序列設(shè)計(jì)的抑制劑，根據(jù)多肽序列的來源或作用區(qū)域可分為Aβ核心疏水區(qū)和C-端結(jié)構(gòu)域。Aβ 核心疏水區(qū)在Aβ 聚集中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，被稱為“自識(shí)別序列”。由于多肽的纖維化是Aβ 單體不斷的自我識(shí)別過程，因此來自于Aβ 核心疏水區(qū)的序列能夠與Aβ 分子中相似的片段結(jié)合，從而抑制聚集。為評(píng)估Aβ 核心疏水片段KLVFF 中各氨基酸在抑制Aβ 聚集中的作用，Tjernberg 等[44]用Ala分別取代了KLVFF 序列中的Lys16、Leu17、Phe20，以此設(shè)計(jì)了短肽抑制劑KLVFF。Soto 等[45]發(fā)現(xiàn)，傾向于形成β 片層構(gòu)象的序列能夠促進(jìn)Aβ 的纖維化過程。因此，其將Leu17 替換為具有阻斷β 片層生成作用的Pro，設(shè)計(jì)出了β-折疊破壞肽(β-sheet breakers)LPFFD。LPFFD 不僅能夠抑制Aβ 的聚集，還能夠解聚成熟的Aβ 纖維，阻止神經(jīng)細(xì)胞的死亡，并且也能抑制體內(nèi)淀粉樣斑塊的形成和沉積。

雖然KLVFF 或LVFFA 均能通過疏水和氫鍵作用與Aβ 結(jié)合，但其抑制Aβ 纖維化的能力較弱，需要經(jīng)過更進(jìn)一步的設(shè)計(jì)和改造來提高抑制能力。通過分析Aβ 的疏水核心區(qū)以及附近的氨基酸發(fā)現(xiàn)，疏水核心之后的是帶負(fù)電的氨基酸殘基E、D。因此如果在多肽抑制劑LVFFA 的末端增加帶正電的氨基酸，將會(huì)通過靜電相互作用來加強(qiáng)抑制劑與Aβ的結(jié)合。為此引入了帶正電的R、K，設(shè)計(jì)了七肽抑制劑LVFFARK(LK7)[46]。當(dāng)LK7 與Aβ 濃度相同時(shí)，能夠抑制68%的ThT熒光強(qiáng)度，此時(shí)抑制效果最好。但由于自身的聚集性質(zhì)，進(jìn)一步增大LK7 的濃度反而會(huì)導(dǎo)致抑制效果的降低以及明顯的細(xì)胞毒性。為提高LK7的抑制能力、解決LK7自聚的問題，Ma 等[47]通過首尾環(huán)化的方式設(shè)計(jì)了環(huán)化LK7(cLK7)。與線性的LK7 相比，cLK7 具有較高的酶解穩(wěn)定性、較低的細(xì)胞毒性。cLK7 與Aβ 較高的親和性有利于其結(jié)合到Aβ 單體上，穩(wěn)定Aβ 的構(gòu)象，從而顯著抑制Aβ的纖維化和細(xì)胞毒性。

由于AD 病因的復(fù)雜性，單純的Aβ 抑制劑往往很難治愈AD。AD的其他病理學(xué)特征如過渡態(tài)金屬離子(Cu2+、Zn2+)紊亂，能夠促進(jìn)Aβ的聚集，形成毒性更高的聚集體[52-53]。此外，過渡態(tài)金屬離子會(huì)催化類芬頓反應(yīng)(Fenton-like reaction)，生成大量的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷[54]。因此，開發(fā)具有金屬螯合能力、Aβ 抑制能力的多肽具有重要意義。雙/多功能抑制劑不僅能夠抑制Aβ 自身的聚集，還能夠抑制金屬離子介導(dǎo)的聚集和產(chǎn)生的ROS，以及解聚Aβ-金屬?gòu)?fù)合物。在構(gòu)建雙/多功能抑制劑方面也有廣泛的研究。如以LK7 為基礎(chǔ)，在其C-末端引入具有Cu2+螯合能力的HH，可構(gòu)建雙功能抑制劑LVFFARKHH[48]；在其N-端分別引入肌肽(carnosine,Car)、三肽RTH，可構(gòu)建Car-LK7[49]、RTHLVFFARK(L-RK10)[50]等。上述多功能多肽抑制劑不僅具有金屬螯合能力,更重要的是由于親水性基團(tuán)的引入，降低了LK7 的自聚趨勢(shì)，提高了其抑制性能。

Aβ具有特定的空間構(gòu)象，對(duì)抑制劑存在明顯的手性選擇和偏好性。因而多肽抑制劑的手性轉(zhuǎn)變是提高抑制效率的有效方式。Liu 等[51]對(duì)多功能抑制劑L-RK10 進(jìn)行了手性轉(zhuǎn)變，以此設(shè)計(jì)了DRK10。與L 型相比，D-RK10 不僅具有更高的抑制能力,還具有類似的ROS 抑制、抗氧化損傷性質(zhì)；此外D-RK10能夠重塑Aβ-Cu2+聚集體，阻止解聚碎片的重聚。

通過環(huán)化、手性轉(zhuǎn)化、引入非天然氨基酸、N-甲基化等方式對(duì)多肽抑制劑進(jìn)行衍生，能夠提高抑制劑的抑制能力、增加其功能性、增強(qiáng)抗蛋白水解能力以及提高BBB 滲透性。雖然多肽類抑制劑具有較高的生物相容性和Aβ 特異性，但是多肽類抑制劑還存在如下缺點(diǎn)有待克服，如：多肽類抑制劑普遍疏水性較強(qiáng)、易于自聚，由此引起抑制能力的降低以及細(xì)胞毒性的升高；多肽類抑制劑抑制效果差、有效作用濃度偏高、體內(nèi)穩(wěn)定性不足、易酶解、半衰期短，因此還需要進(jìn)一步的優(yōu)化和改進(jìn)。

4.3 蛋白類抑制劑

存在于人體內(nèi)的天然蛋白質(zhì)可作為分子伴侶，調(diào)控Aβ 的聚集和神經(jīng)毒性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大量蛋白質(zhì)如：人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)、熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)、叢生蛋白、甲狀腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(transthyretin,TTR)、朊蛋白PrPc、溶菌酶(lysozyme,Lys)等均能夠與Aβ 產(chǎn)生相互作用。蛋白類抑制劑具有較高的生物相容性、易于修飾的優(yōu)點(diǎn)。

血清白蛋白是血清中含量最豐富的蛋白質(zhì)，通常作為營(yíng)養(yǎng)分子、代謝物、金屬離子、藥物和其他分子的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。根據(jù)來源，可分為HSA 和牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)。HSA 和BSA 的結(jié)構(gòu)較為相似，有76%的序列相似性。美國(guó)FDA 已批準(zhǔn)BSA 用于藥物制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用。HSA 可以通過疏水口袋以1∶1比例與Aβ結(jié)合。此外，HSA 含有兩個(gè)金屬結(jié)合位點(diǎn)，能夠螯合Cu2+、Zn2+等金屬離子，有效抑制金屬離子誘導(dǎo)的Aβ 聚集。為提高血清白蛋白的抑制能力，Xie等[55]通過引入負(fù)電荷的方法合成了酸化的白蛋白(acidulated BSA, A-BSA)。在與Aβ 等摩爾濃度培養(yǎng)時(shí)，A-BSA 和BSA 能分別減少47%和25%的ThT 熒光強(qiáng)度。A-BSA 能夠更顯著地抑制Aβ 纖維化，有效緩解Aβ 聚集介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（圖5）。基于此，研究者提出了疏水結(jié)合-靜電排斥 (hydrophobic binding-electrostatic repulsion,HyBER)的機(jī)理假說。此假說認(rèn)為Aβ通過疏水作用結(jié)合到A-BSA 表面；同時(shí)由于Aβ 和A-BSA 帶同種電荷，對(duì)結(jié)合到A-BSA 表面的Aβ 起到靜電排斥作用。上述兩種相反的作用使Aβ 維持伸展的結(jié)構(gòu)，而非有利于聚集的β-sheet 結(jié)構(gòu)。因此A-BSA 能夠調(diào)控Aβ 的聚集并改變其細(xì)胞毒性。由于白蛋白固有的金屬螯合能力，A-BSA、A-HSA 也可以用于調(diào)控Cu2+、Zn2+介導(dǎo)的Aβ 聚集和毒性[56-57]。此外，對(duì)HSA 修飾金屬螯合劑亞氨基二乙酸(iminodiacetic acid, IDA)，可進(jìn)一步提高HSA 的金屬螯合容量，有效抑制高濃度金屬離子所產(chǎn)生的ROS，以及金屬離子誘導(dǎo)的Aβ聚集[58]。

圖5 A-BSA抑制Aβ聚集[55](a)A-BSA合成示意圖;(b)Aβ聚集動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn);(c)Aβ在無或有A-BSA條件下培養(yǎng)24 h的TEM圖片;(d)MTT細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn);(e)HyBER假說示意圖Fig.5 A-BSA inhibits Aβ aggregation[55](a)Schematic illustration of the preparation of A-BSA;(b)Aggregation kinetics of Aβ incubated with BSA/A-BSA;(c)TEM images of Aβ incubated(A)without or(B)with A-BSA for 24 h;(d)MTT cell viability of PC-12 cells treated with Aβ and different BSA/A-BSA concentrations;(e)Schematic representation of the HyBER hypothesis

以血清白蛋白為基礎(chǔ)，通過增加表面正電荷也可以增強(qiáng)其抑制效果。Wang 等[59]利用BSA 表面偶聯(lián)乙二胺的方法制備了堿化的BSA(BSA-B)。研究發(fā)現(xiàn)，在較低濃度條件下，BSA-B 表現(xiàn)出高效的抑制能力。堿化修飾增強(qiáng)了BSA 與Aβ 之間的靜電相互作用，實(shí)現(xiàn)了BSA 與Aβ 結(jié)合方式由單位點(diǎn)的疏水結(jié)合向多位點(diǎn)的靜電結(jié)合轉(zhuǎn)變，從而能夠與不同的Aβ 組分產(chǎn)生相互作用，有效抑制Aβ 的纖維化過程。對(duì)HSA 進(jìn)行堿化修飾也得到了類似的結(jié)果。在堿化HSA (HSA-B)基礎(chǔ)上進(jìn)一步偶聯(lián)Aβ 特異性近紅外熒光探針、BBB 穿膜肽可制備新型的診療試劑(HSA-BFP)[60]。HSA-BFP 不僅能抑制AD 線蟲體內(nèi)Aβ 的沉積、緩解由聚集引起的癱瘓，還能實(shí)現(xiàn)體內(nèi)Aβ斑塊的熒光檢測(cè)，是一種多功能Aβ診療劑。

其他的蛋白質(zhì)類抑制劑，也可通過表面化學(xué)改性的方式提高抑制能力，或賦予其新的功能。如：對(duì)溶菌酶進(jìn)行堿化修飾會(huì)增強(qiáng)其抑制能力[61]；偶聯(lián)IDA，引入了Zn2+螯合性質(zhì)[62]；修飾多功能多肽RK10，實(shí)現(xiàn)了對(duì)Cu2+介導(dǎo)Aβ 聚集的抑制，以及對(duì)Cu2+-Aβ聚集體的重塑等[63]。

4.4 納米材料類抑制劑

隨著納米技術(shù)的迅速發(fā)展，納米材料的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用受到了廣泛的關(guān)注。納米材料具有粒徑小、比表面積較大、易于修飾和改性的特點(diǎn)[64-66]。各類納米材料，包括聚合物納米粒子、金屬納米粒子、2D納米材料、碳納米材料以及功能性納米粒子在抑制Aβ 聚集和治療AD 方面均有涉及（圖6）。可根據(jù)特定的生理微環(huán)境或藥物作用機(jī)制來理性設(shè)計(jì)不同的納米材料，用于提高藥物的遞送效率、實(shí)現(xiàn)疾病的治療。

圖6 納米材料用于調(diào)控Aβ聚集[46,67-73]Fig.6 An overview of nanomaterials for modulation of Aβ aggregation[46,67-73]

超分子化合物可用于抑制Aβ 聚集。第二代大環(huán)超分子如β-環(huán)糊精(β-cyclodextrins,β-CD)、葫蘆脲等能夠通過疏水腔調(diào)控Aβ的聚集[74]。此外，作為一種優(yōu)良的藥物載體，將疏水性的多肽類抑制劑LK7 偶聯(lián)于β-CD 上，能顯著提高LK7 的溶解性，有效增強(qiáng)抑制效率[75]。以杯芳烴為代表的第三代超分子主體化合物不僅繼承了前兩代的特點(diǎn)，還具有易衍生的優(yōu)勢(shì)。磺化杯芳烴(para-sulfonato-calix[n]arene, SC[n]A)是杯芳烴的一種衍生物，可以通過主客體化學(xué)與多種氨基酸產(chǎn)生靜電、疏水等相互作用，具備抑制Aβ 聚集的潛質(zhì)。Wang 等[67]研究了SC[n]A(n=4,6,8)對(duì)Aβ聚集的影響，發(fā)現(xiàn)抑制作用的強(qiáng)弱為：SC[8]A>SC[6]A>SC[4]A。由于SC[8]A 的分子環(huán)最大，其柔性也最大，有利于與Aβ 發(fā)生相互作用，因此抑制效果最好。

樹枝狀聚合物是高度支化的高分子納米材料，包括聚酰胺樹枝狀聚合物(polyamidoamine dendrimer, PAMAM)、聚乙烯亞氨樹枝狀聚合物、聚丙烯亞胺樹枝狀聚合物等。在藥物遞送、可控釋放、診斷治療等方面均有應(yīng)用。為驗(yàn)證抑制劑通過HyBER 機(jī)理調(diào)控Aβ 聚集的正確性，研究者在5 代(G5)羧基化PAMAM 的表面偶聯(lián)了疏水性的苯乙胺(phenethylamine,PEA)，合成了帶有負(fù)電的疏水性抑制劑(PAMP)[68]，發(fā)現(xiàn)適宜取代度的PAMP 具有最佳的抑制效果，能夠通過疏水結(jié)合-靜電排斥作用來調(diào)控聚集并緩解細(xì)胞毒性。此外，通過研究不同代數(shù)PEA 修飾的PAMAM 對(duì)Aβ聚集的抑制后發(fā)現(xiàn)，高代數(shù)的G5-P、G6-P 具有抑制能力，而低代數(shù)的G3-P、G4-P 無顯著的抑制作用。因此，疏水基團(tuán)和負(fù)電荷基團(tuán)需要在空間上滿足一定的范圍才能發(fā)揮HyBER 作用。當(dāng)超過此范圍后，兩種相反的作用力不能使Aβ 維持伸展的構(gòu)象，因而不具有抑制能力[76]。HyBER 假說中疏水與靜電作用對(duì)抑制效率的影響還可以通過其他聚合物納米粒子進(jìn)行證明和進(jìn)一步的探究，如：N-叔丁基丙烯酰胺與丙烯酸通過共聚得到的聚合物納米粒子NP10[69]、姜黃素修飾的透明質(zhì)酸納米粒子(curcumin-hyaluronic acid conjugate,CHA)等[70]。

以納米粒子為載體，將多肽或小分子類抑制劑偶聯(lián)于納米粒子上，可以改善多肽或小分子的水溶性，避免其由于自聚而導(dǎo)致的抑制能力降低以及細(xì)胞毒性的升高，增強(qiáng)抑制效果。如將多肽抑制劑LK7 偶聯(lián)于粒徑為150 nm 的聚乳酸-乙醇酸[poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA]納米粒子上，制備多肽功能化的納米粒子LK7@PLGA NPs，有效克服了LK7 高濃度條件下自聚的缺點(diǎn)[46]。將LK7 負(fù)載于新型的2D 納米材料黑磷(black phosphorus,BP)片層表面，并修飾聚乙二醇PEG，合成了PEG-LK7 穩(wěn)定的BP(PEG-LK7@BP)[71]。在有效防止BP 降解的同時(shí)，較大的BP片層表面為L(zhǎng)K7提供了附著平臺(tái)，提高了LK7的局部濃度，有利于LK7通過“多價(jià)”作用與Aβ組分結(jié)合，增強(qiáng)了LK7 對(duì)Aβ 纖維化的抑制。再比如，將所設(shè)計(jì)的嵌合肽VVIA-CLPFFD(VCD10)偶聯(lián)于金納米粒子(AuNPs)上，合成VCD10 偶聯(lián)的AuNPs (VCD10@AuNPs)。多肽在AuNPs 表面上特定的趨向和構(gòu)象，能夠促進(jìn)其與Aβ 產(chǎn)生相互作用，顯著提升多肽的抑制能力[72]。在0.1 nmol·L-1的濃度下，即可將細(xì)胞活性由48%提升至82%。

作為一類親水性聚合物，兩性離子聚合物由于其優(yōu)異的生物相容性而受到重視。常見的兩性離子有聚羧基甜菜堿[poly(carboxybetaine), pCB]、聚磺酸基甜菜堿[poly(sulfobetaine),pSB]等。為改善小分子或多肽抑制劑的藥效，可將其偶聯(lián)于兩性離子聚合物上。Zhao 等[73]將姜黃素(Curcumin)修飾于pCB上，合成了姜黃素偶聯(lián)的pCB 納米粒子(Cur@pCB)。Cur@pCB 自組裝形成粒徑為120～190 nm 的納米凝膠。其表面的水化層能穩(wěn)定結(jié)合在姜黃素上的Aβ，阻止Aβ 構(gòu)象向β-sheet 結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變。與游離的姜黃素相比，同濃度的Cur@pCB 抑制能力明顯提升。類似地，也可將LK7偶聯(lián)于pCB上，制備多肽修飾的聚合物納米粒子LK7@pCB[77]。通常情況下，抑制劑通過抑制β-sheet 結(jié)構(gòu)的生成來降低聚集所誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。然而Wang等[78]發(fā)現(xiàn)，將LK7偶聯(lián)于帶有二甲基側(cè)鏈的兩性離子pID(LK7@pID)后，促進(jìn)了Aβ的聚集，此過程擾亂了正常的Aβ纖維化，生成了大量異質(zhì)的纖維聚集體，因此降低了細(xì)胞毒性。

此外，一些碳材料，如石墨烯等可用于檢測(cè)Aβ單體、抑制Aβ 的聚集。Gao 等[79]通過水熱法合成了粒徑為5 nm 的超小氮摻雜碳化聚合物點(diǎn)(nitrogendoped carbonized polymer dots, CPDs)。CPDs 不僅能通過靜電吸引、氫鍵結(jié)合以及疏水相互作用抑制Aβ的纖維化，減少聚集所產(chǎn)生的毒性。還能在數(shù)秒至數(shù)分鐘的時(shí)間尺度內(nèi)快速解聚Aβ 纖維。更重要的是，當(dāng)與Aβ結(jié)合后，CPDs表現(xiàn)出紅色熒光增強(qiáng)的性質(zhì)。因此CPDs 可用于體內(nèi)Aβ 斑塊的成像。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CPDs能夠通過清除Aβ斑塊，延長(zhǎng)轉(zhuǎn)基因線蟲CL2006的生存壽命，是一種多功能的診療試劑（圖7）。

圖7 CPDs靶向Aβ聚集的多功能性[79](a)CPDs的合成示意圖;(b)CPDs的TEM圖片;(c)通過ThT熒光實(shí)驗(yàn)測(cè)定CPDs抑制Aβ聚集;(d)CPDs快速解聚Aβ纖維;(e)CPDs熒光檢測(cè)Aβ纖維;(f)CPDs檢測(cè)線蟲體內(nèi)Aβ斑塊;(g)CPDs抑制線蟲體內(nèi)Aβ沉積Fig.7 The multifunctionality of CPDs targeting Aβ aggregation[79](a)Schematic representation of the synthesis of CPDs;(b)TEM image of CPDs;(c)CPDs inhibit Aβ aggregation measured by ThT fluorescence assay;(d)Fast disaggregation of Aβ fibrils by CPDs using a stopped-flow spectrometer;(e)Detection of Aβ fibrils by the fluorescence of CPDs;(f)Imaging Aβ plaques in CL2006 nematodes;(g)CPDs suppress Aβ accumulation in nematodes

除常規(guī)納米材料外，光、超聲等外場(chǎng)響應(yīng)的功能性納米材料也被用于調(diào)控Aβ 的聚集，如光熱納米材料、光氧化納米材料等[80]。納米馬達(dá)是一類能夠受外場(chǎng)激發(fā)、在微觀尺度自主運(yùn)動(dòng)的納米粒子，已應(yīng)用于強(qiáng)化化學(xué)反應(yīng)、體內(nèi)藥物的靶向遞送、疾病治療等諸多領(lǐng)域。研究者將多肽抑制劑D-RK10負(fù)載于近紅外(near infrared region, NIR)光驅(qū)動(dòng)的Janus 納米馬達(dá)上，構(gòu)建了抑制劑修飾的納米馬達(dá)(JNM-I)[81]。在NIR 光的照射下，JNM-I 通過“自熱泳”力產(chǎn)生顯著的運(yùn)動(dòng)。NIR 光驅(qū)動(dòng)的JNM-I 能夠增強(qiáng)抑制劑與Aβ 組分之間的相互碰撞，顯著提高抑制劑的抑制能力，減輕Aβ 聚集導(dǎo)致的毒性，阻止Aβ 構(gòu)象由無規(guī)則卷曲向β-sheet 的轉(zhuǎn)變。此外，由于JNM-I 的主動(dòng)運(yùn)動(dòng)特性和光熱作用，NIR 光也能增強(qiáng)其BBB 透過性，這有利于AD 藥物的遞送和進(jìn)一步體內(nèi)應(yīng)用（圖8）。此研究以納米馬達(dá)為載體實(shí)現(xiàn)了對(duì)Aβ 聚集過程的調(diào)控與強(qiáng)化，創(chuàng)造性地將過程強(qiáng)化理論應(yīng)用于與Aβ 聚集相關(guān)的介尺度科學(xué)的研究。

圖8 NIR光驅(qū)動(dòng)的JNM-I用于強(qiáng)化抑制Aβ纖維化[81](a)JNM-I通過運(yùn)動(dòng)作用增強(qiáng)抑制劑與Aβ組分之間的作用;(b)JNM-I的TEM和能譜圖片;(c)不同激光強(qiáng)度下MSD隨時(shí)間間隔變化的曲線;(d)Aβ聚集體的AFM圖片;(e)在有或無NIR光照條件下SH-SY5Y細(xì)胞與JNM-I培養(yǎng)的MTT細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn);(f)Aβ聚集48 h后的CD光譜;(g)NIR驅(qū)動(dòng)的JNM-I穿透BBBFig.8 NIR light-powered JNM-I for intensified inhibition of Aβ fibrillogenesis[81](a)Enhancing the interactions between inhibitors and Aβ species by the active motion of JNM-I;(b)TEM image and EDS mapping of JNM-I;(c)Curves of MSD vs time interval at varied laser densities;(d)AFM images of Aβ aggregates;(e)MTT cell viability of SHSY5Y cell incubated with JNM-I and treated with or without NIR light;(f)CD spectra of Aβ after incubation for 48 h;(g)NIR lightpropelled JNM-I to cross BBB

5 結(jié)論與展望

隨著人口老齡化的日益加劇，AD 已成為醫(yī)學(xué)、健康領(lǐng)域重點(diǎn)關(guān)注和亟待解決的問題之一。目前臨床上緩解AD 認(rèn)知障礙的藥物主要有4 種，包括3種膽堿酯酶抑制劑(Donepezil, Galantamine,Rivastigmine)和1 種N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑(Memantine)。經(jīng)過多年的研究，以Aβ 級(jí)聯(lián)假說為基礎(chǔ)的藥物設(shè)計(jì)已取得了一定的結(jié)果，并開發(fā)出了一系列的Aβ 抑制劑，有些已經(jīng)獲得FDA 的批準(zhǔn)或進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段。如Biogen 公司開發(fā)的單抗類藥物Aducanumab 在2021 年6 月獲得了美國(guó)FDA的加速審批，成為第一個(gè)抗Aβ聚集的藥物[82]。但目前針對(duì)Aβ 的研究還存在如下缺點(diǎn)，需要在今后的研究中得以解決。

（1）由于AD 病因的復(fù)雜性，Aβ 的聚集只是其中一種因素。其他方面，如過渡態(tài)金屬離子紊亂、Tau 蛋白過磷酸化、神經(jīng)炎癥等均是AD 的重要病理學(xué)特征，在這些方面還應(yīng)該進(jìn)行更為廣泛、充分的研究，以針對(duì)AD 病因設(shè)計(jì)更為可行的候選藥物。例如：腸道菌群紊亂所誘發(fā)的神經(jīng)炎癥是AD 的重要發(fā)病機(jī)制，調(diào)控腸道菌群可改變氨基酸衍生物的代謝進(jìn)而影響免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)。為此中國(guó)科學(xué)家研制了首個(gè)靶向腦-腸軸的寡糖類AD 藥物GV-971，并于2019 年11 月獲得國(guó)家藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)在國(guó)內(nèi)上市。

（2）對(duì)于Aβ 聚集的關(guān)鍵介尺度結(jié)構(gòu)、介尺度動(dòng)態(tài)組裝機(jī)理以及Aβ 聚集的生物學(xué)作用的理解和認(rèn)識(shí)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足。因此需要通過更為綜合、先進(jìn)創(chuàng)新的手段解析Aβ 寡聚體的基本結(jié)構(gòu)，揭示聚集過程的分子機(jī)理，并闡釋其引起細(xì)胞損傷的機(jī)制。

（3）目前的Aβ 抑制劑雖然能阻止Aβ 的聚集，但其具體的作用原理還有待更深入的探究，需要針對(duì)特定的介尺度結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)更為專一、高效的抑制劑，實(shí)現(xiàn)對(duì)聚集的調(diào)控與抑制。此外，抑制劑的BBB 透過性、體內(nèi)藥效的評(píng)估等方面還應(yīng)該進(jìn)行廣泛的研究。

（4）在實(shí)際應(yīng)用中，單純的Aβ 抑制劑可能不能取得較好的臨床結(jié)果。因此，需要在Aβ 抑制劑的基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行設(shè)計(jì)改造，如：診療一體化的設(shè)計(jì)、多功能設(shè)計(jì)、可控釋放設(shè)計(jì)等，以滿足臨床的需要。