劉 勇 肖旦望 秦 藝 陳 靜 陳婉瑜 熊興華,*

(1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家油料改良中心湖南分中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/湖南省水稻油菜抗病育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖南 長(zhǎng)沙 410128)

三酰甘油(triglycerides，TAG)是植物種子中油脂的主要儲(chǔ)藏形式，在生物體內(nèi)均通過酶促機(jī)制合成[1-2]。溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶(lysophosphatidic acid acyltransferase，LPAT)是TAG生物合成的重要限速酶，在植物油脂合成、種子發(fā)育以及生物膜形成等方面有重大作用[3-5]。脂肪酸在植物種子中主要以TAG的形式存在，是構(gòu)成植物油脂的主要成分，并參與植物多數(shù)代謝反應(yīng)[6-8]。菜籽油中富含人體所需的多種長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值可與橄欖油(Olea)媲美[9-10]。LPAT基因具有調(diào)控Kennedy途徑中的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸裝配TAG的sn-2位上的功能[11-13]。尹永泰[14]通過同源克隆甘藍(lán)型油菜BnaLPATs基因并進(jìn)行亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，BnaLPAT1基因定位于葉綠體，屬于質(zhì)體型LPAT，其他拷貝均定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，屬于微粒體型LPAT，并對(duì)LPAT基因功能進(jìn)行了初步鑒定。肖旦望等[15]通過GUS基因染色法(B-Glucuronidase)確定了BnaLPAT4基因主要在油菜花器官和角果中表達(dá)，推測(cè)BnaLPAT4基因具有調(diào)控油菜油脂合成的功能。為驗(yàn)證BnaLPAT4基因?qū)Ω仕{(lán)型油菜油脂合成的影響，提高油菜種子油脂含量，本試驗(yàn)通過參考洪波等[16]的方法構(gòu)建BnaLPAT4表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母和擬南芥，并通過氣相色譜法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因株中的脂肪酸組分，分析BnaLPAT4基因在油菜油脂合成的作用，旨在為指導(dǎo)油菜育種提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料及菌株 野生型擬南芥(哥倫比亞型)和釀酒酵母菌株(INVSC 1)均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料作物研究所提供；甘藍(lán)型油菜湘油15、野生型擬南芥由湖南省水稻油菜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。INVSC 1酵母菌株和YES2.0表達(dá)質(zhì)粒、過表達(dá)載體pBI121(napin)-LPAT4的構(gòu)建均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1.2 試劑材料 質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物股份有限公司；酵母轉(zhuǎn)化試劑盒購(gòu)自上海懋康生物有限公司；引物由湖南擎科生物公司設(shè)計(jì)；其他試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 擬南芥總RNA提取及cDNA合成 取光照培養(yǎng)箱內(nèi)生長(zhǎng)的擬南芥種子50～100 mg置于2.0 mL離心管中，加入鋼珠和液氮后于磨樣機(jī)中充分研磨，參照北京全式金生物公司植物總RNA提取試劑盒(TransZol Up Plus RNA Kit)說明書提取擬南芥種子總RNA。以擬南芥種子總RNA為模板，通過北京百邁客生物公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒(BiomarkerScript Ⅱ 1stStrand cDNA Synthesis Kit)合成cDNA第一鏈。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μL：RNA模板2 μL， d(T)23VN(50 μmol·L-1) 2 μL, 10 mmol·L-1dNTPs 1 μL, ddH2O 3 μL, BiomarkerScript Ⅱ Reaction Mix (2X)10 μL，BiomarkerScript Ⅱ Reaction Mix (10X)2 μL，將上述試劑混合均勻后置于離心機(jī)上8 000 r·min-1離心15 s。反應(yīng)程序：42℃孵育1 h；80℃加熱5 min使酶失活； -20℃ 保存。逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)反應(yīng)體系10 μL：cDNA 1 μL， 2×Tap Plus Master Mix Ⅱ 5 μL，正反引物各0.4 μL，ddH2O 3.2 μL。反應(yīng)程序；95℃預(yù)變性3 min，95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s，30～35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸7 min，4℃保存。

1.2.2 YES2.0表達(dá)載體的構(gòu)建 甘藍(lán)型油菜BnaLPAT4基因的基因編碼序列(coding sequence,CDS)來源于Enesembl plants(http://plants. Ensembl. org/index. html)數(shù)據(jù)庫(kù)。CTAB法提取甘藍(lán)型油菜湘油15號(hào)葉片DNA，通過Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)BnaLPAT4基因克隆引物。在2個(gè)基因上游引物5′處添加SacI(GAGCTC)和保護(hù)堿基(C)，下游引物5′處添加EcoRI(GAATTC)和保護(hù)堿基(G)，引物設(shè)計(jì)如表1所示。PCR反應(yīng)體系為20 μL：cDNA模板1 μL，Tap Polymerase 高保真酶0.5 μL，上下游引物各 1 μL， 2.5 mmol·L-1dNTP 2 μL，10×Buffer 2 μL，ddH2O 12.5 μL。PCR反應(yīng)程序；95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸90 s，33個(gè)循環(huán)；終延伸15 min。取上述反應(yīng)產(chǎn)物4 μL于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行檢測(cè)，使用SacI和EcoRI兩種內(nèi)切酶對(duì)回收產(chǎn)物片段和YES2.0表達(dá)載體分別進(jìn)行雙酶切。體系為10 μL：10× buffer 1 μL，PCR產(chǎn)物5 μL，Sac I酶0.2 μL，EcoRI酶0.2 μL，ddH2O 3.6 μL。37℃條件下反應(yīng)過夜，回收酶切片段后，連接至YES2.0載體中。反應(yīng)體系10 μL：酶切產(chǎn)物2.5 μL，T4 ligease 0.5 μL，載體1 μL，10×buffer 2 μL，ddH2O 4 μL。置于恒溫箱中16℃過夜培養(yǎng)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(DH5α)后平板培養(yǎng)，挑選PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的菌落繼續(xù)進(jìn)行無(wú)菌恒溫培養(yǎng)，通過質(zhì)粒提取成功獲得pGAL::BnaLPAT4-1和pGAL::BnaLPAT4-2陽(yáng)性質(zhì)粒。

表1 PCR引物Table 1 PCR primers

1.2.3 轉(zhuǎn)化酵母菌INVSC1 通過醋酸鋰法(PEG/LiAC)將已構(gòu)建成功的pGAL::BnaLPAT4-1和pGAL::BnLPAT4-2表達(dá)載體及不含目的基因的YES2.0表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入工程菌株INVSC1內(nèi)，接種于SD-Ura培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，獲得含有目的基因YES2.0載體及空白YES2.0載體的工程菌株。

1.2.4 PBI121表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)BnaLPAT4基因的CDS序列設(shè)計(jì)引物(表1)，在2個(gè)基因上游引物5′處添加BamHI(GGATCC)和保護(hù)堿基(CGC)，下游引物5′處添加SacI(GAGTC)保護(hù)堿基(C)。成功克隆BnLPAT4-1和BnLPAT4-2基因后，通過內(nèi)切酶SacI和BamHI對(duì)目的產(chǎn)物和pBI121質(zhì)粒進(jìn)行酶切。經(jīng)T4酶連接后成功構(gòu)建表達(dá)載體BnaLPAT4-1::pNapin和BnaLPAT4-2::pNapin，并將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5a)內(nèi)。轉(zhuǎn)化方法：解凍感受態(tài)后，加入上述連接產(chǎn)物，冰上放置40 min；水浴鍋內(nèi)42℃處理90 s；冰盒內(nèi)放置5 min；分別加入無(wú)抗大腸桿菌(Luria-Bertani, LB)液體培養(yǎng)基800 mL，搖床內(nèi)37℃復(fù)蘇1 h；取上述200 μL菌液均勻涂抹至50 mg·L-1Kan抗生素LB固體平板上；37℃條件下倒置過夜培養(yǎng)，挑取數(shù)個(gè)單菌落分別進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，提取質(zhì)粒，酶切鑒定。

1.2.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染擬南芥 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法參考文獻(xiàn)[9]，具體步驟略有改變。制備農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)：將1.2.4提取的陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性菌進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)。接種農(nóng)桿菌菌種于農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogene Broth Medium, YEB)固體培養(yǎng)基[25 mg·L-1鏈霉素(streptomycin, str)+25 mg·L-1利福平(rifampin, rif)+50 mg·L-1卡那霉素(kanamycin, Kan)]，28℃恒溫條件下放置48 h，然后在超凈工作臺(tái)上將準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌接種于10 mL含有相應(yīng)抗性的YEB液體培養(yǎng)基中，置于搖床上震蕩培養(yǎng)24 h；接種上述混合物于75 mL含對(duì)應(yīng)抗生素YEB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD值=1.5，離心收集菌體。浸染液為100 mL體系：蔗糖5 g，Silwett-77 30 μL，蒸餾水定容。野生型擬南芥種子置于4℃條件下低溫春化處理3 d，然后置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)。培養(yǎng)箱參數(shù)設(shè)置為：溫度24℃，光暗比16∶8，相對(duì)濕度75%，擬南芥生長(zhǎng)達(dá)到盛花期時(shí)開始花絮浸染。室溫條件下將擬南芥花序完全浸泡于浸染液中40 s，然后將已浸染的擬南芥套上黑色塑料袋遮光培養(yǎng)1 d，最后放置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)使其正常生長(zhǎng)，期間每隔3 d重新浸染1次，每次侵染40 s，共浸染3次(浸染液現(xiàn)配現(xiàn)用)。完成浸染后置于光照培養(yǎng)箱繼續(xù)生長(zhǎng)至收獲擬南芥T0代轉(zhuǎn)基因種子。將收獲的轉(zhuǎn)基因種子用75%酒精處理3 min后置于3%次氯酸鈉溶液內(nèi)消毒15 min，無(wú)菌水反復(fù)清洗4次，均勻鋪種擬南芥種子于含有Kan抗性的1/2MS固體培養(yǎng)基中，待種子發(fā)芽后移栽至栽培基質(zhì)中，并將其放置在光照培養(yǎng)箱內(nèi)生長(zhǎng)，光照培養(yǎng)箱參數(shù)設(shè)置同上。待擬南芥轉(zhuǎn)基因植株開花后嚴(yán)格自交授粉，并收獲完全成熟的T1代種子。繼續(xù)按照上述方法培養(yǎng)至收獲轉(zhuǎn)基因T3代種子。

1.2.6 檢測(cè)酵母轉(zhuǎn)化子和轉(zhuǎn)擬南芥種子脂肪酸成分 超低溫冰箱內(nèi)取出酵母轉(zhuǎn)化子，置于冰上融解為液體狀后均勻涂抹在SD-Ura培養(yǎng)基上，恒溫箱內(nèi)30℃培養(yǎng)64 h后，將挑選的單菌落懸浮于YPDA培養(yǎng)基中，搖床200 r·min-1培養(yǎng)50 h左右，移至烘箱內(nèi)烘干水分，徹底研磨至粉末狀。0.05 g上述粉末高溫滅菌后的5 mL離心管內(nèi)，緩慢加入5%硫酸甲醇3 mL后混勻，將混合液置于85℃水浴鍋內(nèi)90 min，冷卻至室溫后離心至混合物分層，小心吸取適量上清液于另一干凈的離心管內(nèi)，用移液槍吸取NaCl、正己烷各2 mL至離心管內(nèi)，8 000 r·min-1離心5 min，復(fù)制上一步驟吸取上清液至干凈離心管內(nèi)；等量吸取上述上清液和乙醚-石油醚各200 μL后待用。參照氣相色譜儀(Aglient7890,美國(guó)安捷倫科技有限公司)使用說明測(cè)定酵母轉(zhuǎn)化子脂肪酸成分，操作方法：調(diào)節(jié)起始溫度100℃并保持12 min，15℃·min-1升溫至210℃并保持7 min，1 min內(nèi)升溫至230℃，分流比100∶1，進(jìn)口量1.0 μL。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，擬南芥種子脂肪酸測(cè)定同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及脂肪酸成分分析

2.1.1 YES 2.0表達(dá)載體的構(gòu)建BnLPAT4-1和BnLPAT4-2經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行膠回收，EcoRI與SacI雙酶切回收的目的基因片段和YES2.0穿梭表達(dá)質(zhì)粒的鑒定結(jié)果如圖1所示，得到2條大小約為1 200 bp的條帶。酶切片段及載體經(jīng)T4連接酶連接得到重組質(zhì)粒如圖2所示。

2.1.2 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母 隨機(jī)挑選6個(gè)菌落(BnLPAT4-1和BnLPAT4-2各3個(gè))進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)鑒定均為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性菌落，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后提取其陽(yáng)性菌質(zhì)粒。采用LiAc高效酵母轉(zhuǎn)化法，將提取的陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母菌INVSC 1中，通過菌落PCR鑒定發(fā)現(xiàn)，PCR產(chǎn)物約為1 200 bp，說明質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入酵母菌中，檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。

注：M：Trans 2 000 bp DNA marker；1～2：產(chǎn)物。Note: M: Trans 2 000 bp DNA marker. 1～2: Samples.圖1 酶切BnaLPAT4基因PCR鑒定圖Fig.1 PCR identification of BnaLPAT4 gene by enzyme digestion

注：A：pGAL::BnaLPAT4-1載體； B：pGAL::BnaLPAT4-2載體。Note: A: pGAL::BnzLPAT4-1 carrier. B: pGAL::BnaLPAT4-2 carrier.圖2 pGAL::BnaLPAT4-1和pGAL::BnaLPAT4-2酵母表達(dá)載體Fig. 2 pGAL::BnaLPAT4-1 and pGAL::BnaLPAT4-2 of yeast expression vector

注：M： Trans 2 000 bp DNA marker；1:質(zhì)粒; 2:陰性對(duì)照; 3～5: BnLPAT4-1 的單菌落；6～8: BnLPAT4-2的單菌落。Note: M: Trans 2 000 bp DNA marker. 1: Plasmid. 2: Negative control. 3～5: BnLPAT4-1 colonies. 6～8: BnLPAT4-2 colonies.圖3 酵母菌落PCR鑒定Fig.3 Yeast colony PCR identification

2.1.3 酵母脂肪酸組成分析 PEG/LiAc法轉(zhuǎn)化酵母菌INVSC 1的氣相色譜分析結(jié)果如表2所示，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)BnaLPAT4-1和BnaLPAT4-2基因酵母轉(zhuǎn)化子與空酵母轉(zhuǎn)化子YES 2.0脂肪酸組分之間發(fā)生明顯變化，轉(zhuǎn)化子間脂肪酸種類和比例出現(xiàn)差異。其中BnaLPAT4-1轉(zhuǎn)化子脂肪酸種類較對(duì)照YES 2.0轉(zhuǎn)化子特異性生成了亞麻酸(C18：3)和花生酸(C20：0)2種成分，硬脂酸(C18:0)和軟脂酸(C16:0)含量較空轉(zhuǎn)化子分別提高25.72和5.39個(gè)百分點(diǎn)，棕櫚酸(C16:1)、油酸(C18:1)和亞油酸(C18:2)含量分別下降了14.71、21.35和15.24個(gè)百分點(diǎn)；BnaLPAT4-2轉(zhuǎn)化子脂肪酸較對(duì)照C16碳鏈脂肪酸含量特異性增加，其中軟脂酸和棕櫚酸含量分別提升了18.67和7.82個(gè)百分點(diǎn)，而硬脂酸、油酸和亞油酸含量有不同程度的下降，并且較對(duì)照未生成其他種類脂肪酸。

表2 酵母轉(zhuǎn)化子脂肪酸檢測(cè)Table 2 Detection of fatty acids in yeast converters

BnaLPAT4-1轉(zhuǎn)化子中飽和脂肪酸(軟脂酸和硬脂酸)含量達(dá)到Y(jié)ES 2.0轉(zhuǎn)化子飽和脂肪酸含量的2.60倍，不飽和脂肪酸(棕櫚酸、油酸、亞油酸、亞麻酸和花生酸)僅為YES 2.0轉(zhuǎn)化子的0.58倍。BnaLPAT4-2轉(zhuǎn)化子中飽和脂肪酸含量達(dá)到Y(jié)ES 2.0轉(zhuǎn)化子的1.61倍，不飽和脂肪酸為YES 2.0轉(zhuǎn)化子的0.79倍。

2.2 BnaLPAT4種子特異性表達(dá)載體的構(gòu)建及脂肪酸成分分析

2.2.1 表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定BamHI與SacI雙酶切目的基因BnaLPAT4-1和BnaLPAT4-2，分別連接表達(dá)載體pBI121后PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果顯示，試驗(yàn)成功擴(kuò)增出2條796 bp的BnaLPAT4基因條帶(圖4)，證明成功將克隆的2條BnaLPAT4基因連接至載體pBI121上獲得重組質(zhì)粒pNapin::BnaLPAT4-1和pNapin::BnaLPAT4-2。將上述重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)菌落PCR檢測(cè)，取3個(gè)陽(yáng)性菌落搖菌，并提取質(zhì)粒，可用于后續(xù)試驗(yàn)。重組質(zhì)粒如圖5所示。

注：M：Trans 2 000 bp DNA marker；1～3:產(chǎn)物。Note: M: Trans 2 000 bp DNA marker. 1～3: Samples.圖4 酶切BnaLPAT4基因PCR鑒定圖Fig. 4 PCR identification of BnaLPAT4 gene by enzyme digestion

注：A：pNapin::BnaLPAT4-1載體；B:pNapin::BnaLPAT4-2載體。Note: A: pNapin:: BnaLPAT4-1 carrier. B: pNapin::BnaLPAT4-2 carrier.圖5 pNapin::BnaLPAT4-1和pNapin:::BnaLPAT4-2載體構(gòu)建Fig.5 Construction of pNapin::BnaLPAT4-1 and pNapin::BnalPAT4-2 vectors

2.2.2 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性株鑒定 農(nóng)桿菌從超低溫冰箱取出后，將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過PCR檢測(cè)表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌如圖6所示。將帶有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌擴(kuò)大培養(yǎng)后配置浸染液，采用花絮浸染轉(zhuǎn)化法，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入擬南芥中。

2.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化擬南芥分析 農(nóng)桿菌重組質(zhì)粒BnaLPAT4-1和BnaLPAT4-2轉(zhuǎn)化野生型擬南芥(哥倫比亞型)后PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株結(jié)果如圖7所示。檢測(cè)結(jié)果表明，重組質(zhì)粒BnaLPAT4-1和BnaLPAT4-2成功轉(zhuǎn)化擬南芥中，并獲得Napin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)BnaLPAT4-1和BnaLPAT4-2基因的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性擬南芥株。

注：M：Trans 2 000 bp DNA marker；1：陽(yáng)性質(zhì)粒；2：陰性對(duì)照；3～5：BnaLPAT4-1農(nóng)桿菌菌落；6～8：BnaLPAT4-2農(nóng)桿菌菌落。Note: M: Trans 2 000 bp DNA marker. 1: Positive plasmid. 2: Negative control. 3～5: Agrobacterium BnaLPAT4-1 colony. 6～8: Agrobacterium colony BnaLPAT4-2.圖6 農(nóng)桿菌重組質(zhì)粒PCR檢測(cè)Fig.6 PCR detection of agrobacterium tumefaciens recombinant plasmid

注：M：Trans 2 000 bp DNA marker；1：陽(yáng)性質(zhì)粒；2:陰性對(duì)照；3～5：轉(zhuǎn)BnaLPAT4-1擬南芥；6～8：轉(zhuǎn)BnaLPAT4-2擬南芥。Note: M: Trans 2 000 bp DNA marker. 1: Positive plasmid. 2: Negative control. 3～5: Transplanting BnaLPAT4-1 Arabidopsis. 6～8: Transfer BnaLPAT4-2 Arabidopsis.圖7 轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR檢測(cè)Fig.7 PCR detection of transgenic Arabidopsis thaliana

2.2.4 擬南芥種子脂肪酸組成分析 轉(zhuǎn)pNapin::BnaLPAT4基因擬南芥RT-PCR結(jié)果如圖8所示。轉(zhuǎn)BnaLPAT4-1和BnaLPAT4-2基因擬南芥株系擴(kuò)增產(chǎn)物條帶亮度明顯高于野生型對(duì)照，證明轉(zhuǎn)基因擬南芥中BnaLPAT4-1和BnaLPAT4-2基因都高于野生型擬南芥，Actin條帶亮度一致。表達(dá)量較野生型擬南芥有明顯提升。氣相色譜法檢測(cè)擬南芥轉(zhuǎn)基因BnaLPAT4-1 T3代株系種子脂肪酸組分并較對(duì)照材料脂肪酸組分進(jìn)行比對(duì)分析，得到Napin::BnLPAT4-1 T3代種子脂肪酸組分如表3所示。由于擬南芥轉(zhuǎn)基因BnLPAT4-2株系未收獲正常發(fā)芽種子，無(wú)法進(jìn)行脂肪酸檢測(cè)試驗(yàn)。

由表3可知，轉(zhuǎn)BnaLPAT4-1擬南芥的3個(gè)株系的種子較野生型對(duì)照的脂肪酸組分之間存在明顯差異。其中轉(zhuǎn)BnaLPAT4-1擬南芥株系1、2和3種子中的花生烯酸含量較野生型分別提高了3.57、4.48和3.60個(gè)百分點(diǎn)，平均提高3.88個(gè)百分點(diǎn)，而轉(zhuǎn)基因株中花生酸和二十碳二烯酸較野生型對(duì)照的含量明顯降低，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株花生酸的含量分別降低0.84、0.52和0.78個(gè)百分點(diǎn)，平均降低7.20個(gè)百分點(diǎn)，二十碳二烯酸含量分別降低0.68、0.96和0.74個(gè)百分點(diǎn)，平均降低0.79個(gè)百分點(diǎn)。轉(zhuǎn)基因株種子脂肪酸較野生型對(duì)照中的硬脂酸、油酸、亞油酸以及亞麻酸組分的含量與野生型對(duì)照無(wú)明顯差異，但轉(zhuǎn)基因株種子脂肪酸中無(wú)花生三烯酸和芥酸的產(chǎn)生，由此可得出BnaLPAT4-1基因具有抑制花生三烯酸和芥酸生成且催化花生烯酸生成的功能。

M：Trans 2 000 bp DNA marker；1～2：擬南芥野生型；3～5：轉(zhuǎn)BnaLPAT4-1擬南芥植株；6～7：轉(zhuǎn)BnaLPAT4-2擬南芥植株。M: Trans 2 000 bp DNA marker. 1～2 : Arabidopsis wild-type. 3～5: Transforming Arabidopsis thaliana plants with BNLPA 4-1. 6-7: Transforming Arabidopsis thaliana plants with BNLPA 4-2.圖8 擬南芥轉(zhuǎn)基因BnaLPAT4株系RT-PCR檢測(cè)Fig.8 RT-PCR detection of Transgenic BnaLPAT4 strain in Arabidopsis thaliana

表3 擬南芥種子脂肪酸組分Table 3 Arabidopsis thaliana seeds fatty acid component

3 討論

油菜是我國(guó)重要的油料作物之一，對(duì)我國(guó)油料安全生產(chǎn)有重大意義[17-20]。研究油菜油脂形成機(jī)制和發(fā)掘調(diào)控油脂合成的相關(guān)基因，對(duì)提高油菜種子含油量和提升油脂品質(zhì)具有重要的指導(dǎo)作用[21-23]。研究發(fā)現(xiàn)LPAT基因具有調(diào)控植物油脂合成的生物學(xué)功能[24-26]。本試驗(yàn)通過克隆甘藍(lán)型油菜湘油15號(hào)BnaLPAT4基因，構(gòu)建表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母和擬南芥，并采用氣相色譜法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株脂肪酸組分明顯發(fā)生變化，證明BnaLPAT4基因具有調(diào)控油脂合成的生物學(xué)功能。同時(shí)本研究檢測(cè)到BnaLPAT4-1與BnaLPAT4-2轉(zhuǎn)化子間的脂肪酸組分存在差異，BnaLPAT4-1轉(zhuǎn)化子生成亞麻酸和花生酸，而BnaLPAT4-2轉(zhuǎn)化子脂肪酸組分中軟脂酸和棕櫚油酸比例明顯提高，證明BnaLPAT4基因拷貝間在油脂合成的表達(dá)模式中存在差異，確定BnaLPAT4基因具有調(diào)控植物脂肪酸鏈合成，從而影響植物含油量的功能，這與尹永泰[14]、柏楊等[18]、肖旦望等[27]、丁檢等[28]和陳四龍[29]的研究結(jié)果相似。

LPAT酶具有調(diào)控脂肪酸鏈裝配在TAG的sn-2位上的功能，對(duì)不飽和脂肪酸具有特異選擇性，胡蓉等[30]通過構(gòu)建BnaLPAT2過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥種子亞油酸和亞麻酸等不飽和脂肪酸有明顯提升，但油酸含量明顯下降。Zhang等[31]通過設(shè)計(jì)多個(gè)sgRNA位點(diǎn)并構(gòu)建CRISPR/Cas9編輯載體對(duì)油菜BnaLPAT2和BnaLPAT5基因多同源拷貝進(jìn)行定向編輯，發(fā)現(xiàn)編輯油菜種子中含油量較野生型明顯下降，并且種子性狀、大小和千粒重受到明顯的影響。以上試驗(yàn)驗(yàn)證了LPATs基因家族具有調(diào)控油菜油脂合成的生物學(xué)功能。本試驗(yàn)構(gòu)建了BnaLPAT4-1和BnaLPAT4-2基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母，并通過氣相色譜法檢測(cè)到酵母轉(zhuǎn)化子飽和脂肪酸(軟脂酸和硬脂酸)的含量明顯提高。氣相色譜檢測(cè)轉(zhuǎn)BnaLPAT4-1基因植株發(fā)現(xiàn)花生烯酸含量明顯提高，兩種轉(zhuǎn)基因材料脂肪酸變化結(jié)果不一致。本試驗(yàn)僅在酵母和擬南芥中對(duì)BnaLPAT4-1和BnaLPAT4-2基因功能進(jìn)行了驗(yàn)證，還需要轉(zhuǎn)化油菜后驗(yàn)證BnaLPAT4基因功能。

4 結(jié)論

本研究從甘藍(lán)型油菜湘油15號(hào)中克隆獲得兩條BnaLPAT4基因，長(zhǎng)度分別為1 143、1 140 bp，分別命名為BnaLPAT4-1、BnaLPAT4-2。構(gòu)建重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化酵母和擬南芥，并通過氣相色譜法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因材料脂肪酸組分發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株脂肪酸組分較野生型對(duì)照有明顯變化，從而驗(yàn)證了BnaLPAT4基因具有調(diào)控植物脂肪酸鏈合成，從而影響植物含油量的生物學(xué)功能。