田韻遠，陸云陽，劉楊，胡晉銘，李天怡，湯海峰（空軍軍醫(yī)大學藥學系中藥與天然藥物學教研室，西安 710032）

中藥重樓為百合科（Liliaceae）重樓屬云南重樓Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis或七葉一枝花ParispolyphyllaSmith var.chinensis的干燥根莖，具有清熱解毒、消腫止痛和涼肝定驚的功效，常用于疔瘡癰腫、咽喉腫痛、蟲蛇咬傷、跌打損傷、驚風抽搐等證[1]，是著名中成藥云南白藥膠囊、痛血康膠囊、熱毒清片等的主要組成藥材。重樓屬多種植物在民間作為中藥重樓使用，均富含甾體皂苷類成分。據(jù)2021年統(tǒng)計已從該屬植物中發(fā)現(xiàn)176種甾體皂苷，其中異螺甾烷醇型82種、螺甾烷醇型38種、呋甾烷醇型29種、變型螺甾烷醇型12種、膽甾烷醇型8種和C25為非手性碳的其他類甾體皂苷7種[2]。藥理研究發(fā)現(xiàn)，重樓的主要藥效物質(zhì)即為甾體皂苷，亦總稱為重樓皂苷，具有抗腫瘤、抗菌、抗心肌缺血、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、止血和溶血等多方面藥理和生物活性，現(xiàn)代臨床上常用于炎癥和腫瘤的治療[3]。

具柄重樓（Paris fargesiiFranch.var.petiolate）屬于南重樓組植物球藥隔重樓的變種，主要分布于我國西南各省區(qū)，如江西、廣西、貴州和四川，在陜西鳳縣、柞水縣、鎮(zhèn)坪縣等地亦有分布，多生于海拔1150～2270 m陰濕的闊葉林下[4-6]。具柄重樓具有較高的藥用價值，其根莖粗壯，在陜西多地與中藥重樓同名等效使用，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不甚清楚[7-8]。程虎印等[9]用HPLC法對陜產(chǎn)具柄重樓的化學成分進行分析，表明其含有重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ等成分，總含量達到2015年版《中國藥典》標準。但是，尚未見對具柄重樓化學成分分離鑒定的研究報道。本課題組長期從事重樓屬植物化學成分和抗腫瘤活性的研究[10-11]，明確具柄重樓的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為其開發(fā)利用提供理論依據(jù)，本文首次對具柄重樓根莖的化學成分進行研究，共分離鑒定了7個甾體皂苷1～7（見圖1），均為首次從具柄重樓中發(fā)現(xiàn)。其中，化合物5～7為重樓屬植物中少見的膽甾烷醇型甾體皂苷；化合物7的苷元具有6/6/6/5/5五環(huán)稠合膽甾烷骨架，具有這一新穎骨架的膽甾烷醇型甾體皂苷在天然界中較為罕見[12-13]，亦是首次從本屬植物中得到。

圖1 化合物1～7的結(jié)構(gòu)式Fig 1 Structures of compounds 1-7

1 材料

Quatrro Micro質(zhì)譜儀（Micromass公司）；Bruker AVANCE 800 型核磁共振波譜儀（Bruker公司）；戴安P680高效液相色譜儀（P680系列單泵、UV-VS 檢測器、CHROMELON工作站）[配YMC-Pack R&D ODS-A半制備色譜柱（20 mm×250 mm，5 μm）]；Agilent GC-6820氣相色譜儀[配HP-5 彈性石英毛細管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm），氫火焰離子化檢測器]；Sephadex LH-20凝膠（GE公司）；柱色譜硅膠（100～200目、200～300目）、薄層色譜用硅膠H、預(yù)制硅膠板G（青島海洋化工廠）；ODS C18柱、氘代試劑、RP-18高效薄層預(yù)制板（Merck公司）。色譜純甲醇（天津科密歐公司）；對照品L-阿拉伯糖、L-鼠李糖（上海藍季生物，純度≥99%）和D-葡萄糖（Sigma公司，純度≥99%）；顯色劑（20%硫酸/乙醇溶液）；其他試劑均為分析純。

藥材于2019年9月采自陜西省安康市鎮(zhèn)坪縣，經(jīng)空軍軍醫(yī)大學藥學系中藥與天然藥物學教研室湯海峰教授鑒定為具柄重樓[Paris fargesiiFranch.var.petiolate（Baker ex C.H.Wright） Wang et Tang]的根莖，藥材標本（No.20190903）保存于該教研室標本室。

2 提取與分離

取干燥粉碎的藥材1.89 kg用70%乙醇浸泡過夜，回流提取5次，每次2 h，減壓回收溶劑得浸膏746.09 g。浸膏用適量的水分散后，以等體積石油醚萃取3次，再用等體積的水飽和正丁醇萃取5次，減壓回收正丁醇層得總皂苷205.84 g。所得總皂苷經(jīng)硅膠柱色譜分離，用V二氯甲烷∶V甲醇∶V水（100∶1∶0～63∶35∶5）為洗脫劑梯度洗脫，合并得到8個部分（Fr.1～Fr.8）。選取Fr.6（4.13 g），經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜（洗脫劑為甲醇）除去水溶性雜質(zhì)得Fr.6-2（3.64 g），再經(jīng)ODS反相硅膠柱色譜，以V甲醇∶V水（20∶80～80∶20）為洗脫劑梯度洗脫，分離得到5個組分Fr.6-2-1～Fr.6-2-5。Fr.6-2-2（518.2 mg）以20%乙腈為流動相，通過半制備HPLC（流速10 mL·min-1，檢測波長206 nm；以下色譜條件均相同）分離得到化合物5（3.1 mg，tR＝48.8 min）。Fr.6-2-3（2.7 g）以20%乙腈為流動相，通過半制備HPLC分離得到Fr.6-2-3-1～Fr.6-2-3-8和化合物3（98.5 mg，tR＝51.8 min）；Fr.6-2-3-2（138.0 mg）、Fr.6-2-3-6（43.8 mg）和Fr.6-2-3-8（496.9 mg）分別經(jīng)過半制備HPLC分離純化，以20%乙腈洗脫，各得到化合物4（12.1 mg，tR＝32.2 min）、化合物6（8.0 mg，tR＝42.5 min）和化合物7（28.0 mg，tR＝21.8 min）。Fr.6-2-4（208.2 mg）以25%的乙腈為流動相，經(jīng)過半制備HPLC分離純化得到化合物1（11.4 mg，tR＝9.4 min）和化合物2（4.5 mg，tR＝48.1 min）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色無定形粉末，Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)呈陽性，表明該化合物可能是皂苷類。ESI-MS顯示其準分子離子峰m/z1087 [M+Na]＋和1063 [M-H]-，提示其相對分子質(zhì)量為1064，結(jié)合NMR數(shù)據(jù)推斷其分子式為C51H84O23。化合物1的NMR譜顯示δH0.91（s，H3-18），1.08（s，H3-19），1.36（d，J＝7.2 Hz，H3-21）和1.00（d，J＝6.4 Hz，H3-27）處的4個甲基氫信號，以及對應(yīng)的碳信號δC17.0，19.9，17.0和18.0；δH5.35（br s）處的烯烴信號和對應(yīng)的三取代烯烴碳信號δC122.4（C-6），141.2（C-5）；以及1個典型的22-OH呋甾烷醇信號δC111.2（C-22），這表明化合物1的苷元具有呋甾烷醇的骨架[14]。在HMBC譜中，H-4（δH2.81）、H-7（δH1.90）與C-5、C-6分別存在遠程相關(guān)信號，表明雙鍵位于5（6）位。在NOESY譜中，H3-19β/H-1b（δH1.76）和H-1a（δH0.98）/H-3（δH3.97）的NOE相關(guān)峰表明3-OH是β構(gòu)型[15]。通過H2-26化學位移值差δHa-δHb＝3.96-3.64＝0.32＜0.48，可以確定C25為R構(gòu)型[16]。苷元的13C-NMR（200 MHz，C5D5N）數(shù)據(jù)見表1。綜合以上分析，并與文獻對照[14]確定化合物1的苷元為（25R）-呋甾-5-烯-3β，22α，26-三醇。

取化合物1（1.5 mg）用2 mL 2 mol·L-1三氟乙酸水解，按文獻方法[11，17]將所得單糖制備三甲基硅醚化L-半胱氨酸衍生物，以標準糖衍生物作對照，進行GC分析，表明化合物1的單糖組成為D-葡萄糖（Glc）和L-鼠李糖（Rha）（3∶1）。在1H-NMR譜（800 MHz，C5D5N）中顯示4個糖基的端基氫信號δH4.84（d，J＝8.0 Hz，Glc Ⅰ），4.97（d，J＝7.2 Hz，Glc Ⅱ），5.14（d，J＝8.0 Hz，Glc Ⅲ） 和6.41（br s，Rha）。在HSQC譜中可找到各端基氫所對應(yīng)的端基碳信號δC105.4，100.4，105.1和102.7。由葡萄糖端基氫的耦合常數(shù)（J＞7.0 Hz）可知葡萄糖形成的苷鍵為β構(gòu)型；鼠李糖的端基氫信號為單峰，根據(jù)其C-5化學位移（δC70.1），可知其形成的苷鍵為α構(gòu)型[18-19]。在HMBC譜中，Glc Ⅱ C-1與苷元C-3存在遠程相關(guān)，說明Glc Ⅱ連接于苷元C-3位；Rha H-1與Glc Ⅱ C-2存在遠程相關(guān)，Glc Ⅲ H-1與Glc Ⅱ C-3存在遠程相關(guān)，表明Rha和Glc Ⅲ分別連接于Glc Ⅱ的2位和3位；Glc Ⅰ H-1與苷元C-26存在遠程相關(guān)，說明Glc Ⅰ連接在苷元C-26位。糖基部分的13C-NMR數(shù)據(jù)見表2。將化合物1的波譜數(shù)據(jù)與已知化合物protogracillin[14]對照，基本一致，從而確定了化合物1的結(jié)構(gòu)，為26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3β，22α，26-三羥基-（25R）-呋甾-5-烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-（1→3）-[α-L-吡喃鼠李糖基-（1→2）]-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物2：白色無定形粉末，Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)呈陽性，表明該化合物可能是皂苷類化合物。ESI-MS顯示其準分子離子峰m/z1217 [M+Na]＋和1193 [M-H]-，提示其相對分子質(zhì)量為1194，結(jié)合NMR數(shù)據(jù)推斷其分子式為C57H94O26。在化合物2的1H-NMR譜（800 MHz，C5D5N）高場區(qū)δH1.07，0.91，1.36和1.01處可見歸屬于苷元部分的4個甲基信號，在δH5.32處可見1個烯氫寬單峰信號。在化合物2的13C-NMR譜（200 MHz，C5D5N）中，可見1對烯碳信號δC122.3和141.3，1個半縮醛碳信號δC111.2。這些都是呋甾烷醇甾體皂苷元的特征信號?；衔?的苷元部分碳譜信息與化合物1一致，表明化合物2的苷元亦為（25R）-呋甾-5-烯-3β，22α，26-三醇。將化合物2按照與化合物1相同的方法酸水解后制備成單糖衍生物，通過GC分析表明其糖基為D-葡萄糖和L-鼠李糖（2∶3）。NMR譜中顯示5個糖的端基氫和端基碳信號 [δH4.84（d，J＝8.0 Hz，GlcⅠ），4.98（d，J＝7.2 Hz，Glc Ⅱ），6.42（br s，Rha Ⅰ），5.87（br s，Rha Ⅱ），6.32（br s，Rha Ⅲ）；δC105.4（GlcⅠ），100.8（Glc Ⅱ），102.7（Rha Ⅰ），102.7（Rha Ⅱ），103.8（Rha Ⅲ）]。通過HMBC譜分析，表明Glc Ⅱ與苷元的3位連接，Rha Ⅰ和Rha Ⅱ分別連接于Glc Ⅱ的2位和4位，Rha Ⅲ與Rha Ⅱ的4位連接，GlcⅠ與苷元的26位連接。因此確定化合物2的結(jié)構(gòu)為26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3β，22α，26-三羥基-（25R）-呋甾-5-烯-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-（1→4）-α-L-吡喃鼠李糖基-（1→4）-[α-L-吡喃鼠李糖基-（1→2）]-β-D-吡喃葡萄糖苷，即已知化合物dichotomin，波譜數(shù)據(jù)與文獻報道一致[20]。

化合物3：白色無定形粉末，Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)呈陽性，表明該化合物可能是皂苷類化合物。ESI-MS 顯示其準分子離子峰m/z1073 [M+Na]＋和1049 [M-H]-，提示其相對分子質(zhì)量為1050，結(jié)合NMR數(shù)據(jù)推斷其分子式為C50H82O23?；衔?苷元部分的碳譜信號與化合物1的信號基本一致，不同之處在于化合物3的C-16和C-17信號分別向低場位移至δC90.9和91.4，表明化合物3的C-17位連有羥基，按照生源途徑，該羥基應(yīng)為α構(gòu)型[10]。綜上分析，確定化合物3的苷元為（25R）-呋甾-5-烯-3β，17α，22α，26-四醇。按與化合物1相同的方法對化合物3進行酸水解及衍生，經(jīng)GC分析表明其糖基為D-葡萄糖、L-鼠李糖和L-阿拉伯糖（Ara）（2∶1∶1）。由阿拉伯糖C-1、C-2、C-4和C-5的化學位移值可知，該糖為呋喃型，且所形成的苷鍵為α構(gòu)型[21]。通過2D NMR分析歸屬了化合物3的所有碳氫信號，重要的1H-NMR（800 MHz，C5D5N）信號如下：δH0.97（3H，s，H3-18），1.10（3H，s，H3-19），1.40（3H，d，J＝7.2 Hz，H3-21），1.02（3H，d，J＝6.4 Hz，H3-27），5.30（1H，br s，H-6），4.84（1H，d，J＝8.0 Hz，GlcⅠ H-1），4.97（1H，d，J＝8.0Hz，GlcⅡ H-1），6.28（1H，br s，Rha H-1），5.93（1H，br s，Ara H-1）；苷元和糖基部分的13C-NMR（200 MHz，C5D5N）數(shù)據(jù)分別見表1和表2。根據(jù)HMBC譜分析，可確定苷元3位和26位的糖鏈分別為Ara（1→4）-[Rha（1→2）]-GlcⅡ-和GlcⅠ-。因此，鑒定化合物3的結(jié)構(gòu)為26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3β，17α，22α，26-四羥基-（25R）-呋甾-5-烯-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖基-（1→4）-[α-L-吡喃鼠李糖基-（1→2）]-β-D-吡喃葡萄糖苷，即已知化合物parisyunnanoside A，波譜數(shù)據(jù)與文獻報道一致[21-22]。

化合物4：白色無定形粉末，Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)呈陽性，表明該化合物可能是皂苷類化合物。ESI-MS 顯示其準分子離子峰m/z1233 [M+Na]＋和1209 [M-H]-，提示其相對分子質(zhì)量為1210，結(jié)合NMR數(shù)據(jù)推斷其分子式為C57H94O27。與化合物3對照，發(fā)現(xiàn)兩者苷元部分的碳譜數(shù)據(jù)一致，確定化合物4的苷元亦為（25R）-呋甾-5-烯-3β，17α，22α，26-四醇。按與化合物1相同的方法，對化合物4進行酸水解及衍生，經(jīng)GC分析表明化合物4的單糖組成為D-葡萄糖和L-鼠李糖（2∶3）。通過2D NMR分析歸屬了化合物4的所有碳氫信號，重要的1H-NMR（800 MHz，C5D5N）信號如下：δH0.91（3H，s，H3-18），1.10（3H，s，H3-19），1.40（3H，d，J＝7.2 Hz，H3-21），1.02（3H，d，J＝6.4 Hz，H3-27），5.30（1H，br s，H-6），4.84（1H，d，J＝7.2 Hz，GlcⅠ H-1），4.96（1H，d，J＝7.2 Hz，GlcⅡ H-1），6.42（1H，br s，Rha Ⅰ H-1），5.86（1H，br s，Rha Ⅱ H-1），6.31（1H，br s，Rha Ⅲ H-1）；13C-NMR（200 MHz，C5D5N）數(shù)據(jù)見表1和表2。化合物4的糖基部分碳譜數(shù)據(jù)與化合物2一致，通過HMBC譜分析進一步確認了其糖鏈結(jié)構(gòu)。與文獻[21]報道的化合物saponin Th的波譜數(shù)據(jù)進行對照，基本一致，從而確定了化合物4的結(jié)構(gòu)，即26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3β，17α，22α，26-四羥基-（25R）-呋甾-5-烯-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-（1→4）-α-L-吡喃鼠李糖基-（1→4）-[α-L-吡喃鼠李糖基-（1→2）]-β-D-吡喃葡萄糖苷。

表1 化合物1～7苷元部分的13C-NMR數(shù)據(jù)(200 MHz，C5D5N) Tab 1 13C-NMR data of the aglycones of compounds 1-7 (200 MHz，C5D5N)

化合物5：白色無定形粉末，Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)呈陽性，表明該化合物可能是皂苷類化合物。ESI-MS 顯示其準分子離子峰m/z1053 [M+Na]＋和1029 [M-H]-，提示其相對分子質(zhì)量為1030，結(jié)合NMR數(shù)據(jù)推斷其分子式為C50H78O22。1H-NMR譜（800 MHz，C5D5N）顯示3個單峰甲基氫信號δH0.96（H3-18），1.08（H3-19），2.00（H3-21）和1個雙峰甲基氫信號δH1.01（J＝6.4 Hz，H3-27），以及1個烯氫信號δH5.30（br s）。在13C-NMR譜（200 MHz，C5D5N）中觀察到對應(yīng)的4個甲基碳信號δC17.2，19.8，16.2，17.9和2個三取代烯碳信號δC121.9，141.4。此外，碳譜中尚存在2個四取代烯碳信號δC143.1，146.2；2個季碳信號δC37.5，43.9和2個羰基碳信 號δC206.2，211.0。在HMBC譜中，H-4（δH2.82）和H-7（δH1.77）與C-5（δC141.4）和C-6（δC121.9）均存在遠程相關(guān)信號；H3-18分別與C-12（δC36.5）、C-13（δC43.9）、C-14（δC50.9）和C-17（δC143.1）存在遠程相關(guān)信號；H3-21分別與C-17、C-20（δC146.2）和C-22（δC211.0）存在遠程相關(guān)信號；C-15（δC38.4）與C-14和C-16（δC206.2）存在遠程相關(guān)信號。這些HMBC相關(guān)表明在化合物5的苷元中，2個雙鍵分別位于5（6）和17（20）位，2個羰基分別位于16和22位。通過H2-26化學位移值差δHa-δHb＝3.98-3.62＝0.36＜0.48，可以確定C25為R構(gòu)型[14]。綜合以上分析，并與文獻對照[23]，推定化合物5的苷元為（25R）-膽甾-5，17（20）-二烯-16，22-二酮-3β，26-二醇。將化合物5按照與化合物1相同的方法酸水解后制備成單糖衍生物，通過GC分析表明化合物5的單糖組成為D-葡萄糖、L-鼠李糖和L-阿拉伯糖（2∶1∶1）。化合物5的糖基部分碳譜數(shù)據(jù)與化合物3一致，通過HMBC譜分析進一步確認了其糖鏈結(jié)構(gòu)。將化合物5的波譜數(shù)據(jù)與文獻[23]報道數(shù)據(jù)對照，確定化合物5為已知化合物26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3β，26-二羥基-（25R）-膽甾-5，17（20）-二烯-16，22-二酮-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖基-（1→4）-[α-L-吡喃鼠李糖基-（1→2）]-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物6：白色無定形粉末，Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)呈陽性，表明該化合物可能是皂苷類化合物。ESI-MS 顯示其準分子離子峰m/z1213 [M+Na]＋和1189 [M-H]-，提示其相對分子質(zhì)量為1190，結(jié)合NMR數(shù)據(jù)推斷其分子式為C57H90O26。在化合物6的1H-NMR譜（800 MHz，C5D5N）高場區(qū)δH0.97，1.07，2.00和1.01處可見歸屬于苷元部分的4個甲基信號，在δH5.31處可見1個烯氫寬單峰信號。在化合物6的13C-NMR譜（200 MHz，C5D5N）中，可見兩對烯碳信號分別位于δC121.9，141.4和143.1，146.2，2個羰基碳信號分別位于δC206.3和211.1。比較化合物6與化合物5苷元部分的碳信號，發(fā)現(xiàn)兩者基本一致，表明化合物6的苷元亦為（25R）-膽甾-5，17（20）-二烯-16，22-二酮-3β，26-二醇[23]。將化合物6按照與化合物1相同的方法酸水解及衍生，通過GC分析表明化合物6的單糖組成為D-葡萄糖和L-鼠李糖（2∶3）?；衔?的糖基部分碳譜數(shù)據(jù)與化合物2和化合物4一致，通過HMBC譜分析進一步確認了其糖鏈結(jié)構(gòu)。將化合物6的波譜數(shù)據(jù)與文獻[12]報道的化合物parispseudoside C進行比較，基本一致，從而確定了其結(jié)構(gòu)，即26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3β，26-二羥基-（25R）-膽甾-5，17（20）-二烯-16，22-二酮-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-（1→4）-α-L-吡喃鼠李糖基-（1→4）-[α-L-吡喃鼠李糖基-（1→2）]-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物7：白色無定形粉末，Liebermann-Burchard和Molish鑒定反應(yīng)呈陽性，表明該化合物可能屬于皂苷類。ESI-MS顯示其準分子離子峰m/z1213 [M+Na]＋和1189 [M-H]-，提示其相對分子質(zhì)量為1190，結(jié)合NMR數(shù)據(jù)推斷其分子式為C57H90O26，對應(yīng)于13個不飽和度?；衔?的NMR譜顯示有4個甲基氫信號δH1.48（s，H3-18），1.10（s，H3-19），1.87（s，H3-21），1.14（d，J＝6.4 Hz，H3-27）和對應(yīng)的碳信號δC16.2，19.9，9.1，17.7；1個烯氫信號δH5.38（br s），一組三取代烯烴碳信號δC122.2（C-6），141.5（C-5），一組四取代烯烴碳信號δC182.7（C-17），128.8（C-20）；1個羰基信號δC212.9（C-22）；3個連氧碳信號δC77.1（C-26），78.5（C-3）和83.5（C-16）。1H-NMR（800 MHz，C5D5N）和13C-NMR（200 MHz，C5D5N）中顯示有5個糖的端基氫信號：δH4.87（d，J＝8.0 Hz，GlcⅠ H-1），5.00（d，J＝7.2 Hz，GlcⅡ H-1），6.41（br s，Rha Ⅰ H-1），5.85（br s，Rha Ⅱ H-1）和6.30（br s，Rha Ⅲ H-1），以及對應(yīng)的端基碳信號δC105.8，100.9，102.8，102.8和103.8。比較化合物7和化合物6的NMR譜，發(fā)現(xiàn)化合物7的結(jié)構(gòu)中少了1個羰基和1個亞甲基，而多了1個連氧季碳（δC83.5）和1個次甲基（δH2.47，δC57.9），其他結(jié)構(gòu)基本一致?；衔?的分子中1個羰基、2個雙鍵和5個單糖基占了8個不飽和度，所剩下的5個不飽和度提示其苷元為五環(huán)結(jié)構(gòu)，因此，推測化合物7可能是化合物6的23，16-醇醛縮合產(chǎn)物。1H-1H COSY和HMBC譜可證實這一推測。在1H-1H COSY譜中，存在H-26a（δH4.06）/H-25（δH2.53）、H-26b（δH3.75）/H-25、H-25/H-24a（δH2.40）、H-25/H-24b（δH1.99）、H-25/H3-27（δH1.14）和H-24b/H-23（δH2.47）相關(guān)峰，結(jié)合H-25/C-23（δC57.9）的HMBC相關(guān)，表明化合物7中多出的次甲基位于C-23位。在HMBC譜中，H3-21與C-17、C-20和C-22，H-23與C-16和C-22，H2-24與C-16和C-22的遠程相關(guān)峰，表明化合物7苷元的E環(huán)為具有α，β-不飽和酮結(jié)構(gòu)的環(huán)戊烷，雙鍵位于17（20）位。在NOESY譜 中，H3-18/H-8、H-8/Hβ-15（δH2.00）和Hβ-15/H-23相關(guān)峰表明H-23為β構(gòu)型；Hβ-15/H-23的NOE相關(guān)亦提示OH-16為α構(gòu)型[12]。將化合物7按照化合物1相同的方法酸水解后制備成單糖衍生物，通過GC分析表明化合物7的糖基組成為D-葡萄糖和L-鼠李糖（2∶3）。通過2D NMR譜圖分析，進一步確定化合物7的苷元3位和26位所連接的糖鏈結(jié)構(gòu)與化合物6相同，糖基部分的13C-NMR數(shù)據(jù)見表2。對照文獻，化合物7的波譜數(shù)據(jù)與已知化合物ypsiyunnoside A一致[12]，從而確定了其結(jié)構(gòu)，即26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3β，16α，26-三羥基-（23R，25R）-16，23-環(huán)膽甾-5，17（20）-二烯-22-酮-3-Oα-L-吡喃鼠李糖基-（1→4）-α-L-吡喃鼠李糖基-（1→4）-[α-L-吡喃鼠李糖基-（1→2）]-β-D-吡喃葡萄糖苷。皂苷化合物7的苷元為6/6/6/5/5五環(huán)稠合膽甾烷骨架，生源途徑分析認為，可能是由parispseudoside C（皂苷化合物6）通過23，16-醇醛縮合而形成了皂苷化合物7中具有α，β-不飽和酮基團的環(huán)戊烷結(jié)構(gòu)（E環(huán)）。具有這一新穎骨架的皂苷僅分別從云南丫蕊花[12]和吉林延齡草[13]中各報道了1個，這是首次在重樓屬植物中發(fā)現(xiàn)。

表2 化合物1～7糖基部分的13C-NMR數(shù)據(jù)(200 MHz，C5D5N) Tab 2 13C-NMR data of the sugar moieties of compounds 1-7 (200 MHz，C5D5N)

4 結(jié)果與討論

中藥重樓的市場需求逐年增加，而重樓屬植物生長周期長，自然更替緩慢，致使重樓資源緊缺[24-25]。具柄重樓在陜西具有一定的資源分布，且在陜西多地與中藥重樓等效替用，但未見對其化學成分分離鑒定的報道[7-8]，因此，有必要開展其化學成分的研究工作，為其作為中藥重樓的替代基原植物提供科學依據(jù)。在預(yù)實驗中，通過TLC與對照品比較，發(fā)現(xiàn)具柄重樓總皂苷的一個部分（Fr.6）不含有常見的重樓皂苷成分（如重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ等），為了發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)較為新穎的甾體皂苷類成分，以闡釋具柄重樓化學成分的特征性，并希望能找到新結(jié)構(gòu)的活性成分，本文前期對Fr.6進行了較為系統(tǒng)的分離鑒定。所報道的7個甾體皂苷成分包括4個呋甾烷醇類和3個膽甾烷醇類皂苷，這是首次對具柄重樓開展的化學研究，所有化合物均為首次從該植物中發(fā)現(xiàn)。膽甾烷醇類皂苷屬于較為少見的甾體皂苷，在重樓屬植物中亦較少發(fā)現(xiàn)。膽甾烷醇類皂苷化合物7的苷元具有罕見的骨架結(jié)構(gòu)，具有這一新穎骨架的皂苷為首次從本屬植物中得到。雖然有文獻報道F環(huán)開環(huán)的甾體皂苷生物活性較弱或無[21，26]，但亦有研究發(fā)現(xiàn)呋甾烷醇類皂苷擁有潛在的抗腫瘤細胞增殖和抗炎等生物活性[27-29]，因此，值得對這些成分做進一步的活性篩選。此外，在對具柄重樓總皂苷其他部分的預(yù)實驗中，已發(fā)現(xiàn)含有較大量的已知重樓皂苷活性成分，亦可能含有新的活性成分，將進一步對這些部分開展化學和藥理活性研究，以明確具柄重樓治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)，為其開發(fā)和利用提供科學依據(jù)。