張玲，韓基明，張江寧，丁衛(wèi)英，楊春*

山西農(nóng)業(yè)大學，山西功能食品研究院（太原 030031）

紅棗為鼠李科（Rhamnaceae）棗屬（Ziziphus MIll）植物的果實，含有豐富的營養(yǎng)成分，也是常用的中藥材[1]?，F(xiàn)代研究表明，紅棗中的多糖、三萜類物質(zhì)、環(huán)磷腺苷和黃酮苷等都是很強的抗氧化劑，其有清除自由基的功能，對提高機體免疫力和抗氧化作用的效果顯著[2-5]。我國棗的品種繁多，不同品種的棗中各營養(yǎng)和活性成分含量有一定的差異[6]。木棗主要分布在山西省呂梁地區(qū)和陜西省榆林地區(qū)黃河沿岸，為當?shù)刂髟云贩N，也是全國僅次于金絲小棗栽培面積的品種[7]，且木棗中的營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性成分含量較高[8-9]。研究以山西臨縣木棗為原料，同時利用益生菌的作用對棗汁進行發(fā)酵，并進一步分析發(fā)酵過程中主要功效酶活性、相關代謝產(chǎn)物以及味覺的變化規(guī)律，可為紅棗發(fā)酵功能制品的開發(fā)提供一定的理論基礎和技術依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木棗（山西臨縣）；果蔬酵素益生菌發(fā)酵劑（安琪）；果膠酶（北京索萊寶）；纖維素酶（北京索萊寶）；蘆丁（北京索萊寶）；沒食子酸（北京索萊寶）；葡萄糖（北京索萊寶）；乳酸試劑盒（北京索萊寶）；SOD酶試劑盒（南京建成）；多酚氧化酶試劑盒（南京建成）；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

WAY-2S蔗糖儀（上海卓光儀器科技有限公司）；Multiskan Go酶標儀（Thermo Scientific）；SC-3610離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；SPX-100B-Z培養(yǎng)箱（上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 木棗汁的發(fā)酵

稱取400 g鮮木棗，加入1 200 mL水，打漿后加入0.4 g果膠酶、0.1 g纖維素酶后置于60 ℃水浴鍋中酶解1 h，按3 500 r/min離心10 min，取上清液，備用。將制備好的木棗汁高溫瞬時滅菌，冷卻后按1∶2 000 g/mL棗汁的比例加入益生菌，置培養(yǎng)箱發(fā)酵，每隔1 d取樣測試，連續(xù)7 d。

1.3.2 總糖的測定

參考文獻[10]，采用DNS法，略有改動。發(fā)酵棗汁稀釋10倍，取100 μL的樣品稀釋液，按照葡萄糖標準曲線制作方法測定其吸光度，并計算樣品中還原糖的含量。

1.3.3 黃酮的測定

參考文獻[11]。發(fā)酵棗汁稀釋10倍，取1 mL的樣品稀釋液，按照蘆丁標準曲線制作方法測定其吸光度，并計算樣品中黃酮的含量。

1.3.4 總酚的測定

標準曲線的繪制：精確稱取5 mg沒食子酸標準樣品，用蒸餾水定容至50 mL，分別準確量取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mL標準液于10 mL比色管中，分別加入6 mL蒸餾水，搖勻后加0.5 mL Folin酚試劑搖勻，1 min后加入1.5 mL 20%的碳酸鈉溶液，混勻定容。75℃下恒溫水浴反應10 min，取出冷卻后在760 nm波長下測定吸光度，作標準曲線。

樣品的測定：發(fā)酵棗汁稀釋10倍，量取100 μL的樣品稀釋液，按照沒食子酸標準曲線制作方法測定其吸光度，并計算樣品中總酚的含量。

1.3.5 乳酸的測定

按照試劑盒說明書測定，原理：乳酸是生物體代謝過程中重要的中間產(chǎn)物，乳酸含量是評估糖原代謝和有氧代謝的重要指標。乳酸在乳酸脫氫酶的作用下生成丙酮酸，同時使NAD+還原生成NADH和H+，H+傳遞給PMS生成的PMSH2還原MTT生成紫色物質(zhì)，在570 nm處有特征吸收峰。

1.3.6 超氧化物歧化酶（SOD）酶活的測定

根據(jù)超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒說明書進行操作。

SOD活性（U/mL）=[抑制百分率/（1-抑制百分率）×V反總]/V樣×F（1）式中：V反總為反應液總體積，mL；V樣為樣液體積，mL；F為稀釋倍數(shù)。

1.3.7 多酚氧化酶（PPO）的測定

根據(jù)多酚氧化酶（PPO）活性檢測試劑盒說明書進行操作。果汁PPO活性單位定義：每分鐘每毫升果汁在酶反應體系中使在420 nm處吸光度變化0.01為一個酶活力單位。

式中：ΔA為測定管吸光度與對照管吸光度之差。

1.3.8 味覺分析

將紅棗發(fā)酵汁倒入電子舌專用燒杯至刻度線。按照設置的序列放置在電子舌自動進樣器上。試驗采用蒸餾水清洗和棗汁樣本交替檢測序列進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中總糖含量的變化

由圖1可知，發(fā)酵第2天，木棗汁中糖含量增加，可能是因為微生物前期對棗汁中的多糖進行分解，導致棗汁中可溶性多糖溶于發(fā)酵的棗汁中，從而使發(fā)酵棗汁中總糖含量上升。發(fā)酵第3天總糖含量下降，之后趨于平穩(wěn)，這是由于乳酸菌大量繁殖將棗汁中的糖代謝成乳酸等物質(zhì)的結(jié)果。

圖1 不同發(fā)酵時間棗汁中總糖含量變化

2.2 發(fā)酵過程中乳酸含量的變化

由圖2可知，發(fā)酵前2 d，木棗汁中乳酸含量緩慢上升，到第3天棗汁中乳酸含量顯著上升，這是由于乳酸菌開始大量繁殖將棗汁中的糖代謝成乳酸，之后乳酸含量又顯著降低，這是由于隨著發(fā)酵的進行，酸度和糖等條件發(fā)生改變，不利于乳酸菌的生長和產(chǎn)酸，并且在乳酸菌合成乳酸的同時，乳酸同樣作為碳源被微生物利用，進而造成乳酸含量逐步降低。

圖2 不同發(fā)酵時間棗汁中乳酸含量變化

2.3 發(fā)酵過程中總黃酮含量的變化

由圖3可知，木棗汁發(fā)酵過程中總黃酮含量呈下降趨勢，其原因可能是乳酸菌可分泌糖苷酶[12]：一方面將不溶性膳食纖維結(jié)合的黃酮釋放形成水溶性黃酮；另一方面又可能將水溶性黃酮苷水解成不溶性黃酮苷元。在發(fā)酵后期，發(fā)酵產(chǎn)酸導致強酸環(huán)境，黃酮在強酸環(huán)境中不穩(wěn)定也會被分解[13]。

圖3 不同發(fā)酵時間棗汁中黃酮含量變化

2.4 發(fā)酵過程中總酚含量的變化

由圖4可知，木棗汁發(fā)酵前2 d，總酚含量呈下降趨勢，可能是因為棗汁中酚類物質(zhì)被多酚氧化酶氧化成了醌類物質(zhì)[14]，隨著乳酸菌的大量繁殖，乳酸菌產(chǎn)生糖苷酶和酚酸酯酶[15]，將不溶性膳食纖維結(jié)合的酚類物質(zhì)釋放為可溶的游離態(tài)酚[16-17]，此外，棗汁pH發(fā)生下降，低酸環(huán)境也有利于保護酚羥基不發(fā)生氧化，因此發(fā)酵中期總酚含量呈上升趨勢。隨著發(fā)酵的繼續(xù)進行，總酚含量下降，可能是因為棗汁中環(huán)境改變，酚類物質(zhì)被氧化分解。

圖4 不同發(fā)酵時間棗汁中總酚含量變化

2.5 發(fā)酵過程中SOD酶的變化

由圖5可知，發(fā)酵前2 d，SOD酶活呈上升趨勢，隨著發(fā)酵的進行，SOD酶活逐漸下降，可能是因為隨著乳酸菌發(fā)酵的進行，棗汁體系中成分和pH的改變，使得SOD酶活性下降。

圖5 不同發(fā)酵時間棗汁中SOD酶含量變化

2.6 發(fā)酵過程中多酚氧化酶活性變化

由圖6可知，隨著發(fā)酵的進行，多酚氧化酶的酶活逐漸升高，第4天達到最高，之后隨著發(fā)酵時間的延長，其酶活又逐漸下降，可能是因為發(fā)酵棗汁體系中成分和pH的改變，使得酶活性下降。

圖6 不同發(fā)酵時間棗汁中多酚氧化酶酶含量變化

2.7 發(fā)酵棗汁的電子舌主成分分析

圖7為不同發(fā)酵時間的棗汁主成分PCA分析圖。第一主成分和第二主成分的總貢獻率達到了97.2%，識別指數(shù)是90，足以收集特征信息。發(fā)酵3 d和發(fā)酵4 d的棗汁分布區(qū)域較近，其他發(fā)酵時間的棗汁分別聚類在PCA圖中的不同區(qū)域，相互之間能夠較好地被區(qū)分。

圖7 發(fā)酵棗汁主成分分析

2.8 發(fā)酵棗汁的相似性分析

表1是7個不同發(fā)酵天數(shù)木棗汁電子舌相似性分析結(jié)果。發(fā)酵3 d和4 d的木棗汁兩者之間的距離值最小，可知兩者味覺的相似性較大。其次為發(fā)酵5 d和發(fā)酵6 d的棗汁，它們之間的距離為69.88，兩者之間的味覺相似性也較大。發(fā)酵1 d和發(fā)酵7 d的木棗汁之間的距離值最大，可知兩者的相似性最小。

表1 不同發(fā)酵天數(shù)的棗汁相似性分析

2.9 發(fā)酵棗汁的味覺分析

從表2可得知7個不同發(fā)酵天數(shù)木棗汁的酸、甜、苦、咸、鮮味的相對值。發(fā)酵3 d的木棗汁的酸味值較大，且苦味值較小。隨著發(fā)酵時間的延長，棗汁的苦味值逐漸增加，發(fā)酵7 d時，其木棗汁的苦味值最大。

表2 不同發(fā)酵天數(shù)的棗汁味覺分析

3 結(jié)論

研究表明，棗汁益生菌發(fā)酵過程中，發(fā)酵前2 d因為乳酸菌對棗汁中的多糖進行分解，木棗汁中糖含量增加，隨著發(fā)酵的進行，乳酸菌利用糖大量繁殖，使總糖含量下降，且乳酸含量逐漸增加，第3天達到最高。隨著發(fā)酵時間的延長，棗汁中黃酮含量呈下降趨勢，總酚發(fā)酵第2天含量下降，之后又呈上升趨勢，發(fā)酵4 d后總酚含量又逐漸下降。棗汁發(fā)酵前2 d SOD酶活呈上升趨勢，之后SOD酶活逐漸下降。發(fā)酵棗汁中多酚氧化酶的酶活逐漸升高，第4天達到最高，之后隨著發(fā)酵時間的延長，其酶活又逐漸下降。同時，試驗利用電子舌對不同發(fā)酵時間的木棗汁進行了味覺分析，綜合其乳酸含量以及酸、甜、苦、鮮、咸味覺變化，其木棗汁益生菌發(fā)酵適宜的時間為3 d。