彭長庚, 富 研,2, 朱馮婷,3, 夏瑞龍, 夏 瑋

(1. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院,同濟(jì)大學(xué)附屬上海第一康復(fù)醫(yī)院,同濟(jì)大學(xué)腦與脊髓研究中心,同濟(jì)大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)高等研究院,上海 200092; 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海 201306; 3. 大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,大理 671000)

神經(jīng)病理性疼痛是一種嚴(yán)重的慢性疼痛，影響約10%的人群。神經(jīng)病理性疼痛的主要特征之一是機(jī)械痛覺敏感，其一線藥物的療效和有效率都有限。脊髓中小膠質(zhì)細(xì)胞在外周神經(jīng)損傷（peripheral nerve injury）誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛中起著重要而又相互矛盾的作用［1-2］：在外周神經(jīng)損傷后24 h 可激活小膠質(zhì)細(xì)胞，后者表達(dá)離子鈣結(jié)合銜接分子1 （ionized calcium binding adapter molecule 1，IBA1）和C-X3-C趨化因子受體1（C-X3-C motif chemokine receptor 1，CX3CR1）；在損傷48 h內(nèi)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞增生，后者表達(dá)CD11b，而CD11b 是補(bǔ)體受體3（complement receptor 3，CR3）二聚體中的α 亞基。這些損傷早期（14 d 內(nèi)）激活的和新生的小膠質(zhì)細(xì)胞通過表達(dá)CX3CR1、P2X4、P2X7、P2Y12 和TLR4 等炎癥相關(guān)受體，并分泌腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1b、IL-6、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）等促炎癥因子和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF），對神經(jīng)損傷后的神經(jīng)病理性疼痛起促進(jìn)作用。阻斷小膠質(zhì)細(xì)胞的激活或阻止小膠質(zhì)細(xì)胞的增生都能緩解神經(jīng)病理性疼痛，但前期的研究也發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞還分泌Resolvins、Lipoxins、Maresins 和Protectins 等可抑制/終止炎性反應(yīng)的因子，從而緩解神經(jīng)病理性疼痛［1-2］。

正是由于小膠質(zhì)細(xì)胞具有雙向調(diào)節(jié)炎癥的兩面性，使得臨床藥物研究的結(jié)果呈現(xiàn)不一致性，治療效果不佳。比如，能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活的低劑量納曲酮可減輕纖維肌肉疼痛癥狀［3］，但同樣可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活的米諾環(huán)素未能減緩神經(jīng)病理性疼痛［4］。相反，Curtin 等［5］的研究發(fā)現(xiàn)口服米諾環(huán)素非但不能減少腕管綜合征（一種神經(jīng)病理性疼痛）患者在手部手術(shù)后的疼痛時間，甚至?xí)娱L創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙癥狀加重的患者的疼痛時間，這表明小膠質(zhì)細(xì)胞在人類中也可能有促進(jìn)疼痛緩解的功能。因此，厘清小膠質(zhì)細(xì)胞緩解疼痛的功能對開發(fā)可能的相關(guān)鎮(zhèn)痛藥物至關(guān)重要。

1 CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞亞群緩解疼痛功能的發(fā)現(xiàn)

2022 年4 月Science雜志發(fā)表Kohno 等［6］的研究報告顯示，小鼠脊髓中被外周神經(jīng)損傷激活的CD11c+（又稱Itgax）小膠質(zhì)細(xì)胞通過分泌胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）來緩解神經(jīng)病理性疼痛和抑制疼痛的復(fù)發(fā)。

該研究首先利用Itgax-Venus轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)外周神經(jīng)損傷14 d 時，損傷同側(cè)脊髓中出現(xiàn)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）標(biāo)記的CD11c+細(xì)胞，該細(xì)胞表達(dá)IBA1、CD11b 和HEX2b，不表達(dá)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acid protein，GFAP）（星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物）、APC（少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物）和NeuN（神經(jīng)元標(biāo)志物），從而確定這些細(xì)胞是小膠質(zhì)細(xì)胞的一個亞群。然后用流式細(xì)胞儀分選發(fā)現(xiàn)，CD11c+/CD11b+小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目的峰值出現(xiàn)在損傷后的第14 天，而CD11c-/CD11b+小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目的峰值出現(xiàn)在第7 天。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)CD11c（CD11chigh）的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目從損傷后的第7 天顯著增加，在第35 天時達(dá)峰值，在實(shí)驗(yàn)的最長時間點(diǎn)（第56天）還是維持在很高水平，這與神經(jīng)病理性疼痛的緩解時程較吻合。

為驗(yàn)證CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞能緩解神經(jīng)病理性疼痛，該研究從外周神經(jīng)損傷手術(shù)后第14 天開始連續(xù)每周注射一次白喉毒素至Itgax-DTR-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠的鞘內(nèi)，白喉毒素可以選擇性殺死表達(dá)白喉毒素受體（diphtherial toxin receptor，DTR）的CD11c+細(xì)胞。機(jī)械疼痛閾值檢測發(fā)現(xiàn)，注射PBS的Itgax-DTR-EGFP小鼠的神經(jīng)病理性疼痛在損傷后第14天發(fā)展至最嚴(yán)重，從第3周開始逐步恢復(fù)，到第4周時機(jī)械疼痛閾值恢復(fù)至接近手術(shù)前的閾值；但注射白喉毒素清除CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞后，Itgax-DTR-EGFP小鼠的神經(jīng)病理性疼痛的恢復(fù)能力基本被消除。這項(xiàng)白喉毒素-DTR殺死特定細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因小鼠模型的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞是主要緩解神經(jīng)病理性疼痛的一類小膠質(zhì)細(xì)胞亞群。

隨后，該研究利用流式細(xì)胞分選-RNA 測序發(fā)現(xiàn)一些在外周神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞中差異表達(dá)的基因，從中選擇了IGF1作為假定的關(guān)鍵的疼痛緩解因子。關(guān)于這一點(diǎn)，作者沒有解釋原因。筆者檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，2017年Wlodarczyk等［7］報告，與健康成年小鼠來源的或炎癥激活的小膠質(zhì)細(xì)胞相比，新生小鼠大腦中小膠質(zhì)細(xì)胞具有獨(dú)特的髓鞘和神經(jīng)元表型，主要是CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞亞群通過分泌IGF1促進(jìn)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的存活、遷移和分化，并促進(jìn)髓鞘化。另外，研究已知新生幾周內(nèi)的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞分泌抗炎因子如IL-10 等，能阻斷外周神經(jīng)損傷誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生［8］。這兩篇研究文獻(xiàn)應(yīng)該是激發(fā)Kohno等［6］開展CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞研究并聚焦于IGF1的線索，但可能擔(dān)心創(chuàng)新性的評價受損而未引用并感激前人的成果。筆者認(rèn)為，這可能是論文發(fā)表要求新穎性導(dǎo)致的一種畸形現(xiàn)象，因?yàn)榛谛路f性的引用評價體系如果使用不當(dāng)就會抹殺很多重要發(fā)現(xiàn)的研究者應(yīng)得的聲譽(yù)，也會阻礙相關(guān)成果后續(xù)轉(zhuǎn)化研究的進(jìn)展。

利用Itgax-Cre；Igf1flox/flox細(xì)胞特異性敲除小鼠，Kohno 等［6］證實(shí)在CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞中敲除Igf1（即IGF1對應(yīng)基因）也同樣能消除小鼠神經(jīng)病理性疼痛的恢復(fù)能力。為排除Itgax-Cre；Igf1flox/flox小鼠敲除了Igf1對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的潛在影響，他們又構(gòu)建了Cx3cr1CreERT2；Igf1flox/flox誘導(dǎo)型細(xì)胞特性敲除小鼠，結(jié)果顯示在成年后注射他莫昔芬清除小膠質(zhì)細(xì)胞中的IGF1也同樣基本阻斷了小鼠神經(jīng)病理性疼痛的恢復(fù)能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)注射IGF1抗體或重組IGF1能阻斷神經(jīng)病理性疼痛的恢復(fù)能力，或短期抑制神經(jīng)病理性疼痛。最后，Kohno 等［6］證明在外周神經(jīng)損傷后第35 天神經(jīng)病理性疼痛接近恢復(fù)時，誘導(dǎo)清除Itgax-DTR-EGFP小鼠的CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞或誘導(dǎo)清除Cx3cr1CreERT2；Igf1flox/flox小鼠的CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞中的IGF1，都能讓小鼠重新出現(xiàn)機(jī)械痛覺敏感。

為了確認(rèn)CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞的活化是由C 纖維（C-fiber）還是A 纖維（A-fiber）的損傷引起，Kohno等［6］將 霍 亂 毒 素B 亞 基（Choleratoxin B subunit，CTB）或異凝集素B4（isolectin B4，IB4）結(jié)合的皂草素（CTB-Saporin、IB4-Saporin）注射至小鼠腳掌，分別損傷背根神經(jīng)節(jié)中A纖維神經(jīng)元（髓鞘包裹）和C-纖維神經(jīng)元（無髓鞘包裹），發(fā)現(xiàn)只有損傷A纖維神經(jīng)元能誘導(dǎo)出現(xiàn)CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞，但外周損傷不誘導(dǎo)已存在的CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞增生。并且通過原代細(xì)胞培養(yǎng)和椎管內(nèi)注射純化的髓磷脂碎片實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞是由小膠質(zhì)細(xì)胞在吞噬髓磷脂碎片后誘導(dǎo)表達(dá)CD11c。

2 結(jié)果點(diǎn)評

Kohno 等［6］利用多個基因條件性敲除小鼠和誘導(dǎo)型細(xì)胞特異性敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)被A 纖維感覺神經(jīng)元損傷后釋放的髓磷脂碎片激活的脊髓背角中小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CD11c+，此類CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞亞群通過分泌IGF1 來緩解外周神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的小鼠神經(jīng)病理性疼痛，并持續(xù)抑制異常機(jī)械疼痛的復(fù)發(fā)（圖1）。

圖1 CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞緩解神經(jīng)病理性疼痛的作用機(jī)制示意圖Figure 1 Schematic diagram of the mechanism by which CD11c+microglia relieve neuropathic pain

此發(fā)現(xiàn)指明脊髓內(nèi)CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞亞群是被外周神經(jīng)損傷激活的具有抗神經(jīng)痛的膠質(zhì)細(xì)胞，表明開發(fā)選擇性靶向CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞、促進(jìn)抗炎活性和（或）提高IGF1 表達(dá)及分泌能力的小分子，以及研發(fā)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes，hIPSC）來源的CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞，有可能緩解臨床上特定類型的外周神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛。從該研究的結(jié)果看，IGF1可能是CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞抑制疼痛的主要分子。但筆者深入分析該文中的差異表達(dá)基因（CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞與CD11c-小膠質(zhì)細(xì)胞相比）發(fā)現(xiàn)，CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)的基因富集在細(xì)胞因子相關(guān)信號通路、趨化因子相關(guān)信號通路、生長因子結(jié)合信號通路和脂蛋白顆粒結(jié)合信號通路等潛在與炎性反應(yīng)、疼痛相關(guān)的信號通路，低表達(dá)的基因主要富集在代謝相關(guān)的信號通路（圖2，表1）。

表1 CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)基因富集的潛在與疼痛相關(guān)的信號通路Table 1 Genes highly expressed in CD11c+microglia were enriched in pain-related signaling pathways

筆者進(jìn)一步利用STRING數(shù)據(jù)庫（https：//cn.stringdb.org/）分析CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)和低表達(dá)基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的抑制疼痛的基因除Igf1之外，還有Sod2、Anax2和Adora1；高表達(dá)的促疼痛的基因有Ccl5、Cd14、Cybb、Dtnbp1、Lgals1、Mif、Osm、Ptger4、Ptgs2、Spp1、Tlr2 和Csf1；抗炎性反應(yīng)的基因還有Il1rn、Lpl、Socs2 和Cd44；促炎性反應(yīng)的基 因還 有Ccl22、Ccl5、Ccl6、Cd36、Csf1、Cxcl10、Cxcr4、Il1b、Mif、Osm、Pdgfa、Areg和Spp1；低表達(dá)的基因中Tlr9 是抑制疼痛的基因，沒有促疼痛和與炎癥相關(guān)的基因（圖3）。從圖2 和圖3 可以看出，Sod2、Anax2 和Adora1 很可能也對CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞抑制疼痛的功能有貢獻(xiàn)。CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)一些促疼痛基因提示，CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞可能還不是一個單一的亞群，可能存在一部分CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞是促炎性反應(yīng)和疼痛的，后續(xù)需要通過單細(xì)胞測序確認(rèn)CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞是否是單一的群體細(xì)胞類型。

圖2 CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)（A）和低表達(dá)（B）基因的富集信號通路Figure 2 Signaling pathways enriched for genes that were expressed highly（A）or lowly（B）in CD11c+microglia

圖3 CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)的基因（196個）相互作用（A）和低表達(dá)的基因（75個）相互作用（B）Figure 3 Interaction of highly expressed genes（196）（A）and lowly expressed genes（75）（B）in CD11c+microglia

Kohno等［6］應(yīng)用的Itgax-Venus和Itgax-DTR-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠是由5 kb 的Itgax（即CD11c 對應(yīng)基因）啟動子驅(qū)動報告基因的表達(dá)，表明5 kb的Itgax啟動子能非常好地控制外源基因在小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)［9］?？梢赃\(yùn)用這5 kb 的Itgax啟動子來構(gòu)建Itgax-Igf1 敲入的小膠質(zhì)細(xì)胞株（過表達(dá)IGF1），推測移植持續(xù)分泌IGF 的Itgax-Igf1 敲入的小膠質(zhì)細(xì)胞株至鞘內(nèi)會有與注射IGF1一樣的緩解神經(jīng)病理性疼痛的效果，而且緩解疼痛的有效時間更長（圖4）。

圖4 Itgax-Igf1敲入的IGF1過表達(dá)的膠質(zhì)細(xì)胞可用于鎮(zhèn)痛研究Figure 4 Itgax-Igf1 knock-in glial cells with overexpressing IGF1 could be used for analgesic studies

3 研究展望

雖然Kohno 等［6］的發(fā)現(xiàn)給出了轉(zhuǎn)化研究的方向，但還是需要進(jìn)一步的研究來夯實(shí)CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞和IGF1成為藥物開發(fā)靶點(diǎn)的依據(jù)。比如需要：（1）檢測其他的外周神經(jīng)損傷小鼠模型中CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞激活的數(shù)目，以及CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞在緩解神經(jīng)病理性疼痛中的功能大小，因?yàn)門u 等［10］最新研究發(fā)現(xiàn)，椎間盤髓核壓迫坐骨神經(jīng)造成的神經(jīng)病理性疼痛不依賴小膠質(zhì)細(xì)胞；（2）確認(rèn)CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞是否也在大鼠、猴和人的脊髓中被外周神經(jīng)損傷激活，并且是膠質(zhì)細(xì)胞中主要的起抗炎鎮(zhèn)痛的亞群；（3）確定臨床的適應(yīng)癥是哪類神經(jīng)病理性疼痛；（4）探明外周神經(jīng)損傷引起的長期慢性神經(jīng)病理性疼痛是否會讓腦內(nèi)疼痛傳導(dǎo)、感知核團(tuán)中出現(xiàn)CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞；（5）檢查健康的腦內(nèi)是否存在CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞，如果存在，那么利用小分子增強(qiáng)CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞的功能時是否會對健康大腦產(chǎn)生不利影響，比如過度抑制腦內(nèi)炎性反應(yīng)而不能快速有效地消滅侵入大腦的病原體；（6）研究鞘內(nèi)給予IGF1是否會對大腦的功能（如多巴胺神經(jīng)元的功能）產(chǎn)生不良反應(yīng)。

而且需要強(qiáng)調(diào)，外周神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛不止有小膠質(zhì)細(xì)胞參與，還有星形膠質(zhì)細(xì)胞和直接傳導(dǎo)疼痛信號的敏化了的外周和脊髓神經(jīng)元參與，比如本研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)選擇性切斷神經(jīng)（spared nerve injury，SNI）會降低miR-96在小鼠背根神經(jīng)節(jié)和脊髓背角的神經(jīng)元中的表達(dá)，繼而升高電壓門控鈉離子通道Nav1.7、Nav1.8 和Nav1.9 的表達(dá)，從而敏化外周和脊髓神經(jīng)元，導(dǎo)致機(jī)械痛覺敏感［11］。因此，靶向CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞的治療藥物應(yīng)用于遺傳背景復(fù)雜的患者，其有效率和鎮(zhèn)痛效果需要謹(jǐn)慎估算。

另外，除了對疼痛治療研究的啟發(fā)外，Kohno等［6］的發(fā)現(xiàn)也提示CD11c+小膠質(zhì)細(xì)胞和IGF1 可能抑制炎癥相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，如帕金森病、阿爾茨海默病、肌萎縮側(cè)索硬化癥的發(fā)展。這些均值得進(jìn)一步研究探討。

[作者貢獻(xiàn)Author Contribution]

彭長庚檢索文獻(xiàn)、撰寫和修改文稿；富研分析差異表達(dá)基因，制作圖3 和修改文稿；朱馮婷制作圖1 和修改文稿；夏瑞龍分析差異表達(dá)基因，制作圖2及表1，修改文稿；夏瑋制作圖4和修改文稿。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。