劉佳妮, 劉劍剛, 韋 云, 羅增剛, 李 浩, 王 怡, 李 琨

(1. 中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院, 中國中醫(yī)科學(xué)院老年病研究所, 北京 100091; 2. 中國中醫(yī)科學(xué)院研究生院, 北京 100700; 3. 天津中醫(yī)藥大學(xué),天津 301617; 4. 北京市中醫(yī)管理局,北京 100053; 5. 北京開放大學(xué),北京 100081)

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）患者在淀粉樣蛋白-β（amyloid beta，Aβ）斑塊沉積和學(xué)習(xí)記憶障礙開始之前，往往會(huì)出現(xiàn)嗅覺功能障礙，其典型特征是識(shí)別氣味的能力下降［1］。淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）/早老素1（presenilin 1，PS1）等雙轉(zhuǎn)基因模型AD 小鼠也表現(xiàn)出嗅覺受損［2］。嗅覺功能障礙被認(rèn)為是AD的前驅(qū)癥狀，已被提議作為認(rèn)知障礙的預(yù)測(cè)因素［3］。因此，針對(duì)嗅覺功能障礙的干預(yù)可能有助于延緩AD患者認(rèn)知障礙病程的進(jìn)展。然而目前嗅覺減退的神經(jīng)機(jī)制在很大程度上是未知的。由于通常不會(huì)對(duì)嗅覺結(jié)構(gòu)進(jìn)行神經(jīng)病理學(xué)分析［4］，所以其臨床特征與潛在病理學(xué)之間的關(guān)系尚不清楚，但有研究者提出AD 患者嗅覺障礙可能是由嗅球（olfactory bulb）、嗅覺上皮或嗅皮質(zhì)受損引起［5］。

嗅球作為第一個(gè)處理嗅覺信息［6］、最早積累Aβ的大腦結(jié)構(gòu)，其病理變化已被證實(shí)可以顯示AD的早期神經(jīng)退行性變化，便于早期發(fā)現(xiàn)、早期干預(yù)［7］。已知嗅覺功能障礙癥狀會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而逐漸加重［8］，同時(shí)伴隨Aβ的沉積和擴(kuò)散；嗅球也隨著年齡的增長(zhǎng)會(huì)對(duì)Aβ的影響變得更加敏感［9］，更容易促進(jìn)Aβ的積累和釋放［10］。

鹽酸美金剛（memantine hydrochloride，MEM）是首個(gè)經(jīng)FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于治療中、重度AD的臨床藥物，具有調(diào)節(jié)谷氨酸活性的作用，屬于N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑的代表藥物［11］。多項(xiàng)研究表明，美金剛可以改善APPswe/PS1ΔE9 （APP/PS1）轉(zhuǎn)基因小鼠模型的學(xué)習(xí)記憶能力［12-13］。然而，美金剛對(duì)AD 嗅覺系統(tǒng)的作用報(bào)告并不多見，尚不清楚美金剛是否能改善APP/PS1小鼠模型的嗅球病理變化。

為了初步評(píng)估不同時(shí)程APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因模型小鼠的空間記憶能力和嗅球病理變化，以及美金剛的治療作用，本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)告［14］，選取6 月齡（成年期）和12月齡（中年期）的APP/PS1小鼠，比較美金剛對(duì)不同月齡APP/PS1 小鼠嗅球病理和突觸形態(tài)的干預(yù)作用，為美金剛用于治療AD嗅覺障礙提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)4 周齡雄性APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠40 只，4周齡雄性C57BL/6 小鼠20 只，體質(zhì)量均為13～15 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供［SCXK（京）2019-0008］，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為11401300070455。小鼠飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院屏障環(huán)境實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室［SYXK （京） 2018-0018］，室溫控制在24～26 ℃，相對(duì)濕度為40%～70%。小鼠自由進(jìn)食和飲水，每日光照和黑暗各12 h，待飼養(yǎng)到3月齡或9月齡后進(jìn)入分組實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R 原則，按照國家科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》和北京市《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查技術(shù)規(guī)范》的要求執(zhí)行。本研究方案經(jīng)過中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過（倫理審批號(hào)為2018XLC012-2）。

1.2 主要試劑與儀器

MEM 片（H.Lundbeck A/S 丹麥靈北制藥有限公司生產(chǎn)，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)為H20120268、H20130372）由中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院藥劑科提供；丙酮（批號(hào)20170411，進(jìn)口分裝）由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；Spon 812 包埋劑（批號(hào)ZB-S0060）購自美國SPI 公司；戊巴比妥鈉（批號(hào)T860901，進(jìn)口分裝）由佛山市化工實(shí)驗(yàn)廠提供；甲醛溶液（批號(hào)C10561782）購自上海麥克林生化科技有限公司。ZS-001 型Morris水迷宮系統(tǒng)由北京眾實(shí)迪創(chuàng)公司生產(chǎn)；H-7650型透射電鏡由日立（日本）公司生產(chǎn)；BX43型光學(xué)顯微鏡由日本奧林巴斯公司生產(chǎn)；RM2245型半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、ASP200S型全自動(dòng)脫水機(jī)、EG11型自動(dòng)包埋機(jī)和EM UC6超薄切片機(jī)均由德國Leica公司生產(chǎn)。

1.3 動(dòng)物模型和分組

APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠常規(guī)飼養(yǎng)至3月齡時(shí)，根據(jù)數(shù)字表法隨機(jī)分為6 月齡模型組（6-APP/PS1 組）、12月齡模型組（12-APP/PS1 組），以及使用藥物干預(yù)APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠的6 月齡MEM 組（6-MEM 組）、12 月齡MEM 組（12-MEM 組）。另設(shè)空白對(duì)照組，即常規(guī)飼養(yǎng)至3 月齡時(shí)的C57BL/6 小鼠分為6 月齡C57 組（6-C57組）、12月齡C57組（12-C57組）。以上每組各10只?？瞻捉M和模型組均以等體積純凈水灌胃，MEM組每日以MEM 2.6 mg/kg水溶液灌胃給藥。兩組小鼠分別在3月齡和飼養(yǎng)至9月齡時(shí)開始灌胃給藥，藥液體積為0.1～0.2 mL/10 g，均灌胃3 個(gè)月，分別至6 月齡和12月齡時(shí)進(jìn)行水迷宮行為學(xué)檢測(cè)。

1.4 水迷宮法檢測(cè)小鼠行為學(xué)變化

采用Morris 水迷宮評(píng)估小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力［15］。Morris 水迷宮由一個(gè)直徑1 m、高0.6 m的圓形水池組成，水位為35 cm，水溫保持在23 ℃。添加脫脂奶粉使池水變得不透明。逃生平臺(tái)位于水池的一個(gè)象限內(nèi)，位于水面以下1 cm處。小鼠依次放置在其他3個(gè)不同象限的水池中，每只小鼠有90 s的時(shí)間爬上平臺(tái)，并允許在平臺(tái)上停留5 s，若小鼠找不到平臺(tái)則引導(dǎo)其上到平臺(tái)。通過每日4次、連續(xù)5 d的訓(xùn)練，小鼠獲得了關(guān)于逃生平臺(tái)位置的空間記憶。第5 天訓(xùn)練后24 h，移除平臺(tái)，再讓小鼠在池中游90 s，記錄和分析小鼠在原平臺(tái)位置的穿越次數(shù)（即穿臺(tái)次數(shù)）、在目標(biāo)平臺(tái)象限的停留時(shí)間和路程（即目標(biāo)象限時(shí)間、目標(biāo)象限路程），以及總路程。

1.5 HE染色觀察小鼠嗅球病理形態(tài)

在Morris水迷宮測(cè)試后次日，小鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg 體質(zhì)量）深度麻醉，低溫下快速取出嗅球。每組隨機(jī)取5 只小鼠的嗅球組織，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液固定，常溫下保存。組織浸泡后，包埋浸蠟，切片脫蠟，二甲苯浸洗3 次，每次15 min；100%、90%、80%和70%梯度乙醇脫苯，每次3 min；自來水沖洗3 min，去離子水漂洗3 min；蘇木精染液染色10 min后水洗，鹽酸乙醇分色，2 s后水洗；1% 伊紅染液染色1 min，去離子水稍水洗；100%、90%、80%和70%梯度乙醇脫水，每次1 min；二甲苯透明3次，每次15 min；中性樹膠封固后，每張切片分別于40 倍和200 倍光學(xué)顯微鏡下觀察嗅球病理組織形態(tài)，并進(jìn)行拍照，采用Image Pro Premier圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.6 超薄切片染色觀察小鼠嗅球超微形態(tài)

另5 只小鼠嗅球組織用2.5%戊二醛磷酸緩沖液固定，保存于4 ℃冰箱。使用振動(dòng)切片機(jī)將嗅球冠狀切成厚度約0.2 mm的切片，然后用4%戊二醛固定2 h以上，再將嗅球組織切片暴露于1%鋨酸固定液2 h，用PBS 漂洗3 次（5 min/次），50%、70%、90%和100%梯度丙酮脫水（每次15 min），然后梯度浸透（丙酮和包埋劑比例依次為2∶1、1∶1、0∶1，各2 h），烤箱烘干（36～60 ℃，12～48 h）形成包埋塊。用超薄切片機(jī)行70 nm 切片，附于銅網(wǎng)上，超薄切片分別用醋酸鈾溶液和檸檬酸染液染色30 min，然后用透射電子顯微鏡觀察嗅球中神經(jīng)和突觸的超微結(jié)構(gòu)改變。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示。組間比較時(shí)采用單因素方差分析，方差齊時(shí)采用Tukey檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Games-Howell 檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，組間比較時(shí)使用非參數(shù)檢驗(yàn)的Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)程APP/PS1模型小鼠的空間記憶能力變化

連續(xù)5 d 訓(xùn)練小鼠記住逃生平臺(tái)的位置后，對(duì)第6天小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)的穿臺(tái)次數(shù)、目標(biāo)象限時(shí)間、目標(biāo)象限路程和總路程進(jìn)行分析。與6-C57 組比較，6-APP/PS1組的穿臺(tái)次數(shù)減少（P＜0.05），目標(biāo)象限時(shí)間和路程縮短（P＜0.05）。與12-C57 組比較，12-APP/PS1組小鼠穿臺(tái)次數(shù)明顯減少（P＜0.05），目標(biāo)象限時(shí)間和路程顯著縮短（P＜0.05）。與6-C57組比較，12-C57組小鼠穿臺(tái)次數(shù)減少（P＜0.05），目標(biāo)象限時(shí)間和路程縮短（P＜0.05）。與6-APP/PS1 比較，經(jīng)過MEM（2.6 mg/kg）干預(yù)后，6-MEM 組穿臺(tái)次數(shù)顯著增加（P＜0.05），目標(biāo)象限時(shí)間和路程明顯延長(zhǎng)（P＜0.05）。和12-APP/PS1比較，12-MEM組穿臺(tái)次數(shù)增加（P＜0.05），目標(biāo)象限時(shí)間和路程明顯延長(zhǎng)（P＜0.05）。總路程上，6-C57 組和6-APP/PS1 組無明顯差異（P＞0.05），而12-APP/PS1 組小鼠比12-C57 組顯著縮短（P＜0.05），其余各組無顯著差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，美金剛治療改善了APP/PS1 小鼠的空間記憶能力。結(jié)果見圖1A。

在空間探索實(shí)驗(yàn)中，C57 組小鼠通常采用趨向平臺(tái)式的搜索方式，而APP/PS1 組則多采用隨機(jī)式或邊緣式的搜索策略，提示APP/PS1 組小鼠空間記憶能力出現(xiàn)損傷；MEM 干預(yù)后的APP/PS1 小鼠顯示傾向使用趨向平臺(tái)式的搜索方式，說明MEM能提高APP/PS1小鼠的空間記憶能力。結(jié)果見圖1B。

圖1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估各組小鼠的行為學(xué)變化Figure 1 Morris water maze test to evaluate the behavioral changes of mice in each group

2.2 不同時(shí)程APP/PS1 模型小鼠的嗅球病理變化

HE 染色后光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果（圖2）顯示，6-C57組小鼠的嗅球在低倍鏡（×40）下呈卵圓形，結(jié)構(gòu)完整清晰，內(nèi)層可見大量神經(jīng)元呈環(huán)狀、層狀排布，規(guī)則緊密，細(xì)胞核呈圓形，自外向內(nèi)依次可觀察到嗅神經(jīng)層、小球?qū)樱╣lomerular layer）、外叢狀層、僧帽細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層和顆粒細(xì)胞層；高倍鏡（×200）下可見小球?qū)泳o致，邊界清楚，呈球形排列，每個(gè)突觸小球周圍的球周細(xì)胞（periglomerular cells）分布密集。外叢狀層細(xì)胞深部可見僧帽細(xì)胞（mitral cells）胞體較大，胞質(zhì)豐富。

圖2 HE染色后光學(xué)顯微鏡觀察各組小鼠的嗅球病理變化Figure 2 Pathological changes of the olfactory bulb in mice in each group observed by optical microscopy after hematoxylin-eosin staining

與6-C57 組相比，6-APP/PS1 組低倍鏡（×40）下可見嗅球?qū)訝罱Y(jié)構(gòu)完整清晰，突觸小球無明顯變化；高倍鏡（×200）下可見部分突觸小球周圍的球周細(xì)胞分布稀疏且數(shù)量稍減少，僧帽細(xì)胞萎縮且數(shù)量明顯減少。

與6-APP/PS1 組相比，6-MEM 組低倍鏡（×40）下可見嗅球形態(tài)較好，各細(xì)胞層結(jié)構(gòu)較完整，小球?qū)由运缮⒌鶆蚍植?，呈球形結(jié)構(gòu)，數(shù)量較多；高倍鏡（×200）下可見球周細(xì)胞數(shù)量稍增多，僧帽細(xì)胞數(shù)量則明顯增多。

與6-C57 組相比，12-C57 組低倍鏡（×40）下可見嗅球形態(tài)出現(xiàn)輕度改變，各細(xì)胞層結(jié)構(gòu)尚完整，小球?qū)硬糠智肪鶆蚍植?，邊界尚清楚；高倍鏡（×200）下可見球周細(xì)胞稍減少，僧帽細(xì)胞密度下降。

與12-C57 組相比，12-APP/PS1 組的部分嗅球?qū)咏Y(jié)構(gòu)缺失，小球?qū)铀缮⑶覕?shù)量變少；高倍鏡（×200）下突觸小球數(shù)量減少伴有結(jié)構(gòu)不清，周圍的球周細(xì)胞明顯減少，僧帽細(xì)胞數(shù)量大幅減少。

與12-APP/PS1 組相比，12-MEM 組低倍鏡（×40）下可見嗅球形態(tài)輕度變形，結(jié)構(gòu)尚完整，小球?qū)咏Y(jié)構(gòu)部分欠均勻分布，邊界尚清楚；高倍鏡（×200）下可見球周細(xì)胞和僧帽細(xì)胞數(shù)量稍增多。

統(tǒng)計(jì)分析各組小鼠嗅球中球周細(xì)胞和僧帽細(xì)胞的數(shù)量（圖3），結(jié)果發(fā)現(xiàn)APP/PS1 小鼠6 月齡時(shí)嗅球病理形態(tài)與C57BL/6 小鼠無顯著差異，僧帽細(xì)胞數(shù)量開始出現(xiàn)減少（P＜0.05）；12 月齡可觀察到嗅球的球周細(xì)胞和僧帽細(xì)胞數(shù)量均顯著減少（P＜0.05）。與同齡的APP/PS1 小鼠相比，MEM 干預(yù)后，6 月齡時(shí)嗅球的僧帽細(xì)胞數(shù)量增加（P＜0.05），而12 月齡時(shí)球周細(xì)胞及僧帽細(xì)胞數(shù)量無明顯增加（P＞0.05）。結(jié)果說明，MEM有助于緩解嗅球病理學(xué)損傷，且在早期干預(yù)效果更加明顯。

圖3 美金剛對(duì)球周細(xì)胞（A）和僧帽細(xì)胞（B）的影響Figure 3 Effects of memantine on periglomerular cells（A）and mitral cells（B）

2.3 不同時(shí)程APP/PS1 模型小鼠的嗅球神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)改變

超薄切片染色后透射電子顯微鏡觀察結(jié)果（圖4A）顯示，6-C57組小鼠嗅球組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，呈橢圓形，結(jié)構(gòu)清晰；細(xì)胞膜完整；核仁明顯，大小基本正常；染色質(zhì)分布較均勻，偶有染色質(zhì)凝聚。6-APP/PS1 組小鼠嗅球神經(jīng)元形態(tài)尚規(guī)則，少量胞體及細(xì)胞器腫脹；細(xì)胞核形態(tài)有改變，出現(xiàn)分葉；核膜凹陷形成核裂，染色質(zhì)濃縮邊集，部分核仁消失。6-MEM 組小鼠嗅球神經(jīng)元形態(tài)得到改善，形態(tài)較為規(guī)則，細(xì)胞膜偶有不連續(xù)；細(xì)胞核較為完整，可見部分細(xì)胞存在核仁；染色質(zhì)部分邊集，分布尚均勻。

12-C57 組小鼠嗅球組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)基本正常，部分結(jié)構(gòu)不清晰，細(xì)胞膜尚連續(xù)，染色質(zhì)出現(xiàn)邊集趨勢(shì)，細(xì)胞內(nèi)脂褐素增多。12-APP/PS1組小鼠神經(jīng)細(xì)胞失去正常形態(tài)，出現(xiàn)廣泛水腫、變性和壞死，形態(tài)不規(guī)則；細(xì)胞核形態(tài)明顯改變，染色質(zhì)高度凝聚，細(xì)胞核固縮、溶解或核仁消失。12-MEM 組小鼠嗅球組織神經(jīng)細(xì)胞異常形態(tài)較多，胞體水腫，部分細(xì)胞核形態(tài)改變，染色質(zhì)邊集。

隨著月齡增加，APP/PS1 小鼠的嗅球神經(jīng)元變性程度逐漸加重，可見嗅球神經(jīng)元形態(tài)不規(guī)則，尤其染色質(zhì)會(huì)出現(xiàn)明顯的凝聚邊集現(xiàn)象。與APP/PS1 小鼠相比，MEM可使細(xì)胞形態(tài)更規(guī)則完整，染色質(zhì)邊集情況一定程度減輕，且6-MEM 比12-MEM 改善更加明顯。結(jié)果說明，MEM 早期干預(yù)有助于改善APP/PS1 模型小鼠嗅球神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的損傷。

2.4 不同時(shí)程APP/PS1 模型小鼠的嗅球突觸超微結(jié)構(gòu)改變

超薄切片染色后透射電子顯微鏡觀察結(jié)果（圖4B）顯示，6-C57 組小鼠嗅球組織突觸結(jié)構(gòu)正常，可見大量對(duì)稱性突觸（抑制性突觸）和非對(duì)稱性突觸（興奮性突觸），突觸界面完整清晰，突觸膜后致密物（postsynaptic density，PSD）較厚，突觸前囊內(nèi)有大量神經(jīng)遞質(zhì)小泡，突觸小泡膜結(jié)構(gòu)清晰正常。與6-C57組相比，6-APP/PS1 組突觸結(jié)構(gòu)出現(xiàn)腫脹，突觸界面損傷，PSD 厚度減小，對(duì)稱性突觸數(shù)量減少，突觸小泡膜結(jié)構(gòu)損傷。與6-APP/PS1 組相比，6-MEM 組突觸形態(tài)有一定改善，突觸界面較清晰，神經(jīng)遞質(zhì)小泡較多，對(duì)稱性突觸數(shù)量增多。

圖4 超薄切片染色后透射電子顯微鏡觀察各組小鼠嗅球神經(jīng)（A，×7 000）和突觸（B，×60 000）細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Figure 4 Ultrastructure of the olfactory bulb nerve cells（A，×7 000）and synapses（B，×60 000）in each group observed by transmission electron microscope after ultrathin section staining

12-C57組小鼠嗅球組織突觸數(shù)量略有減少，非對(duì)稱性突觸膜結(jié)構(gòu)欠清晰，突觸小泡數(shù)量減少。與12-C57 組相比，12-APP/PS1 組突觸結(jié)構(gòu)損害加重，形態(tài)不規(guī)則，突觸體廣泛腫脹、變性，鏡下呈顆粒樣，突觸界面和突觸小泡無法分辨。與12-APP/PS1 組相比，12-MEM 組突觸改善不明顯，仍有部分腫脹，突觸界面不清晰，突觸數(shù)量及突觸小泡數(shù)量無明顯增加。其中12-APP/PS1組以及12-MEM組由于突觸體腫脹和鏡下顆粒樣變化，無法對(duì)突觸、囊泡數(shù)量和PSD 厚度進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)以及長(zhǎng)度測(cè)量。

結(jié)果顯示不同月齡的C57BL/6、APP/PS1小鼠以及MEM 干預(yù)后APP/PS1 小鼠的嗅球突觸超微結(jié)構(gòu)改變，表明在衰老過程中，APP/PS1 小鼠顯示出比與其年齡匹配的C57BL/6 小鼠相對(duì)更顯著的突觸結(jié)構(gòu)受損，而MEM可以改善這種突觸損害，且早期干預(yù)的改善效果更明顯。

3 討論

AD是一種以進(jìn)行性記憶缺陷和認(rèn)知能力下降為特征的神經(jīng)退行性疾病。針對(duì)AD的APP/PS1模型動(dòng)物的認(rèn)知缺陷在水迷宮測(cè)試中已經(jīng)得到了證實(shí)［16］，APP/PS1 小鼠空間記憶受損最早可在6 月齡時(shí)出現(xiàn)［17］，12月齡時(shí)認(rèn)知和行為缺陷明顯［18］，且記憶損害會(huì)在該模型的后續(xù)生命發(fā)展中持續(xù)存在［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，與6-C57 組相比，12-C57 組小鼠的空間記憶能力有顯著下降，與以往文獻(xiàn)報(bào)告［20］相符。在6月齡時(shí)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的空間記憶障礙開始出現(xiàn)，在12月齡時(shí)小鼠空間記憶功能嚴(yán)重受損。既往研究表明，用美金剛治療可以改善轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型的學(xué)習(xí)記憶缺陷以及突觸神經(jīng)傳遞［21］，本研究給予APP/PS1小鼠美金剛灌胃治療，證明美金剛可以恢復(fù)不同月齡APP/PS1 小鼠的空間記憶能力。此外，本研究初步闡述了美金剛可能對(duì)AD嗅覺結(jié)構(gòu)改善有作用。

嗅覺減退是AD 常見的臨床前驅(qū)癥狀［22］，超過90%的AD 患者都會(huì)存在嗅覺功能障礙［23］。嗅覺功能障礙伴隨著嗅覺結(jié)構(gòu)的病理改變和細(xì)胞損傷，其中嗅球?qū)D病理學(xué)高度敏感，特別容易出現(xiàn)功能障礙，也是最早積累Aβ的大腦結(jié)構(gòu)之一。Moriguchi等［24］研究顯示，小鼠嗅球切除會(huì)引起認(rèn)知缺陷，并降低海馬中的膽堿能活性，說明嗅球與認(rèn)知障礙密切相關(guān)。僧帽細(xì)胞是嗅球中最主要的投射神經(jīng)元，在嗅覺信息的傳遞和加工中具有重要作用，而球周細(xì)胞會(huì)對(duì)僧帽細(xì)胞的電活動(dòng)進(jìn)行相關(guān)調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，6 月齡APP/PS1 小鼠嗅球內(nèi)開始出現(xiàn)僧帽細(xì)胞數(shù)量下降，12月齡APP/PS1小鼠部分嗅球的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)萎縮變形，尤其球周細(xì)胞和僧帽細(xì)胞數(shù)量顯著減少。既往實(shí)驗(yàn)證實(shí)，APP/PS1 小鼠在6～10 月齡時(shí)出現(xiàn)嚴(yán)重的嗅覺缺陷［25］；結(jié)合本研究結(jié)果推測(cè)，這可能與嗅球神經(jīng)細(xì)胞萎縮變形以及球周細(xì)胞和僧帽細(xì)胞數(shù)量減少有關(guān)，而MEM 的早期干預(yù)可以改善APP/PS1 小鼠嗅球病理形態(tài)的變化，增加僧帽細(xì)胞數(shù)量，保護(hù)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的完整。

嗅球具有多種類型的神經(jīng)遞質(zhì)，其中谷氨酸和γ-氨基丁酸等是最常見最重要的遞質(zhì)，這些神經(jīng)遞質(zhì)的改變被認(rèn)為是記憶障礙的主要原因之一［26］。僧帽細(xì)胞以谷氨酸作為神經(jīng)遞質(zhì)［27］，球周細(xì)胞以γ-氨基丁酸和多巴胺作為神經(jīng)遞質(zhì)［28］，其中谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，通過特異性受體發(fā)揮作用，例如N-甲基-D-天冬氨酸受體。谷氨酸興奮性毒性會(huì)引發(fā)神經(jīng)元持續(xù)性去極化，造成神經(jīng)功能異常，是AD進(jìn)展的重要原因之一［29］。而MEM屬于非競(jìng)爭(zhēng)性N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑，可以阻斷谷氨酸濃度病理性升高導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷［30］，還可通過N-甲基-D-天冬氨酸受體減少不溶性Aβ含量，然后恢復(fù)AD動(dòng)物模型中的谷氨酸穩(wěn)態(tài)［31］。筆者推測(cè)MEM干預(yù)后嗅球內(nèi)病理形態(tài)改善、僧帽細(xì)胞數(shù)量增加可能與其減輕了嗅球中Aβ的積累、減輕谷氨酸誘導(dǎo)的僧帽細(xì)胞損傷有關(guān)。

突觸損傷是AD 病理生理學(xué)中的早期和關(guān)鍵事件，突觸變化的可能后果就是學(xué)習(xí)和記憶功能受損［32］。與Aβ斑塊、神經(jīng)原纖維纏結(jié)或神經(jīng)元丟失相比，突觸損傷與AD患者中觀察到的認(rèn)知缺陷更相關(guān)［33］。目前AD突觸研究大量集中在海馬［34］、皮質(zhì)等領(lǐng)域，極少涉及嗅球。有研究表明，6～7 月齡之后的APP/PS1 轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠嗅球的樹突棘密度顯著降低，突觸小泡破損，PSD 厚度降低［35］。本研究發(fā)現(xiàn)，6 月齡APP/PS1小鼠突觸結(jié)構(gòu)出現(xiàn)腫脹，12 月齡小鼠的突觸結(jié)構(gòu)損傷更為嚴(yán)重，突觸界面無法分辨，與以往文獻(xiàn)報(bào)告結(jié)果相同。MEM 干預(yù)3 個(gè)月后可緩解APP/PS1 小鼠的突觸損傷，早期（3月齡）較晚期（9月齡）時(shí)進(jìn)行干預(yù)的改善效果更明顯。異常的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)興奮性是AD的一個(gè)普遍特征。Palop等［36］研究表明，中等水平的Aβ可以增強(qiáng)突觸前活動(dòng)及突觸傳遞，而高水平的Aβ會(huì)降低谷氨酸能突觸傳遞并最終導(dǎo)致突觸丟失。另外，Wesson等［37］認(rèn)為嗅球的早期神經(jīng)元過度興奮可能增強(qiáng)Aβ的突觸后釋放。因此，異常的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)興奮性與Aβ的產(chǎn)生、釋放之間形成了惡性循環(huán)，這種惡性循環(huán)可能加速AD 的發(fā)病。筆者推測(cè)美金剛在Aβ 低濃度階段的早期（3月齡）干預(yù)降低了嗅球神經(jīng)元的過度興奮及其對(duì)Aβ的積累和傳遞，從而改善了6-APP/PS1組小鼠的突觸結(jié)構(gòu)。

認(rèn)知障礙主要是由與年齡相關(guān)的神經(jīng)病變累積驅(qū)動(dòng)［38］，同時(shí)自然老化過程也是影響嗅覺功能的主要因素之一［39］。有研究認(rèn)為，嗅覺功能障礙已被確定為老年人5 年死亡率的最佳預(yù)測(cè)指標(biāo)［40］。本研究觀察到，與6-C57 相比，12-C57 的僧帽細(xì)胞密度下降，突觸小泡數(shù)量減少，說明隨月齡增加，C57BL/6 小鼠不僅會(huì)出現(xiàn)空間記憶能力的下降，嗅球也會(huì)出現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)的早期改變，提示老化是影響認(rèn)知功能和嗅覺病理的重要因素。研究顯示，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠嗅球中Aβ負(fù)荷呈年齡依賴性增加［41］，而嗅覺系統(tǒng)中Aβ 沉積物會(huì)促進(jìn)嚙齒類動(dòng)物的AD 病理學(xué)改變［42］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與12-C57 相比，12-APP/PS1 小鼠的空間記憶能力有顯著下降，球周細(xì)胞、僧帽細(xì)胞數(shù)量大幅減少，突觸結(jié)構(gòu)損害加重，突觸體廣泛腫脹、變性，說明APP/PS1 小鼠在衰老過程中比正常同齡小鼠更容易出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙和嗅球病理改變，而嗅覺系統(tǒng)的顯著病理改變可能是加重空間學(xué)習(xí)記憶障礙的重要原因。

美金剛可以減少嗅球神經(jīng)元的損傷，增加僧帽細(xì)胞數(shù)量，改善突觸結(jié)構(gòu)。根據(jù)既往研究推測(cè)，美金剛可能通過阻斷谷氨酸濃度的升高、減少AD早期嗅球神經(jīng)元過度活躍，減少腦內(nèi)Aβ的產(chǎn)生和傳播，從而改善空間記憶能力。未來本研究組將重點(diǎn)研究AD模型小鼠空間記憶與嗅球內(nèi)部神經(jīng)震蕩、神經(jīng)元活動(dòng)的相關(guān)性，以此探討美金剛在AD 嗅覺障礙臨床應(yīng)用中的潛在機(jī)制。此外，AD嗅覺缺陷是由于中樞還是外周嗅覺神經(jīng)系統(tǒng)的功能障礙所引起，目前這一問題仍不明確。大腦皮層和邊緣系統(tǒng)都有可能是AD嗅覺障礙的原因。美金剛對(duì)嗅覺投射的大腦皮層（顳葉）、邊緣系統(tǒng)（杏仁核、海馬和下丘腦）等其他嗅覺系統(tǒng)及認(rèn)知功能的影響，也需要更多的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)來明確。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)初步觀察了不同時(shí)程APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠嗅球病理和超微結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)美金剛早期干預(yù)可能是改善AD 嗅球病理改變的有效方法，但這一結(jié)果還需要進(jìn)一步的研究加以證實(shí)。

【醫(yī)學(xué)倫理聲明Medical Ethics Statement】

本研究涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已通過中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（No.2018XLC012-2）。所有實(shí)驗(yàn)過程均遵照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)法律法規(guī)條例要求進(jìn)行。

All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by Medical Ethics Committee of Xiyuan Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences (Approval Letter No. 2018XLC012-2), and all experimental protocols were carried out following the guidelines such asAnimal Management Regulations(01/03/2017),Laboratory Animal: Guideline for Ethical Review of Animal Welfare(GB/T 35892—2018), ARRIVE 2.0, IGP 2012 and IAVE 2010.

[作者貢獻(xiàn)Author Contribution]

劉佳妮負(fù)責(zé)具體的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析、文章撰寫及修改；劉劍剛和韋云負(fù)責(zé)研究思路設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)課題申報(bào)、實(shí)驗(yàn)方案制定、部分實(shí)驗(yàn)操作、倫理委員會(huì)審批程序并提供文件信息，以及修改文章；羅增剛、李浩和王怡提供技術(shù)援助并負(fù)責(zé)論文審核及把關(guān)；李琨收集資料并輔助數(shù)據(jù)分析與核對(duì)。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。