麥麗開(kāi)·阿不力米提, 艾山·艾比布勒, 史 深, 阿不都沙拉木·阿不都熱依木, 艾尼瓦爾·塔力甫

(1. 新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心, 烏魯木齊 830002; 2. 新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院老年病科, 烏魯木齊 830000; 3. 新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)院,烏魯木齊 830000)

維吾爾醫(yī)藥是中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥的重要組成部分，也是我國(guó)四大民族醫(yī)藥之一［1］，在臨床上廣泛用于炎癥疾病的治療［2］。研究表明，維吾爾醫(yī)學(xué)常用藥材之一的毛菊苣提取物對(duì)小鼠肝纖維化具有一定的保護(hù)作用［3］。在維吾爾語(yǔ)中毛菊苣又名卡森新疆地區(qū)維吾爾醫(yī)學(xué)應(yīng)用中主要取卡森地上部分和根入藥，味微苦、咸，性涼，清肝利膽，用于治療濕熱黃疸、胃痛食少及水腫尿少［4-6］。

復(fù)方卡森糖漿由茴香根皮、菊苣根、玫瑰花、黃瓜子、小茴香、菊苣子、葫蘆子仁7 味藥材組成，具有通滯利肝、利尿消腫等功能，用于膽液質(zhì)過(guò)盛而引起的各種疾病。目前，臨床上該藥主要用于肝炎、肝硬化、膽囊炎、帶狀皰疹、蕁麻疹、關(guān)節(jié)炎等疾病的治療［7］。雖然相關(guān)臨床資料已經(jīng)表明“復(fù)方卡森糖漿”具有治療肝病的效果［8-9］，但進(jìn)一步研究該制劑的保肝作用機(jī)制可為復(fù)方卡森糖漿的臨床應(yīng)用提供更多理論基礎(chǔ)，并為新藥開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

本研究以復(fù)方卡森糖漿的保肝作用為切入點(diǎn)，建立D-氨基半乳糖致小鼠急性化學(xué)性肝損傷模型，探討復(fù)方卡森糖漿對(duì)小鼠血清生化肝功能指標(biāo)及免疫學(xué)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性ICR小鼠，體質(zhì)量為18～22 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［SCXK（滬）2017-0005］提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)為20170005007808，飼養(yǎng)于新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障設(shè)施［SYXK（新）2016-0001］。動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前一周進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)，相對(duì)濕度為40%～60%，溫度為20～24 ℃，12 h 光照交替，自由飲用凈化水，攝食小鼠標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料（江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司提供的SPF級(jí)大鼠小鼠維持飼料）。本研究中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（2020-002），所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R原則及國(guó)內(nèi)外相關(guān)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理標(biāo)準(zhǔn)要求。

1.2 主要藥品與試劑

復(fù)方卡森糖漿和炎消迪娜兒糖漿參考標(biāo)準(zhǔn)物均由新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院制藥廠生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)分別為新藥文號(hào)M20041581、國(guó)藥準(zhǔn)字Z65020183，規(guī)格均為200 mL/瓶。D-氨基半乳糖購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）檢測(cè)用ELISA 試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)用ELISA 試劑盒均購(gòu)自武漢酶免生物科技有限公司。血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。HE染色液購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器

AccuteTBA-40FR東芝全自動(dòng)生化分析儀為日本東芝公司產(chǎn)品；BS323S 電子天平為德國(guó)Sartorius 公司產(chǎn)品；SCIENTZ-48高通量組織研磨器購(gòu)自寧波新芝生物科技股份有限公司；721型分光光度計(jì)購(gòu)自上海第三分析儀器廠。

1.4 動(dòng)物分組、模型建立及藥物處理

按小鼠體質(zhì)量隨機(jī)分組，分別為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、炎消迪娜兒糖漿陽(yáng)性對(duì)照組及復(fù)方卡森糖漿低、中、高劑量組，共6組，每組8只。復(fù)方卡森糖漿低、中、高劑量組分別按原藥液的50%、100%、200%（即用恒溫水浴鍋加熱原藥液使之蒸發(fā)水分50%，藥物濃度增加至原來(lái)的一倍）配制藥物，按8 mL·kg-1·d-1灌胃，連續(xù)7 d［5］。為了證明復(fù)方卡森糖漿（新藥）的有效性，將炎消迪娜兒糖漿（國(guó)藥）作為陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品。陽(yáng)性對(duì)照組按12 mL·kg-1·d-1給予炎消迪娜兒糖漿灌胃，連續(xù)7 d。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予同體積的生理鹽水。

末次給藥1 h后，除正常對(duì)照組外，其他各組小鼠均腹腔注射給予D-氨基半乳糖800 mg/kg，建立急性化學(xué)性肝損傷模型。然后觀察各組小鼠的肝損傷病理變化及血清生化水平。

1.5 用藥后小鼠血清生化及免疫學(xué)指標(biāo)測(cè)定

肝損傷模型建立24 h 后，腹腔注射戊巴比妥鈉（150 mg/kg）麻醉小鼠。眼球取血［10-11］，常規(guī)分離血清并使用試劑盒測(cè)定ALT、AST、ALP活性，以此反映肝功能。另外取肝臟組織塊（0.1～0.2 g），放入勻漿管中，冰水浴條件下用機(jī)械式勻漿機(jī)8 000～10 000 r/min勻漿，10 s/次，間隙30 s，連續(xù)3～5次。將制備好的10%勻漿液用普通離心機(jī)（2 500 r/min）離心10～15 min，取上清液，采用ELISA法測(cè)定SOD、GSH-Px、MDA含量，以反映肝細(xì)胞損傷程度。

1.6 用藥后小鼠肝臟組織病理學(xué)觀察

動(dòng)物分組前、解剖前各測(cè)量一次體質(zhì)量，解剖后測(cè)量肝臟和脾臟質(zhì)量，并計(jì)算肝脾指數(shù)（小鼠肝臟或脾臟質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量×100%）。解剖后各組小鼠的肝臟組織經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的中性甲醛溶液固定，常規(guī)制片。HE染色法觀察各組小鼠肝組織病理學(xué)變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22軟件對(duì)各實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)用±s表示。多組樣本均數(shù)比較，首先采用單因素方差分析，再采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝脾指數(shù)測(cè)定

與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠的肝臟指數(shù)及脾臟指數(shù)均有升高，其中肝臟指數(shù)升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組相比，復(fù)方卡森糖漿低、中劑量組小鼠的脾臟指數(shù)（0.26±0.05）、炎消迪娜兒糖漿陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的肝臟指數(shù)（4.42±0.75）均顯著下降（P＜0.05），詳見(jiàn)表1。

表1 復(fù)方卡森糖漿對(duì)D-氨基半乳糖所致小鼠肝、脾指數(shù)的影響Table 1 Effect of compound Casson syrup（CCS）on liver and spleen indexes of mice induced by D-galactose（±s,n=8）

表1 復(fù)方卡森糖漿對(duì)D-氨基半乳糖所致小鼠肝、脾指數(shù)的影響Table 1 Effect of compound Casson syrup（CCS）on liver and spleen indexes of mice induced by D-galactose（±s,n=8）

注：炎消迪娜兒糖漿用作復(fù)方卡森糖漿的陽(yáng)性對(duì)照藥物。與對(duì)照組比較，★P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。Note：Yanxiaodinar syrup（YS）was used as the positive control of compound Casson syrup（CCS）. Compared with control group，★P＜0.05；compared with model group，#P＜0.05.

組別Group正常對(duì)照Normal control模型對(duì)照Model control炎消迪娜兒糖漿對(duì)照YS control低劑量復(fù)方卡森糖漿Low-dose of CCS中劑量復(fù)方卡森糖漿Medium-dose of CCS高劑量復(fù)方卡森糖漿High-dose of CCS劑量Dose/(mL·kg-1·d-1)- - 1 2 4 8 16實(shí)驗(yàn)前體質(zhì)量Pre-test body mass/g 24.00±1.07 25.00±2.39 20.13±3.31 27.50±0.76 22.88±3.36 26.13±0.99解剖前體質(zhì)量Preanatomic body mass/g 29.19±1.70 28.85±4.88 27.16±2.98 30.99±1.36 28.91±1.75 28.66±1.81肝臟指數(shù)Liver index/(mg·g-1)4.95±0.61 5.93±0.84★4.42±0.75#4.50±0.38 5.35±0.83 4.64±0.29脾臟指數(shù)Spleen index/(mg·g-1)0.30±0.07 0.36±0.01 0.32±0.05 0.26±0.05#0.28±0.06#0.32±0.06

2.2 肝功能評(píng)估

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠的血清ALT、AST 和ALP 水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，復(fù)方卡森糖漿和炎消迪娜兒糖漿各給藥組小鼠的血清AST、ALT 水平均有所下降；而各給藥組之間雖有波動(dòng)，但無(wú)顯著性差異。與模型組比較，各給藥組的血清ALP水平顯著下降（P＜0.05），詳見(jiàn)表2。結(jié)果提示D-氨基半乳糖可致小鼠肝功能下降，而復(fù)方卡森糖漿對(duì)肝功能具有一定的保護(hù)作用。

表2 復(fù)方卡森糖漿對(duì)D-氨基半乳糖所致化學(xué)性肝損傷小鼠血清ALT、AST、ALP的影響Table 2 Effects of compound Casson syrup on serum ALT,AST and ALP of mice with chemical liver injury caused by Dgalactose（±s,n=8）

表2 復(fù)方卡森糖漿對(duì)D-氨基半乳糖所致化學(xué)性肝損傷小鼠血清ALT、AST、ALP的影響Table 2 Effects of compound Casson syrup on serum ALT,AST and ALP of mice with chemical liver injury caused by Dgalactose（±s,n=8）

注：炎消迪娜兒糖漿用作復(fù)方卡森糖漿的陽(yáng)性對(duì)照藥物。ALT為谷丙轉(zhuǎn)氨酶，AST為谷草轉(zhuǎn)氨酶，ALP為堿性磷酸酶。與對(duì)照組比較，★P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。Note：Yanxiaodinar syrup（YS）was used as the positive control of compound Casson syrup（CCS）.ALT is alanine aminotransferase；AST is aspartate aminotransferase；ALP is alkaline phosphatase.compared with control group，★P＜0.05；compared with model group，#P＜0.05.

組別Group正常對(duì)照Normal control模型對(duì)照Model control炎消迪娜兒糖漿對(duì)照YS control低劑量復(fù)方卡森糖漿Low-dose of CCS中劑量復(fù)方卡森糖漿Medium-dose of CCS高劑量復(fù)方卡森糖漿High-dose of CCS劑量Dose/(mL·kg-1·d-1)- - 1 2 4 8 16 ALT z/(U·L-1)34.63±1.41 101.13±51.3★53.60±10.43 59.63±37.74 45.25±17.80 38.80±4.76 AST z/(U·L-1)144.50±27.30 241.25±41.04★216.20±50.45 182.63±56.29 159.13±31.84 145.80±13.03 AST/ALT 4.18±0.84#2.39±1.69 4.19±1.47 3.44±0.99 3.79±0.95 3.83±0.75 ALP z/(U·L-1)171.50±20.10#217.50±81.39★157.80±17.30#169.13±28.98#173.38±27.64#149.60±24.81#

2.3 抗氧化狀態(tài)評(píng)估

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠肝臟組織勻漿中MDA 和GSH-Px 含量增高（P＜0.05），SOD 含量明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，復(fù)方卡森糖漿各劑量組小鼠肝臟SOD 含量增高（P＜0.05），其中高劑量組增高明顯（P＜0.01）；而MDA 和GSH-Px 含量出現(xiàn)不同程度的降低，有些劑量組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見(jiàn)表3。結(jié)果提示復(fù)方卡森糖漿對(duì)D-氨基半乳糖導(dǎo)致的肝細(xì)胞損傷具有一定的拮抗作用。

表3 復(fù)方卡森糖漿對(duì)D-氨基半乳糖所致化學(xué)性肝損傷小鼠肝組織MDA、GSH、SOD的影響Table 3 Effects of compound Casson syrup on MDA,GSH,SOD in liver tissues of mice with chemical liver injury caused by D-galactose（±s,n=8）

表3 復(fù)方卡森糖漿對(duì)D-氨基半乳糖所致化學(xué)性肝損傷小鼠肝組織MDA、GSH、SOD的影響Table 3 Effects of compound Casson syrup on MDA,GSH,SOD in liver tissues of mice with chemical liver injury caused by D-galactose（±s,n=8）

注：炎消迪娜兒糖漿用作復(fù)方卡森糖漿的陽(yáng)性對(duì)照藥物。MDA為丙二醛，GSH-Px為谷胱甘肽過(guò)氧化物酶，SOD為超氧化物歧化酶；與對(duì)照組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01。與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。Note：Yanxiaodinar syrup（YS）was used as the positive control of compound Casson syrup（CCS）.MDA is malondialdehyde；SOD is superoxide dismutase；GSH-Px is glutathione peroxidase；compared with the control group，★P＜0.05，★★P＜0.01；compared with model group，#P＜0.05，##P＜0.01.

組別Group正常對(duì)照組Normal control模型對(duì)照Model control炎消迪娜兒糖漿對(duì)照YS control低劑量復(fù)方卡森糖漿Low-dose of CCS中劑量復(fù)方卡森糖漿Medium-dose of CCS高劑量復(fù)方卡森糖漿High-dose of CCS劑量Dose/(mL·kg-1·d-1)- - 1 2 4 8 16 MDA ρ/(μmoL·mg-1)0.79±0.10 0.82±0.14★0.74±0.09#0.56±0.18#0.67±0.12#1.09±0.09 GSH-Px ρ/(nmoL·mg-1)25.60±7.79 32.13±9.24★27.27±9.03 30.34±6.51 26.33±10.05 19.82±16.44#SOD z/(U·mg-1)12.23±3.21b 4.37±3.94★★5.78±1.56#7.30±1.53#5.89±1.64#20.16±5.17##

2.4 組織病理學(xué)評(píng)估

對(duì)照組小鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝細(xì)胞無(wú)異常（圖1A）。模型組小鼠的肝索結(jié)構(gòu)紊亂，有明顯的肝細(xì)胞灶性壞死，周?chē)醒仔约?xì)胞浸潤(rùn)，表明存在急性肝組織損傷（圖1B）。陽(yáng)性組小鼠的局部肝細(xì)胞輕度腫大，肝小葉結(jié)構(gòu)無(wú)明顯異常，提示肝組織損傷得到明顯改善（圖1C）。與模型組比較，復(fù)方卡森糖漿低、中、高劑量組小鼠的肝組織病理?yè)p傷得到明顯改善（圖1D、E、F），表現(xiàn)為肝小葉結(jié)構(gòu)較完整，無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖1 復(fù)方卡森糖漿對(duì)D-氨基半乳糖所致化學(xué)性肝損傷小鼠肝組織病理學(xué)影響（HE染色，×200）Figure 1 Effect of compound Casson syrup on liver tissue caseology of D-galactose induced chemical liver injury mice（HE staining，×200）

3 討論

近年來(lái)，由于不良生活習(xí)慣和現(xiàn)代社會(huì)生活和工作環(huán)境，如高壓力、久坐、熬夜加班、長(zhǎng)期酗酒、攝入高熱量食品及慢性病藥物的長(zhǎng)期使用等因素，藥物性肝病、酒精性肝病的發(fā)病率明顯上升。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年我國(guó)酒精性脂肪性肝病患者約2 463.5萬(wàn)人，其中40多歲年齡段的人群的酒精性肝病發(fā)病率最高，為10%以上［12］；另外，約有25%的人存在非酒精性肝脂肪［13］?；瘜W(xué)性有害物質(zhì)通過(guò)胃腸道和血液循環(huán)進(jìn)入肝臟進(jìn)行代謝，因此肝臟容易受到這些毒性物質(zhì)的損害，造成化學(xué)性肝損傷。肝損傷動(dòng)物模型類(lèi)似于人類(lèi)肝炎發(fā)生的病理生理過(guò)程，是篩選保肝藥物較為理想的研究模型之一。因此，應(yīng)加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)與臨床應(yīng)用的結(jié)合，注重整體觀念與辨證論治，從而充分體現(xiàn)傳統(tǒng)醫(yī)藥治療化學(xué)性肝損傷的優(yōu)勢(shì)及廣闊前景［14］。

本研究通過(guò)D-氨基半乳糖誘導(dǎo)建立了ICR 小鼠急性化學(xué)性肝損傷模型，模型組小鼠的肝、脾臟指數(shù)均顯著升高，說(shuō)明肝臟和脾臟均受到化學(xué)物質(zhì)的影響。其中，炎消迪娜兒糖漿陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的脾臟指數(shù)偏低應(yīng)不是毒性反應(yīng)，而是與當(dāng)時(shí)動(dòng)物體質(zhì)量偏小相關(guān)。肝功能指標(biāo)檢測(cè)數(shù)據(jù)表明，復(fù)方卡森糖漿各劑量組具有保肝作用。本研究表明，復(fù)方卡森糖漿給藥組小鼠血清中ALT 和AST 水平均明顯低于肝損傷模型組，說(shuō)明中藥在降低ALT、AST 以及保護(hù)肝細(xì)胞方面起到了一定的作用；該結(jié)果與以往文獻(xiàn)結(jié)論［15-16］相一致。進(jìn)一步評(píng)估各組小鼠的抗氧化狀態(tài)，結(jié)果顯示模型組小鼠肝組織勻漿中MDA、GSH-Px 值升高，SOD 含量明顯降低，并且HE染色后觀察發(fā)現(xiàn)模型組小鼠的肝組織發(fā)生了病理學(xué)改變，說(shuō)明化學(xué)性肝損傷模型建立成功。

復(fù)方卡森糖漿對(duì)肝損傷的修復(fù)作用，是因?yàn)閺?fù)方卡森糖漿通過(guò)影響肝臟代謝機(jī)能，增強(qiáng)抗氧化作用，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，保護(hù)受損肝細(xì)胞。復(fù)方卡森糖漿和炎消迪娜兒糖漿都是臨床上用于炎癥疾病治療的主要中藥制劑。本研究中同時(shí)使用炎消迪娜兒糖漿作為陽(yáng)性對(duì)照，可以證明動(dòng)物實(shí)驗(yàn)具有檢驗(yàn)靈敏性，即能夠證明陽(yáng)性藥物的有效性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方卡森糖漿可以有效緩解D-氨基半乳糖引起的小鼠急性化學(xué)性肝損傷。本實(shí)驗(yàn)以復(fù)方卡森糖漿的保肝作用為切入點(diǎn)，研究該制劑的保肝作用可為復(fù)方卡森糖漿的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，并為新藥開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

[醫(yī)學(xué)倫理聲明Medical Ethics Statement]

本研究涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已通過(guò)新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（No.2020-002）。所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程均遵照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)法律法規(guī)條例要求進(jìn)行。

All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by Experimental Animal Welfare and Ethics Committee of Xinjiang Center for Disease Control and Prevention(Approval Letter No.2020-002),and all experi-mental protocols were carried out following the guidelines such asAnimal Management Regulations(01/03/2017),Laboratory Animal: Guideline for Ethical Review of Animal Welfare(GB/T 35892—2018), ARRIVE 2.0, IGP 2012 and IAVE 2010.

[作者貢獻(xiàn)]Author Contribution]

麥麗開(kāi)·阿不力米提負(fù)責(zé)文獻(xiàn)查閱和整理，以及文章撰寫(xiě)與修改；艾山·艾比布勒和史深協(xié)助完成動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，并整理分析數(shù)據(jù)；阿不都沙拉木·阿不都熱依木參與文章思路及整體內(nèi)容的討論；艾尼瓦爾·塔力甫負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與審核，并對(duì)全文內(nèi)容進(jìn)行指導(dǎo)。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。