李中波，侯強(qiáng)紅，李 暉，舒 鳴

（1. 懷化職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 懷化 418000；2. 湘西民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 吉首 416000）

呂氏泰勒蟲(chóng)（Theileria luwenshun）為一種常見(jiàn)且重要的蜱傳性血液原蟲(chóng)[1]，隸屬于泰勒科、泰勒屬[2]，寄生于山羊、綿羊的紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)[3]，可引發(fā)一種以發(fā)熱、貧血、黃疸、消瘦、體表淋巴結(jié)腫大及拉血紅蛋白尿?yàn)樘卣餍耘R床癥狀的血液原蟲(chóng)病——羊泰勒蟲(chóng)病[4‐5]。呂氏泰勒蟲(chóng)1914 年首次被發(fā)現(xiàn)于埃及的患病羊只[6]，而后世界上多個(gè)國(guó)家和地區(qū)（如歐洲、非洲、中東及亞洲）陸續(xù)有報(bào)道[7]，尤以熱帶、亞熱帶地區(qū)流行最為普遍[8]。呂氏泰勒蟲(chóng)因具有較強(qiáng)的感染力和致病力，且分布廣泛，已成為我國(guó)范圍寄主的優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)株之一[9]。該蟲(chóng)一旦感染羊只，可引起被感染羊只出現(xiàn)發(fā)熱、溶血性黃疸、貧血、消瘦及拉血紅蛋白尿等癥狀[4‐5]，如救治不及時(shí)或不當(dāng)可導(dǎo)致羊只大量死亡[10]，給養(yǎng)殖戶(hù)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。鐘維等[11]調(diào)查四川阿壩州牦牛及藏綿羊中呂氏泰勒蟲(chóng)的感染情況，發(fā)現(xiàn)其感染率高達(dá)75%。此外，多種因素影響呂氏泰勒蟲(chóng)病的流行，如氣候環(huán)境對(duì)呂氏泰勒蟲(chóng)的分布影響極大[12]。地理位置的阻隔，在一定程度上也會(huì)影響呂氏泰勒蟲(chóng)的基因交流、種群結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育。地理位置為呂氏泰勒蟲(chóng)的物種多樣性、遺傳多樣性和單倍型多樣性提供先決條件。

單倍體基因型簡(jiǎn)稱(chēng)單倍型，是指在一染色單體上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)意義的一類(lèi)單核苷酸多態(tài)性[13]。我國(guó)地域?qū)拸V，地理、氣候多樣，是造就物種多樣性的基本條件。同一物種為快速適應(yīng)棲息地的環(huán)境和氣候，往往在自身的形態(tài)及遺傳結(jié)構(gòu)等方面發(fā)生變化，形成單倍型多態(tài)性及個(gè)體多樣性。然而，一個(gè)物種的單倍型多樣性及遺傳多樣性又是研究物種遺傳資源保護(hù)不可或缺的內(nèi)容。因此，研究一個(gè)物種的單倍型多態(tài)性和種系發(fā)育關(guān)系，不僅為物種遺傳資源保護(hù)提供重要的信息和理論基礎(chǔ)，而且還有助于今后理解該物種在自然環(huán)境中的進(jìn)化過(guò)程，因而這方面的研究已越來(lái)越受到人們的重視和關(guān)注。迄今為止，國(guó)內(nèi)外已開(kāi)展諸多關(guān)于寄生蟲(chóng)的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)、單倍型多態(tài)性及種系發(fā)育關(guān)系等方面的研究。AMZATI 等[14]基于線(xiàn)粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅰ（cox1）基因和12S rRNA序列研究具尾扇頭蜱（Rhipicephalus appendiculatus）的種群結(jié)構(gòu)和單倍型；MALATJI 等[15]基于cox1基因分析雞蛔蟲(chóng)（Ascaridia galli）的遺傳結(jié)構(gòu)和單倍型。我國(guó)僅有馮雪皎[16]基于線(xiàn)粒體cox1、16S rDNA 和核糖體ITS-2 基因?qū)? 個(gè)地理種群長(zhǎng)角血蜱（Haemaphysalis longicornis）的單倍型及遺傳多樣性進(jìn)行研究。

核糖體、線(xiàn)粒體基因均具有進(jìn)化速度快、缺乏基因重組及母系遺傳等特征[17‐19]。目前，核糖體、線(xiàn)粒體基因已廣泛應(yīng)用于種群結(jié)構(gòu)、分子標(biāo)記、生物進(jìn)化、種系發(fā)育、物種鑒定、單倍型及進(jìn)化基因組學(xué)等方面研究[20‐21]。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究集中在某一寄生蟲(chóng)的鑒定、歸類(lèi)、形態(tài)描述、遺傳進(jìn)化關(guān)系及其所攜病原微生物檢測(cè)等方面，鮮有學(xué)者就某一寄生蟲(chóng)的單倍型多樣性進(jìn)行研究。湘西地區(qū)毗鄰云貴高原，為多山陵地帶，轄區(qū)內(nèi)含有極為豐富的蜱種，然其內(nèi)溝壑縱橫，氣候多變，交通極為不便，給蜱蟲(chóng)的生殖交流造成一定程度上的地理隔離，間接為呂氏泰勒蟲(chóng)個(gè)體及遺傳多樣性的形成提供了先決條件，但關(guān)于這一地區(qū)呂氏泰勒蟲(chóng)單倍型多樣性及種系發(fā)育關(guān)系等方面的研究甚少。因此，對(duì)該地區(qū)羊源呂氏泰勒蟲(chóng)的單倍型多態(tài)性及種系發(fā)育關(guān)系進(jìn)行研究，不僅有助于該地區(qū)醫(yī)學(xué)、公共衛(wèi)生事業(yè)及畜牧業(yè)的發(fā)展，還可為今后泰勒蟲(chóng)病的分子流行病學(xué)調(diào)查、診斷、防控及相關(guān)藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。為此，以16株來(lái)自湘西地區(qū)的羊源性呂氏泰勒蟲(chóng)為樣品，采用PCR 擴(kuò)增其18S rRNA、cox1基因序列，分析呂氏泰勒蟲(chóng)的單倍型多態(tài)性及種系發(fā)育關(guān)系，為泰勒蟲(chóng)的種類(lèi)鑒定、分類(lèi)提供依據(jù)，并為該地區(qū)泰勒蟲(chóng)病的診斷、控制及分子流行病學(xué)調(diào)查提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

含有泰勒蟲(chóng)的山羊血液由湘西民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院寄生蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室提供，將血液分別編號(hào)為XT1—XT16，置于-20 ℃保存，備用。

1.2 主要試劑

動(dòng)物血液、組織DNA 提取試劑盒購(gòu)買(mǎi)于北京天根有限公司；Taq高保真酶（Mix）購(gòu)自寶生物工程（大連)有限公司；蛋白酶K 和DL2000 DNA Marker均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；電泳緩沖液購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.3 DNA提取

根據(jù)血液、組織DNA 提取試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)，分別提取16 株呂氏泰勒蟲(chóng)的基因組DNA。再將提取好的DNA樣品置于-20 ℃保存、備用。

1.4 目的基因的擴(kuò)增、測(cè)序

根據(jù)NCBI 所公布呂氏泰勒蟲(chóng)的18S rRNA、cox1基因序列，設(shè)計(jì)2 對(duì)特異性引物（敏感度為0.047 ng/μL），即18S rRNA-F：5′-AACCTGGTTGAT‐CCTGCCAGTAGTCAT-3′，18S rRNA-R：5′-GATCC‐TTCTGCAGGTTCACCTAC-3′和cox1-F：5′-TGACT‐GGACTGTTTGGTGG-3′，cox1-R：5′-TGAGAAACC‐AGCGAAGTGC-3′，分別對(duì)16 株羊源呂氏泰勒蟲(chóng)的18S rRNA、cox1基因序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[22]。PCR 擴(kuò)增體系（總體積均為50μL）：Taq高保真酶（Mix）25μL，DNA 模板1 μL，上下游引物各1 μL，dH2O 22 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃/56 ℃（18S rRNA/cox1)退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃均再延伸5 min。待PCR 反應(yīng)完成后，從每個(gè)反應(yīng)體系取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀(guān)察結(jié)果并拍照。將所有陽(yáng)性PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，獲得呂氏泰勒蟲(chóng)18S rRNA、cox1基因的部分序列。

1.5 序列比對(duì)、校準(zhǔn)和對(duì)齊

將所獲得的18S rRNA、cox1基因序列分別進(jìn)行BLAST 分析比對(duì)，再運(yùn)用軟件Clustal X 分別對(duì)所獲得的18S rRNA、cox1基因序列進(jìn)行校準(zhǔn)和對(duì)齊[23]。

1.6 變異位點(diǎn)與單倍型多樣性分析

基于所獲得的18S rRNA、cox1及18S rRNA+cox1基因序列，運(yùn)用軟件DNAStar[24]分析基因變異位點(diǎn)；運(yùn)用軟件DnaSP 5.0[25]、Network 4.6[26]及Arlequin version 3.0[27]分析單倍型多樣性。

1.7 種系發(fā)育關(guān)系分析

基于18S rRNA+cox1基因序列，以所獲呂氏泰勒蟲(chóng)及從NCBI 中下載的呂氏泰勒蟲(chóng)蟲(chóng)株Li2（JF719831、JQ518295）、Li6（JF719833、JQ518296），尤氏泰勒蟲(chóng)（Theileria uilenbergi）（JF719835、JQ518295），馬泰勒蟲(chóng)（Theileria equi）（KY111761、MF510491）及小泰勒蟲(chóng)（Theileria parva）（L02366、AB499089）為內(nèi)群，并以雙芽巴貝斯蟲(chóng)（Babesia bigemina）（JQ723014、AB499085）為外群，運(yùn)用軟件Clustal X、PhyML 3.0[28]及MEGA 5.0[29]，采用最大相似法（ML）和GTR+I+G 模型（bootstrap=100）對(duì)呂氏泰勒蟲(chóng)的種系發(fā)育關(guān)系進(jìn)行分析，再運(yùn)用軟件FigTree v1.3.1[30]描繪所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲(chóng)18S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲(chóng)18S rRNA 基因的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1 可以看出，16 個(gè)PCR 產(chǎn)物均為陽(yáng)性，每個(gè)泳道只含1 個(gè)條帶，無(wú)明顯雜帶，且大小與預(yù)期一致，均約為400 bp。

圖1 湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲(chóng)18S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of 18S rRNA gene of T.luwenshun from western Hunan

2.2 湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲(chóng)cox1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲(chóng)cox1基因序列的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2 可以看出，16 個(gè)PCR 產(chǎn)物均為陽(yáng)性，每個(gè)泳道只含1 個(gè)條帶，無(wú)明顯雜帶，且大小與預(yù)期一致，均約為1 100 bp。

圖2 湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲(chóng)cox1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification of cox1 gene of T.luwenshun from western Hunan

2.3 湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲(chóng)18S rRNA、cox1基因序列的測(cè)序、校準(zhǔn)、對(duì)齊與提交

測(cè)序結(jié)果顯示，湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲(chóng)18S rRNA、cox1基因序列長(zhǎng)度分別處于387～398 bp 和1 096～1 102 bp。利用軟件Clustal X 分別校準(zhǔn)、對(duì)齊所有18S rRNA、cox1基因序列，最終得到18S rRNA基因序列的長(zhǎng)度均為384 bp，cox1基因序列長(zhǎng)度均為1 092 bp。將所有處理后的18S rRNA、cox1基因序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析，結(jié)果顯示，湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲(chóng)的18S rRNA、cox1基因序列與GenBank 中呂氏泰勒蟲(chóng)的相似度為98%～100%，從而確認(rèn)所獲序列均為目的基因序列。將湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲(chóng)18S rRNA、cox1基因序列提交到NCBI，獲得18S rRNA 基因登錄號(hào)MW750496—MW750511，cox1基因登錄號(hào)MW937264—MW937279。

2.4 湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲(chóng)18S rRNA、cox1基因序列的變異位點(diǎn)分析

基于上述的18S rRNA、cox1基因序列，分別對(duì)湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲(chóng)18S rRNA、cox1及18S rRNA+cox1基因序列的變異位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1 可知，在呂氏泰勒蟲(chóng)18S rRNA（384 bp）基因序列中共含有9 個(gè)變異位點(diǎn)（轉(zhuǎn)換7 個(gè)，顛換2 個(gè)）；cox1（1 092 bp）基因序列中共存在2 個(gè)變異位點(diǎn)（轉(zhuǎn)換2 個(gè)，顛換0 個(gè)）；18S rRNA+cox1基因序列中，共包含11個(gè)變異位點(diǎn)（轉(zhuǎn)換9個(gè)，顛換2個(gè)）。

表1 湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲(chóng)18S rRNA、cox1和18S rRNA+cox1變異位點(diǎn)Tab.1 The variable sites in 18S rRNA，cox1 and 18S rRNA+cox1 sequences of T.luwenshun from western Hunan

2.5 湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲(chóng)單倍型多樣性分析

運(yùn)用軟件DnaSP 5.0、Network 4.6 及Arlequin version 3.0 分別對(duì)湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲(chóng)18S rRNA、cox1及18S rRNA+cox1基因序列的單倍型多樣性進(jìn)行分析（圖3）。由圖3 可知，湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲(chóng)18S rRNA 基因序列含有7 個(gè)單倍型（h=7，A1—A7，Hd=0.775）；cox1基因序列共包含4 個(gè)單倍型（h=4，B1—B4，Hd=0.625）；18S rRNA+cox1基因序列共存在10個(gè)單倍型（h=10，C1—C10，Hd=0.925）。在A單倍型中，單倍型A1 共包含7 個(gè)序列，即XT7、XT10、XT11、XT13、XT14、XT15、XT16；單倍型A4包含4個(gè)序列，即XT1、XT2、XT3和XT4；而剩下的單倍型，每個(gè)單倍型只包含1 個(gè)序列。在B 單倍型中，單倍型B1 所包含的序列最多，共8 個(gè)，即XT1、XT2、XT4、XT5、XT11、XT12、XT13 和XT16；B2 包含2 個(gè)序列，即XT8 和XT10；B3 包含3 個(gè)序列（XT3、XT14、XT15）；B4 也包含3 個(gè)序列，即XT6、XT7 和XT9。在C 單倍型中，單倍型C1（XT1、XT2、XT4）、C8（XT10、XT14、XT15）和C9（XT11、XT13、XT16）均含3個(gè)序列，其余的單倍型僅含1個(gè)序列。此外，在A、B 及C 單倍型中，A1、A4、B1、B3、B4、C1、C8 與C9 均為古老單倍型，均分別包含呂氏泰勒蟲(chóng)18S rRNA及cox1基因的古老序列。

圖3 湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲(chóng)18S rRNA（A）、cox1（B）和18S rRNA+cox1（C）基因序列單倍型網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Network maps of 18S rRNA（A），cox1（B）and 18S rRNA+cox1（C）haplotypes of T.luwenshun from western Hunan

2.6 湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲(chóng)的種系發(fā)育分析

湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲(chóng)的種系發(fā)育分析結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4可以看出，該系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)共包含3個(gè)分支（CladeⅠ—Ⅲ），其中分枝CladeⅡ由16 株來(lái)自于湘西地區(qū)的羊源呂氏泰勒蟲(chóng)與來(lái)源甘肅的呂氏泰勒蟲(chóng)株Li2及Li6共同形成，而馬泰勒蟲(chóng)則單獨(dú)形成系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的分支CladeⅠ，尤氏泰勒蟲(chóng)與小泰勒蟲(chóng)則共同形成該系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的分支Clade Ⅲ。此外，CladeⅡ與Clade Ⅲ位于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的一大分支上，與CladeⅠ相分離。

圖4 湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲(chóng)種系發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of T.luwenshun from western Hunan

3 結(jié)論與討論

變異位點(diǎn)分析結(jié)果顯示，湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲(chóng)cox1基因序列（1 092 bp）共包含2個(gè)變異位點(diǎn)，且均為轉(zhuǎn)換型，而在18S rRNA 基因序列（384 bp）中，共包含9個(gè)變異位點(diǎn)，7 個(gè)為轉(zhuǎn)換型，2 個(gè)為顛換型。兩者相比，發(fā)現(xiàn)cox1基因序列所包含的變異位點(diǎn)顯著低于18S rRNA基因序列，這與前人研究結(jié)果相一致[23，31]，也與核糖體基因具有高突變的特點(diǎn)相符合[32‐33]，表明cox1基因序列的保守性高于18S rRNA基因序列，暗示cox1基因序列更適合用于物種的遺傳變異分析，而18S rRNA因具有種內(nèi)差異大的特點(diǎn)不適于遺傳變異分析，這與林瑞慶等[34]認(rèn)為ITS 存在種內(nèi)差異大、不適合作為犬復(fù)孔絳蟲(chóng)種的遺傳標(biāo)記相吻合。

根據(jù)呂氏泰勒蟲(chóng)18S rRNA、cox1及18S rRNA+cox1基因序列的單倍型多樣性的分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)18S rRNA、cox1及18S rRNA+cox1基因序列的單倍型均未出現(xiàn)聚集成群的現(xiàn)象和單倍型多樣性的值均較低，且存在多個(gè)共同古老的單倍型（A1、A4、B1、B3、B4、C1、C8、C9），說(shuō)明這16 株來(lái)源于湘西地區(qū)的羊源呂氏泰勒蟲(chóng)單倍型之間關(guān)系較近，并擁有共同的祖先，存在呂氏泰勒蟲(chóng)18S rRNA及cox1基因的古老序列，表明16株來(lái)源于湘西地區(qū)的羊源呂氏泰勒蟲(chóng)之間雖有一定程度的基因變異和單倍型多樣性，但尚未出現(xiàn)遺傳分化的現(xiàn)象。

在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，來(lái)自湘西地區(qū)的16株羊源性呂氏泰勒蟲(chóng)與Li2及Li6兩蟲(chóng)株相互摻雜在一起，共同形成該系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的分枝Clade Ⅱ，這說(shuō)明湘西地區(qū)的16株羊源呂氏泰勒蟲(chóng)之間及與Li2、Li6兩蟲(chóng)株之間的親緣關(guān)系較近；所選的尤氏泰勒蟲(chóng)及小泰勒蟲(chóng)則共同形成該系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的Clade Ⅲ，這說(shuō)明尤氏泰勒蟲(chóng)與小泰勒蟲(chóng)之間的親緣關(guān)系近；而分支Clade Ⅱ雖與Clade Ⅲ相分離，但均位于該系統(tǒng)發(fā)育的一個(gè)大分支上；由馬泰勒蟲(chóng)單獨(dú)所形成的分支Clade Ⅰ卻獨(dú)立位于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的另一個(gè)大分支上，這表明呂氏泰勒蟲(chóng)與尤氏泰勒蟲(chóng)、小泰勒蟲(chóng)的親緣關(guān)系較馬泰勒蟲(chóng)近。以上結(jié)果表明，來(lái)自湘西地區(qū)的16 株羊源性呂氏泰勒蟲(chóng)之間及與外域性蟲(chóng)株的親緣關(guān)系近，無(wú)遺傳分化現(xiàn)象，與上述種內(nèi)差異和單倍型多樣性分析的結(jié)果相一致。此外，該結(jié)果也表明，呂氏泰勒蟲(chóng)與尤氏泰勒蟲(chóng)、小泰勒蟲(chóng)的親緣關(guān)系近于馬泰勒蟲(chóng)，且尤氏泰勒蟲(chóng)與小泰勒蟲(chóng)之間具有較近的親緣關(guān)系。

本研究中，來(lái)自湘西地區(qū)的16株羊源呂氏泰勒蟲(chóng)之間雖存在一定程度的基因變異、遺傳多樣性及單倍型多樣性，但它們個(gè)體之間、單倍型之間及與外域性呂氏泰勒蟲(chóng)株（Li2、Li6）之間存在較近的親緣關(guān)系，尚未出現(xiàn)遺傳分化的現(xiàn)象。