張智超，高 明，趙 昊，王曉雅，曹子敬，吳 坤，徐淑霞

（河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河南 鄭州 450002）

二氯喹啉酸是一種高度選擇性的生長素類水田除草劑，能防除稻田中的單子葉雜草，是我國水稻田常用的除草劑之一[1]。二氯喹啉酸在水稻田中長期使用，會使土壤中的殘留量逐漸增加，對水稻產(chǎn)生藥害作用[2]，導致“蔥心苗”出現(xiàn)。因此，土壤中二氯喹啉酸殘留成為作物輪作的主要問題之一。閆車太等[3]的研究表明，土壤被二氯喹啉酸污染后在10個月內(nèi)僅能種植水稻，12 個月后僅能種植煙草、茄子等農(nóng)作物。另外，LANG 等[4]的研究發(fā)現(xiàn)，土壤中二氯喹啉酸會被一些敏感的植物通過根、葉或發(fā)芽的種子吸收，從而激活1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶，最終導致氰化物和脫落酸在植物組織中積聚，嚴重的可致使植物死亡。二氯喹啉酸同樣會對土壤微生態(tài)造成嚴重影響。ZHANG 等[5]的研究表明，在未淹水和淹水的水稻土中，真菌和細菌的生物量在二氯喹啉酸含量為83.3 μg/kg 的條件下，呈現(xiàn)下降的趨勢，但在高含量二氯喹啉酸污染下細菌和真菌的生物量則呈現(xiàn)相反趨勢，嚴重影響土壤生態(tài)穩(wěn)定。解決土壤中二氯喹啉酸的藥害問題迫在眉睫。

微生物的代謝途徑多種多樣，在農(nóng)藥降解中應用前景廣闊，微生物修復也被廣泛應用于土壤重金屬和有機污染等領域，具有廣闊的應用前景。目前，研究者們通過分離不同環(huán)境下的微生物，獲得了能夠降解二氯喹啉酸的微生物，如呂鎮(zhèn)梅[6]從二氯喹啉酸污染的土壤中分離篩選出1株洋蔥伯克氏菌（Burkholderia cepacia），具有良好的二氯喹啉酸降解效果。路德維希腸桿菌（Enterobacter ludwigii）EM1 是一種對水體中二氯喹啉酸和鎘復合污染具有一定降解能力的菌株，可有效降低水體中二氯喹啉酸污染程度[7]，然而EM1 添加后對土壤中二氯喹啉酸污染的修復能力以及微生物群落變化的影響尚不清楚。因此，模擬二氯喹啉酸污染土壤，通過定量添加EM1菌劑，研究其作用前后一定時間內(nèi)對污染土壤中可培養(yǎng)菌落、酶活性、二氯喹啉酸含量的影響，并通過高通量測序方式對土壤中細菌多樣性進行測定，從而為土壤中二氯喹啉酸污染防治提供新思路。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗用土采自河南農(nóng)業(yè)大學文化路校區(qū)（E113° 66′98″，N34° 79′13″）1 號樓東南角花園，將其自然風干過2 mm篩子。

EM1 為河南農(nóng)業(yè)大學環(huán)境微生物實驗室分離得到的Enterobacter ludwigii菌株，初步研究后發(fā)現(xiàn)，該菌對二氯喹啉酸和重金屬鎘具有較好降解作用。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設置 采用盆栽試驗，每個花盆裝1 kg風干土，加入二氯喹啉酸至終含量為0.5 mg/kg。EM1以菌液的形式加入，每1 kg干土添加100 mL的EM1 菌液（OD600≈1）和140 mL 蒸餾水。對照土壤加入240 mL 的蒸餾水。試驗設置3 個處理，分別為無污染對照（CK）、二氯喹啉酸污染處理（QNC）、二氯喹啉酸污染EM1 修復處理（QNC+EM1），每組處理設置3個重復。試驗過程保持各處理土壤含水量為土壤最大持水量的60%。每隔5 d取樣1次。

1.2.2 土壤菌落計數(shù) 采用稀釋涂布平板法測定各處理土樣的細菌、放線菌和真菌數(shù)量。

1.2.3 土壤酶活性測定 脲酶、磷酸酶、蔗糖酶活性的測定分別采用苯酚鈉次氯酸鈉比色法、磷酸苯二鈉比色法、3，5-二硝基水楊酸比色法進行。

1.2.4 土壤中二氯喹啉酸含量測定 取風干土壤樣品5 g于50 mL離心管中。加入pH 值為10.0的硼砂緩沖液5 mL，靜置1 h，35 ℃、220 r/min 振蕩1 h。5 000 r/min離心20 min，上清液經(jīng)0.45μm 的有機相濾膜過濾，用HPLC 色譜儀（UltiMate 3000，Thermo Fisher，Netherlands）進行檢測，HPLC 色譜條件為：250 mm×4.6 mm，5 μm，Acclaim 120 C18 色譜柱，流動相為V（甲醇）∶V（0.2% 磷酸）=75∶25，流速1 mL/min，檢測波長240 nm，柱溫35 ℃。

1.2.5 土壤細菌多樣性測定 將培養(yǎng)35 d 的土壤樣品用Illumina 公司的MiSeq PE300 高通量測序平臺進行測序，獲得序列后利用生物信息學方法分析生物群落多樣性。

2 結果與分析

2.1 土壤可培養(yǎng)微生物對二氯喹啉酸污染及EM1修復的響應

2.1.1 細菌對二氯喹啉酸污染及EM1 修復的響應 由圖1可知，CK 土壤中的細菌數(shù)量呈先降低后增加再降低的變化趨勢，培養(yǎng)35 d 時土壤細菌數(shù)量少于培養(yǎng)0 d 時。在QNC 處理中，培養(yǎng)5～20 d 時細菌數(shù)量高于CK，其中培養(yǎng)15 d 時達到最高，為1.1×107cfu/g，相比CK 增加49.1%；培養(yǎng)25～30 d 時細菌數(shù)量低于CK；培養(yǎng)結束時相比CK 增加26.6%。在QNC+EM1 處理中，土壤細菌數(shù)量呈現(xiàn)先升高后降低再升高的變化趨勢，培養(yǎng)15 d 時細菌數(shù)量達到最大值，為1.7×107cfu/g，遠高于CK 和QNC 處理，相較于QNC 處理增加54.5%；培養(yǎng)結束時相比于CK和QNC 處理分別增加36.5%和15.6%。因此，添加降解菌EM1可明顯增加土壤中細菌的數(shù)量。

圖1 二氯喹啉酸污染及添加EM1后對土壤中細菌數(shù)量的影響Fig.1 Effect of quinclorac pollution and addition of EM1 on the number of bacteria in soil

2.1.2 放線菌對二氯喹啉酸污染及EM1 修復的響應 由圖2可知，CK 土壤中的放線菌數(shù)量隨處理時間的延長呈增長趨勢，培養(yǎng)25 d 時達到最大值，為0.9×106cfu/g。在QNC 處理中，土壤放線菌數(shù)量隨培養(yǎng)時間延長而增加，在培養(yǎng)30～35 d 時數(shù)量急劇減少，并且除第30 天之外，QNC 處理放線菌數(shù)量相比CK 均有所下降，培養(yǎng)結束時相較于CK 下降18.5%。在QNC+EM1處理中，培養(yǎng)35 d時放線菌數(shù)量高于培養(yǎng)0 d 時，在培養(yǎng)25～30 d 時低于QNC 處理，培養(yǎng)結束時相比CK 和QNC 處理分別增加6.7%和29.4%。

圖2 二氯喹啉酸污染及添加EM1后對土壤中放線菌數(shù)量的影響Fig.2 Effect of quinclorac pollution and addition of EM1 on the number of actinomycetes in soil

2.1.3 真菌對二氯喹啉酸污染及EM1 修復的響應 由圖3 可知，在CK 中，培養(yǎng)35 d 時的土壤真菌數(shù)量為3.9×104cfu/g，比培養(yǎng)0 d 時降低了24.1%。在QNC 處理中，土壤真菌數(shù)量在培養(yǎng)20 d時達到最大值，為5.6×104cfu/g；培養(yǎng)20～30 d 時真菌數(shù)量持續(xù)下降；培養(yǎng)結束時，QNC 處理真菌數(shù)量為4.9×104cfu/g，相比CK 增加25.3%。在QNC+EM1 處理中，土壤真菌數(shù)量在培養(yǎng)10、30 d時達到最低，均為3.7×104cfu/g，但土壤真菌數(shù)量在培養(yǎng)30～35 d 時出現(xiàn)反彈，與CK 和QNC 處理呈現(xiàn)相似趨勢。培養(yǎng)結束時QNC+EM1 處理相比CK 土壤真菌數(shù)量增加7.6%，相比QNC處理降低14.1%。

圖3 二氯喹啉酸污染及添加EM1后對土壤中真菌數(shù)量的影響Fig.3 Effect of quinclorac pollution and addition of EM1 on the number of fungi in soil

2.2 土壤酶活性對二氯喹啉酸污染及EM1修復的響應

2.2.1 脲酶對二氯喹啉酸污染及EM1 修復的響應 土壤中的脲酶活性變化如圖4 所示，3 個處理土壤脲酶活性均呈現(xiàn)先升高后降低再升高的變化趨勢。在CK 中，土壤脲酶活性在培養(yǎng)結束時高于培養(yǎng)0 d 時。在QNC 處理中，土壤脲酶活性在培養(yǎng)15 d 時最高，達到134.1 mg/（g·d），相比CK 增加35.9%，其余時間其脲酶活性與CK 差別較小。在QNC+EM1 處理中，土壤脲酶活性在培養(yǎng)10、25 d 時低于CK 和QNC 處理，在培養(yǎng)15 d 時相比CK 升高27.8%，培養(yǎng)結束時土壤脲酶活性與CK 無明顯差別，相比QNC處理下降6.8%。

圖4 二氯喹啉酸污染及添加EM1后對土壤脲酶活性的影響Fig.4 Effect of quinclorac pollution and addition of EM1 on soil urease activity

2.2.2 磷酸酶對二氯喹啉酸污染及EM1 修復的響應 土壤中的磷酸酶活性變化如圖5 所示，3 個處理的土壤磷酸酶活性均為先升高后降低的變化趨勢。QNC 處理的土壤磷酸酶活性在培養(yǎng)0～15 d 時升高，在培養(yǎng)25～35 d 時活性略低于CK，但不明顯。在QNC+EM1 處理中，土壤磷酸酶活性在培養(yǎng)25 d時達到最大值，為18.6 mg/（g·d），之后呈下降趨勢，但仍明顯高于CK 和QNC 處理。在培養(yǎng)結束時QNC+EM1 處理土壤磷酸酶活性相比CK 和QNC 處理分別上升135.8%和149.7%。

圖5 二氯喹啉酸污染及添加EM1后對土壤磷酸酶活性的影響Fig.5 Effect of quinclorac pollution and addition of EM1 on soil phosphatase activity

2.2.3 蔗糖酶對二氯喹啉酸污染及EM1 修復的響應 土壤中的蔗糖酶活性變化如圖6 所示，CK 與QNC 處理土壤蔗糖酶活性較穩(wěn)定。與CK 相比，QNC 處理蔗糖酶活性在培養(yǎng)5、25、35 d 時略高于CK，但2 個處理蔗糖酶活性無明顯差異。QNC+EM1 處理蔗糖酶活性呈增長趨勢，且增幅較大，培養(yǎng)5～35 d 時明顯高于其他2 個處理；在培養(yǎng)35 d 時達到最大值，為69.1 mg/（g·d），相比CK 和QNC 處理分別提升224.4%和199.9%。以上表明，添加降解菌EM1可明顯提升污染土壤中蔗糖酶活性。

圖6 二氯喹啉酸污染及添加EM1后對土壤蔗糖酶活性的影響Fig.6 Effect of quinclorac pollution and addition of EM1 on soil invertase activity

2.3 不同處理土壤中二氯喹啉酸的質量濃度變化

由圖7 可知，2 個處理二氯喹啉酸質量濃度均呈下降趨勢。QNC 處理土壤中二氯喹啉酸質量濃度在培養(yǎng)35 d 時達到最低，為0.20 mg/L，相比培養(yǎng)0 d 時下降23.9%。QNC+EM1 處理培養(yǎng)0～10 d 時二氯喹啉酸的質量濃度持續(xù)下降；培養(yǎng)10～15 d 時有所回升；培養(yǎng)15～35 d 時二氯喹啉酸的降解速度明顯加快；培養(yǎng)35 d 時達到最低，為0.05 mg/L，相比培養(yǎng)0 d 時下降82.3%，相比QNC 處理下降76.7%。綜上，添加降解菌EM1可明顯降低土壤中二氯喹啉酸的質量濃度。

圖7 二氯喹啉酸污染及EM1修復對二氯喹啉酸質量濃度的影響Fig.7 Effect of quinclorac pollution and EM1 remediation on quinclorac concentration

2.4 細菌群落Alpha多樣性對二氯喹啉污染及EM1修復的響應

3 種處理土壤中的細菌群落Alpha 多樣性指數(shù)見表1。由表1 可知，QNC 處理的Chao1 和Shannon指數(shù)大于CK，說明QNC處理細菌總數(shù)高于CK，且細菌群落多樣性增加。QNC+EM1 處理的Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)較QNC 處理有所降低，說明添加降解菌EM1降低了土壤中的細菌豐度和群落多樣性。

表1 二氯喹啉酸污染及EM1修復土壤的細菌群落Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計Tab.1 Statistics on the Alpha diversity index of bacterial communities in soils with quinclorac pollution andremediation by EM1

2.5 細菌群落的組成對二氯喹啉酸污染及EM1修復的響應

如圖8 所示，3 個處理細菌豐度最高的門為變形菌門（Proteobacteria），其次為擬桿菌門（Bacteroidetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）。QNC 處理與CK 相比，芽單胞菌門的豐度增長5.3 個百分點，厚壁菌門的豐度降低5.6 個百分點，疣微菌門（Verrucomicrobia）和浮霉菌門（Planctomycetes）作為新優(yōu)勢菌門出現(xiàn)，原優(yōu)勢菌門單糖菌門（Saccharibacteria）消失。QNC+EM1 處理相比QNC處理，變形菌門豐度增加15.1 個百分點，芽單胞菌門和酸桿菌門豐度降低10.7 個百分點和5.5 個百分點，原優(yōu)勢菌門疣微菌門、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）和浮霉菌門消失。

圖8 二氯喹啉酸污染及EM1修復土壤的細菌群落組成分析Fig.8 Analysis of bacterial community composition in soils with of quinclorac pollution and remediation by EM1

2.6 細菌群落Beta多樣性對二氯喹啉酸污染及EM1修復的響應

由圖9 可知，主成分1 和主成分2 分別占53.8%和21.8%，不同顏色的點代表不同的樣本分組情況，橫、縱坐標軸的刻度代表相對距離。其中，QNC 處理與CK 的離散距離較小，表明QNC 處理對土壤細菌群落結構的影響較小。QNC+EM1處理與QNC 處理離散距離增大，表明添加降解菌EM1對二氯喹啉酸污染土壤細菌群落結構的影響較大。

圖9 二氯喹啉酸污染及EM1修復土壤的主成分分析Fig.9 Principal component analysis of remediation with quinclorac pollution and EM1 remediation soils

2.7 土壤細菌群落相互作用對二氯喹啉酸污染的響應

圖10 為QNC 處理對土壤細菌群落相互作用的影響。不同顏色的點代表所屬的門不同，點的大小代表種群豐度的大小。其中藍色線代表負相關，紅色線代表正相關，線的粗細代表相關性的大小。由圖10 可以看出，相互作用主要發(fā)生在酸桿菌門、變形菌門、擬桿菌門、芽單胞菌門以及厚壁菌門之間，豐度最大的種群為變形菌門。各菌門之間總計有21 對作用關系，其中互為正相關關系的有13 對，互為負相關關系的有8 對。其中，變形菌門與較多的菌門存在相關關系，芽單胞菌門、厚壁菌門與變形菌門和酸桿菌門之間主要為正相關關系，但擬桿菌門與其他菌門之間為負相關關系。

圖10 二氯喹啉酸污染對土壤細菌群落相互作用的影響Fig.10 Effect of quinclorac pollution on the interaction of soil bacterial community

由圖11 可以看出，QNC+EM1 處理土壤細菌群落相互作用主要發(fā)生在酸桿菌門、變形菌門、擬桿菌門、芽單胞菌門以及厚壁菌門之間，豐度最大的種群為變形菌門。各菌門之間總計有16 對作用關系，互為正相關關系的有11 對，互為負相關關系的有5對，其中變形菌門與較多的菌門存在相關關系，芽單胞菌門、厚壁菌門與變形菌門和酸桿菌門之間主要為負相關關系，擬桿菌門與其他菌門為正相關關系。

圖11 EM1修復對土壤細菌群落相互作用的影響Fig.11 Effect of remediation by EM1 on the interaction of soil bacterial community

3 結論與討論

通過研究二氯喹啉酸污染以及添加降解菌EM1 對土壤可培養(yǎng)微生物的數(shù)量、土壤酶活性和土壤細菌群落多樣性的影響，探討土壤微生物群落對二氯喹啉酸污染以及降解菌EM1的響應，為研究污染物的生態(tài)毒性機制提供理論數(shù)據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，二氯喹啉酸污染和降解菌EM1 對土壤可培養(yǎng)微生物的數(shù)量、土壤酶活性和土壤細菌群落多樣性均有不同程度的影響。

QNC 處理與CK 相比，培養(yǎng)15 d 時土壤細菌數(shù)量增加49.1%，培養(yǎng)25～30 d 時的細菌數(shù)量低于CK；除第30天之外，放線菌數(shù)量相比CK有所下降，培養(yǎng)結束時下降了18.5%；培養(yǎng)20 d時真菌數(shù)量最大，為5.6×104cfu/g，培養(yǎng)結束時相比CK 增加了25.3%。QNC+EM1 處理細菌數(shù)量在培養(yǎng)15 d 時達到最大，為1.7×107cfu/g，培養(yǎng)35 d 時相比QNC 處理增加15.6%；放線菌數(shù)量在培養(yǎng)結束時相比QNC 處理增加了29.4%；真菌數(shù)量在培養(yǎng)結束時下降14.1%。張妤等[8]的研究表明，高含量二氯喹啉酸對土壤微生物總量、細菌及真菌生物量有促進作用，低含量二氯喹啉酸對細菌生物量有一定的抑制作用。添加降解菌EM1 增加二氯喹啉酸污染土壤中細菌數(shù)量，提高土壤微生物總量，側面反映出土壤二氯喹啉酸污染程度下降。

QNC 處理土壤脲酶活性在培養(yǎng)15 d 時達到最高，為134.1 mg/（g·d），培養(yǎng)結束時與CK 相比無明顯差異；磷酸酶活性在培養(yǎng)0～15 d時升高，培養(yǎng)25～35 d 時酶活性略低于CK；蔗糖酶活性相比CK 無明顯差異。QNC+EM1 處理相比QNC 處理，脲酶活性在培養(yǎng)結束時下降6.8%；磷酸酶活性增幅較大，培養(yǎng)25 d 時達到最大，為18.6 mg/（g·d），培養(yǎng)結束時相比QNC 處理提升149.7%；蔗糖酶活性在5～35 d時明顯增加，培養(yǎng)35 d時達到最大，為69.1 mg/（g·d），相比QNC 處理提升199.9%。已有研究表明，土壤在二氯喹啉酸脅迫下，會導致脲酶活性升高，蔗糖酶活性下降[9‐10]。本研究添加降解菌EM1 后蔗糖酶活性提高，脲酶活性下降，表明添加降解菌EM1 緩解了土壤二氯喹啉酸脅迫，但不同研究得出土壤酶活性對同一污染物的響應程度并不一致[11]。因此，在今后研究中，應進一步探索土壤酶活性對不同土壤質地污染程度的響應。

QNC+EM1 處理二氯喹啉酸質量濃度在培養(yǎng)0～10 d 和培養(yǎng)15～35 d 時持續(xù)下降，相比QNC 處理在培養(yǎng)結束時下降了76.7%。表明添加降解菌EM1可促進土壤中二氯喹啉酸的降解。

QNC 處理與CK 相比，Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)均有不同程度的增加，土壤細菌較CK 而言分布更為均勻，且多樣性增加。QNC+EM1 處理的Chao1指數(shù)和Shannon 指數(shù)較QNC 處理有所降低，原因可能是降解菌EM1 增強了土壤中降解二氯喹啉酸的細菌的競爭力，而不能降解二氯喹啉酸的細菌被抑制，造成群落多樣性降低[12]。3 個處理中豐度最高的優(yōu)勢菌門均為變形菌門（Proteobacteria），已有研究認為變形菌門在土壤[13]、淡水[14]、大氣[15]等環(huán)境中普遍存在，可能與碳利用有關[16]。變形菌門的生理學和形態(tài)學多樣性強，能夠適應多種復雜環(huán)境，相比其他微生物更具競爭優(yōu)勢[17]。在QNC 處理中出現(xiàn)了新的優(yōu)勢菌門[疣微菌門（Verrucomicrobia）和浮霉菌門（Planctomycetes）]，原優(yōu)勢菌門單糖菌門（Saccharibacteria）消失；添加降解菌EM1 后，原優(yōu)勢菌門疣微菌門、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）和浮霉菌門消失，表明添加降解菌EM1可明顯影響土壤細菌群落結構。本研究中擬桿菌門（Bacteroidetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）始終作為優(yōu)勢菌門，豐度較大。已有研究表明，擬桿菌門對維持菌群平衡具有重要作用[18]。酸桿菌門作為土壤微生物的重要組成部分，在土壤的物質循環(huán)和生態(tài)環(huán)境的構建過程中起著非常重要的作用[19‐21]。土壤細菌群落多樣性分析結果表明，3 個處理之間的土壤細菌群落多樣性在Alpha 多樣性、Beta 多樣性、物種組成和群落結構相似度上均有差異，添加降解菌EM1前后的群落多樣性指數(shù)差異更為明顯，表明添加降解菌EM1使得土壤中的細菌分布更為不均。黃思琦[12]研究發(fā)現(xiàn)，二氯喹啉酸降解菌纖維單胞菌（Cellulosimicrobiumsp.）的添加可導致變形菌門豐度增高，這與本研究的結果相似，或許是因為降解菌EM1促進了變形菌門豐度的增加。主成分分析結果表明，添加降解菌EM1 明顯改變了土壤細菌群落結構。通過網(wǎng)絡互作圖可知，降解菌EM1 使細菌之間相關關系數(shù)量減少。

綜上，添加降解菌EM1 可有效修復二氯喹啉酸污染土壤，具有一定的應用前景。