胡晉銘，湯海峰，陸云陽，劉楊，田韻遠(yuǎn)，樊培（空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系中藥與天然藥物學(xué)教研室，西安 710032）

中藥重樓（Paridis Rhizoma）為百合科植物云南重樓和七葉一枝花兩個(gè)品種的干燥根莖[1]。重樓屬植物在中國大陸地區(qū)分布有20個(gè)種，10余種變種，根據(jù)實(shí)地調(diào)查和查閱資料后發(fā)現(xiàn)，除少數(shù)稀有種外，幾乎所有品種均在實(shí)際市場流通中作為重樓使用。研究表明，重樓屬植物的主要有效成分為甾體皂苷，總稱為重樓皂苷，具有止血、抑菌、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和免疫調(diào)節(jié)等多種生理和藥理活性[2]，其中，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ和H等對(duì)肺癌、宮頸癌、肝癌等10余種癌癥的腫瘤細(xì)胞的生長有顯著抑制作用[3-6]。隨著市場對(duì)中藥重樓需求量的增加，大規(guī)模的采集使得野生藥材急劇減少，資源嚴(yán)重破壞。陜西省安康市北依秦嶺，南靠巴山，具有適宜的地理與氣候條件，是狹葉重樓（Paris polyphyllaSmithvar.stenophyllaFranch）的重要產(chǎn)區(qū)。目前關(guān)于狹葉重樓化學(xué)成分的研究報(bào)道有限，僅從四川產(chǎn)狹葉重樓中分離鑒定了5種已知的重樓皂苷[7]。為了明確狹葉重樓的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為其開發(fā)利用提供理論依據(jù)，本文對(duì)其根莖70%乙醇提取物的乙酸乙酯和正丁醇萃取部位開展了化學(xué)研究，共分離得到7個(gè)甾體皂苷1～7（見圖1）。其中化合物1為新化合物，屬于重樓屬植物中少見的膽甾烷醇型甾體皂苷，其苷元具有6/6/6/5/5五環(huán)稠合膽甾烷骨架，具有這一新穎骨架的環(huán)膽甾烷醇型甾體皂苷在天然界中較為罕見，亦是首次在本屬植物中發(fā)現(xiàn)；化合物4、6和7為首次從狹葉重樓中分離得到。

圖1 甾體皂苷1～7的結(jié)構(gòu)式Fig 1 Structures of steroidal saponins 1-7

1 材料

Quatrro質(zhì)譜儀（Waters公司）；Bruker AVANCE 800 型核磁共振波譜儀（Bruker公司）；Gilson 2050 高效液相色譜儀[配YMC-Pack R&D ODS-A半制備色譜柱（20 mm×250 mm，5 μm）]、ODS C18柱（Pharmacia公司）；Sephadex LH-20凝膠（GE公司）；薄層色譜用硅膠G、柱色譜硅膠（100～200目、200～300目，青島海洋化工廠）；電子天平（精度：0.0001 g，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；低溫冷卻循環(huán)泵（DLSB-40 型，陜西愛信儀器有限公司）；隔膜真空泵（V-100 型，瑞士 BUCHI 公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（N-1300 型）、電熱恒溫水浴鍋（OSB-2100 型）（上海愛朗儀器有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG-924OA 型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；色譜純甲醇、乙腈（天津科密歐公司）；氘代試劑（Merck 公司）；顯色劑（10%硫酸/乙醇）；其他試劑均為分析醇。

藥材于2020年8月采自陜西省安康市鎮(zhèn)坪縣，經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系中藥與天然藥物學(xué)教研室湯海峰教授鑒定為狹葉重樓（Paris polyphyllaSmithvar.stenophyllaFranch）的根莖，藥材標(biāo)本（編號(hào)：20200805）保存在該教研室標(biāo)本室。

2 提取與分離

狹葉重樓的干燥根莖1.9 kg，粉碎后用70%乙醇浸泡過夜，回流提取5次，每次2 h，減壓回收溶劑得到浸膏484.4 g。將浸膏加入6 L蒸餾水分散后，用等體積石油醚萃取3次脫脂，再先后用等體積乙酸乙酯和水飽和正丁醇分別萃取3次，減壓回收得乙酸乙酯部位6.85 g和正丁醇部位65.96 g。乙酸乙酯部位和正丁醇部位分別用硅膠柱色譜分離，用V二氯甲烷∶V甲醇∶V水（50∶1∶0～65∶35∶5）為洗脫劑梯度洗脫，合并后從乙酸乙酯部位得到6個(gè)部分（Fr.A～Fr.F），從正丁醇部位得到12個(gè)部分（Fr.1～Fr.12）。

Fr.E（1.97 g）經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜（洗脫劑為V甲醇∶V水＝4∶1）除去雜質(zhì)，再經(jīng)ODS C18柱色譜，V甲醇∶V水（2∶8～10∶0）為洗脫劑梯度洗脫，得到Fr.E-1～Fr.E-6。Fr.E-6通過半制備高效液相色譜分離純化（流速10 mL·min-1，檢測波長206 nm；以下均相同），48%乙腈洗脫得到化合物2（460.0 mg，tR＝19.5 min）和化合物3（20.3 mg，tR＝22.5 min）。Fr.5（2.57 g）經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜（洗脫劑為甲醇）除去雜質(zhì)，再經(jīng)ODS C18柱色譜分離，V甲醇∶V水（4∶6～10∶0）為洗脫劑梯度洗脫，得到Fr.5-1～Fr.5-7。Fr.5-5經(jīng)過半制備HPLC分離純化，40%乙腈洗脫得到化合物4（80.8 mg，tR＝24.0 min）。Fr.6（7.18 g）經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜（洗脫劑為甲醇）除去雜質(zhì)，再經(jīng)ODS C18柱色譜，V甲醇∶V水（2∶8～10∶0）為洗脫劑梯度洗脫，得到Fr.6-1-1～Fr.6-1-8。Fr.6-1-6經(jīng)半制備HPLC反復(fù)分離純化，40%乙腈洗脫得到化合物5（213.7 mg，tR＝24.1 min）。Fr.8（6.28 g）經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜（洗脫劑為V甲醇∶V水＝4∶1）除去雜質(zhì)，再經(jīng)ODS C18柱色譜，V甲醇∶V水（2∶8～10∶0）為洗脫劑梯度洗脫，得到Fr.8-1-1～Fr.8-1-4。Fr.8-1-3經(jīng)半制備HPLC反復(fù)分離純化，20%乙腈洗脫得到化合物1（5.1 mg，tR＝24.5 min）和化合物6（7.7 mg，tR＝28.5 min）。Fr.9（4.32 g）經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜（洗脫劑為V甲醇∶V水＝4∶1）除去雜質(zhì)，再經(jīng)ODS C18柱色譜，V甲醇∶V水（2∶8～10∶0）為洗脫劑梯度洗脫，得到Fr.9-1-1～Fr.9-1-6。Fr.9-1-5經(jīng)半制備HPLC反復(fù)分離純化，20%乙腈洗脫得到化合物7（3.6 mg，tR＝30.2 min）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色無定形粉末，[α]-116.5°（c0.05，MeOH），Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)均呈陽性，提示該化合物可能為皂苷類化合物。UV（MeOH）λmax（logε）238（3.09），198（2.76）nm；IR（KBr）νmax3430，2935，1702，1660，1450 cm-1，提示有α，β-不飽和酮結(jié)構(gòu)的存在。ESI-MS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z1053 [M+Na]＋和1029 [M-H]-；從HR-ESI-MS的準(zhǔn)分子離子峰m/z1029.4893 [M-H]-（C50H77O22，計(jì)算值為1029.4912），結(jié)合NMR數(shù)據(jù)，可推斷出其分子式為C50H78O22。

分析化合物1的13C-NMR和DEPT譜，發(fā)現(xiàn)其共有50個(gè)碳信號(hào)，其中27個(gè)碳信號(hào)歸屬于苷元部分。1H-NMR（800 MHz，C5D5N）顯示高場區(qū)有5個(gè)甲基氫信號(hào)δH1.86（s）、1.49（s）、1.15（d，J＝6.6 Hz）、1.81（d，J＝6.2 Hz）和1.11（s），分別與δC9.0、16.1、17.6、19.2和19.9信號(hào)相對(duì)應(yīng)。進(jìn)一步分析表明：化合物1的結(jié)構(gòu)中包含1個(gè)三取代雙鍵（δH5.36；δC122.1，δC141.4）、1個(gè)四取代雙鍵（δC128.7和182.6）、1個(gè)酮羰基（δC212.8）、3個(gè)季碳（δC37.7、44.5和83.4）。通 過2D-NMR（1H-1H COSY、HSQC、HMBC、TOCSY和NOESY）對(duì)苷元部分的碳?xì)湫盘?hào)進(jìn)行分析并歸屬，結(jié)果見表1。在HMBC譜中，H3-19（δH1.10）和C-5（δC141.4）有遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)，H-6（δH5.36）與C-4（δC39.4）、C-8（δC32.5）存在遠(yuǎn)程相關(guān)，同時(shí)H-6（δH5.36）與H-7（δH1.98）在1H-1H COSY譜中相關(guān)，表明三取代雙鍵為Δ5（6）。此外，HMBC譜顯示H3-27（δH1.15）與C-24（δC29.7）、C-25（δC32.3）和C-26（δC77.1）有遠(yuǎn)程相關(guān)，結(jié)合1H-1H COSY譜中H-23/H2-24、H2-24/H-25、H-25/H2-26和H-25/H3-27的相關(guān)信號(hào)，可證明側(cè)鏈的存在。在HMBC譜中可觀察到H-23（δH2.48）與C-16（δC83.4）、C-22（δC212.8）和C-25，以 及H3-21（δH1.86）與C-17（δC182.6）、C-20（δC128.7）和C-22的遠(yuǎn)程相關(guān)，說明苷元存在一個(gè)具有α，β-不飽和酮基的五元環(huán)并與上述側(cè)鏈相連。在NOESY譜中，H3-18（δH1.49）/H-8（δH1.71）、H-8/Hβ-15（δH2.00）和Hβ-15/H-23相關(guān)峰表明H-23是β構(gòu)型；Hβ-15/H-23的NOE相關(guān)亦提示OH-16為α構(gòu)型。通過H2-26化學(xué)位移值（δH4.07和3.75）的差值（ΔδH＝0.32＜0.48），可以確定25位碳為R構(gòu)型[8]?；衔?的苷元部分波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道的ypsiyunnoside A苷元部分基本一致，從而確定其苷元亦為3β，16α，26-三羥基-（23R，25R）-16，23-環(huán)膽甾烷醇-5，17（20）-二烯-22-酮。

取化合物1 1.0 mg用2 mL（2 mol·L-1）三氟乙酸水解，按文獻(xiàn)方法[10-11]，將所得單糖制備成三甲基硅醚化L-半胱氨酸衍生物，并用標(biāo)準(zhǔn)糖衍生物作對(duì)照，進(jìn)行GC分析，確定化合物1的糖基組成為D-葡萄糖（Glc）、L-鼠李糖（Rha）和L-阿拉伯糖（Ara），組成比為2∶1∶1。在13C-NMR譜中顯示4個(gè)糖的端基碳信號(hào)δC100.7、102.4、105.8和110.1，與1H-NMR譜中的端基氫信號(hào)δH4.99（d，J＝7.7 Hz，Glc Ⅰ）、6.33（br s，Rha）、4.88（d，J＝7.8 Hz，Glc Ⅱ）和5.96（d，J＝1.9 Hz，Ara）分別對(duì)應(yīng)。由Glc Ⅰ和Glc Ⅱ的端基氫偶合常數(shù)可知2個(gè)葡萄糖形成的苷鍵均為β構(gòu)型；根據(jù)Ara的端基氫偶合常數(shù)可以推斷呋喃阿拉伯糖的苷鍵構(gòu)型為α構(gòu)型；Rha的端基氫信號(hào)與其C-3（δC73.3）和C-5（δC70.0）信號(hào)在HMBC譜中強(qiáng)相關(guān)，可知其形成的苷鍵為α構(gòu)型。通過對(duì)2D-NMR解析，歸屬了4個(gè)糖基的碳?xì)湫盘?hào)（見表1）。在HMBC譜中，Glc Ⅰ H-1與苷元C-3（δC78.5）存在遠(yuǎn)程相關(guān)峰，說明Glc Ⅰ連接于苷元C-3位；Rha H-1與Glc Ⅰ C-2（δC77.9）的遠(yuǎn)程相關(guān)以及Ara H-1與Glc Ⅰ C-4（δC77.5）的遠(yuǎn)程相關(guān)表明Rha和Ara分別連接于Glc Ⅰ的C-2和C-4位；Glc Ⅱ與C-26的遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)表明Glc Ⅱ連接于苷元C-26位。NOESY譜的相關(guān)信號(hào)進(jìn)一步驗(yàn)證了上述糖鏈結(jié)構(gòu)（見圖2）。綜上所述，確定化合物1的結(jié)構(gòu)為26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3β，16α，26-三羥基-（23R，25R）-16，23-環(huán)膽甾烷醇-5，17（20）-二烯-22-酮-3-Oα-L-呋喃阿拉伯糖基-（1→4）-[α-L-吡喃鼠李糖基-（1→2）]-β-D-吡喃葡萄糖苷，經(jīng)SciFinder檢索，其為一新化合物。皂苷1的苷元為6/6/6/5/5五環(huán)稠合膽甾烷骨架，具有這一新穎骨架的皂苷僅在云南丫蕊花[9]和吉林延齡草[12]中各報(bào)道了1個(gè)，這是首次在重樓屬植物中發(fā)現(xiàn)。

表1 化合物1的1H-NMR (800 MHz)和13C-NMR (200 MHz)數(shù)據(jù)(in C5D5N) Tab 1 1H-NMR (800 MHz) and 13C-NMR (200 MHz) data of compound 1 (in C5D5N)

圖2 化合物1重要的HMBC和NOESY相關(guān)Fig 2 Key HMBC and NOESY correlations of compound 1

化合物2：白色無定形粉末，Liebermann-Burchard和Molish鑒定反應(yīng)均呈陽性，表明該化合物可能是皂苷類化合物。ESI-MS顯示其準(zhǔn)分子離子峰m/z893 [M+Na]＋和869 [M-H]-，提示其相對(duì)分子質(zhì)量為870，結(jié)合NMR數(shù)據(jù)推斷其分子式為C44H70O17。13C-NMR和DEPT譜分析表明，該化合物的44個(gè)碳信號(hào)中有27個(gè)歸屬于苷元部分。在化合物2的1H-NMR譜（800 MHz，C5D5N）高場區(qū)顯示有5個(gè)甲基氫信號(hào)δH1.26（d，J＝6.8 Hz），1.00（s），0.76（d，J＝4.7 Hz），1.75（d，J＝5.9 Hz）和1.11（s），與13C-NMR譜（200 MHz，C5D5N）中δC10.4、17.8、18.0、19.2和20.1信號(hào)分別對(duì)應(yīng)。化合物2的NMR譜中還存在3個(gè)季碳信號(hào)（δC37.7、45.7和90.8）、1個(gè)半縮醛碳特征信號(hào)（δC110.5）和1組三取代烯烴信號(hào)（δH5.36；δC141.4，122.5）。在HMBC譜中，H3-19（δH1.11）和C-5（δC141.4）有遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)，烯烴質(zhì)子δH5.36與C-8（δC33.0）之間的遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)，同時(shí)H-6（δH5.36）與H-7（δH1.95）在1H-1H COSY譜中相關(guān)，表明三取代雙鍵為Δ5（6）。通過2D-NMR分析歸屬了化合物2的碳信號(hào)（見表2）和氫信號(hào)，經(jīng)與文獻(xiàn)對(duì)照，確定其苷元是常見的偏諾皂苷元[13]。

按與化合物1相同的方法，對(duì)化合物2進(jìn)行酸水解及衍生，GC分析表明其糖基為L-Rha、L-Ara和D-Glc（1∶1∶1）。NMR譜中顯示3個(gè)糖的端基氫和端基碳信號(hào)[δH4.91（d，J＝7.2 Hz，Glc H-1），5.86（br s，Ara H-1），6.17（d，J＝5.7 Hz，Rha H-1）；δC100.6（Glc C-1），110.1（Ara C-1），102.4（Rha C-1）]。通過HMBC譜分析確定了糖的連接方式：Glc H-1與苷元C-3（δC78.7）的遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)表明Glc連接于C-3位，Rha H-1與Glc C-2（δC78.2）的遠(yuǎn)程相關(guān)以及Ara H-1與Glc C-4（δC77.8）的遠(yuǎn)程相關(guān)，表明Rha和Ara分別連接于Glc的2位和4位，與化合物1的3位糖鏈相同，核磁數(shù)據(jù)亦基本一致。將化合物2的波譜數(shù)據(jù)與重樓皂苷H[14]對(duì)照，基本一致，從而確定化合物2為重樓皂苷H。

化合物3：白色無定形粉末，Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)均呈陽性，表明該化合物可能是皂苷類化合物。ESI-MS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z761 [M+Na]＋和737 [M-H]-，提示其相對(duì)分子質(zhì)量為738，結(jié)合NMR數(shù)據(jù)推斷其分子式為C39H62O13。通過與化合物2對(duì)照，發(fā)現(xiàn)兩者苷元部分的NMR數(shù)據(jù)基本一致，如4個(gè)甲基信號(hào)[δH1.24（d，J＝6.6 Hz），0.97（s），0.69（d，J＝4.2 Hz）和1.10（s）；δC10.3、17.6、17.8和20.0]、3個(gè) 季碳信號(hào)（δC37.6、45.6和90.6）、1個(gè)半縮醛碳特征信號(hào)（δC110.3）和1組三取代烯烴信號(hào)（δH5.30；δC141.3，122.3）等，從而確定化合物3的苷元亦為偏諾皂苷元，且在苷元3位與糖連接成苷?；衔?的13C-NMR譜中，比化合物2少一組五碳糖信號(hào)，根據(jù)Glc C-4的化學(xué)位移值（δC72.3），推斷葡萄糖的C-4位未連接阿拉伯糖。

按與化合物1相同的方法，對(duì)化合物3進(jìn)行酸水解及衍生，經(jīng)GC分析表明其糖基為D-Glc和L-Rha（1∶1）。NMR譜中顯示2個(gè)糖的端基氫和端基碳信號(hào)[δH5.03（d，J＝7.2 Hz，Glc H-1），6.39（br s，Rha H-1）；δC100.8（Glc C-1），102.6（Rha C-1）]。通過HMBC譜分析確定了糖的連接方式：Glc H-1與C-3（δC78.4）的遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)表明Glc連接于苷元C-3位，Rha H-1與Glc C-2（δC78.3）的遠(yuǎn)程相關(guān)，表明Rha連接于Glc的2位。將化合物3的波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照[15]，基本一致，從而確定化合物3為重樓皂苷Ⅵ。

化合物4：白色無定形粉末，Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)均呈陽性，表明該化合物可能是皂苷類化合物。ESI-MS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z907 [M+Na]＋和883 [M-H]-，提示其相對(duì)分子質(zhì)量為884，結(jié)合NMR數(shù)據(jù)推斷其分子式為C45H72O17。通過與化合物3對(duì)照，發(fā)現(xiàn)兩者苷元部分的NMR數(shù)據(jù)基本一致，如4個(gè)甲基信號(hào)[δH1.25（d，J＝7.2 Hz），0.98（s），0.71（d，J＝5.8 Hz）和1.10（s）；δC10.4、17.7、17.9和20.0]、3個(gè)季碳信號(hào)（δC37.7、45.7和90.7）、1個(gè)半縮醛碳特征信號(hào)（δC110.4）和1組三取代烯烴信號(hào)[δH5.33（br d，J＝3.0 Hz）；δC141.3，122.4]等，從而確定化合物4的苷元亦為偏諾皂苷元，且在苷元3位與糖連接成苷。化合物4的13C-NMR譜中，比化合物3多出一組甲基五碳糖信號(hào)。

按與化合物1相同的方法，對(duì)化合物4進(jìn)行酸水解及衍生，經(jīng)GC分析表明其糖基為L-Rha和D-Glc（2∶1）。NMR譜中顯示3個(gè)糖的端基氫和端基碳信號(hào)[δH4.94（d，J＝7.0 Hz，Glc H-1），6.38（br s，Rha Ⅰ H-1），5.85（br s，Rha Ⅱ H-1）；δC100.8（Glc C-1），102.6（Rha Ⅰ C-1），103.4（Rha Ⅱ C-1）]。通過HMBC譜分析確定了糖的連接方式：Glc H-1與C-3（δC78.6）的遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)表明Glc連接于苷元C-3位，Rha Ⅰ H-1與Glc C-2（δC78.4）以 及Rha Ⅱ H-1與Glc C-4（δC79.1）的遠(yuǎn)程相關(guān)，表明Rha Ⅰ和Rha Ⅱ分別連接于Glc的2位和4位。將化合物4的波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照[16]，基本一致，從而確定化合物4為偏諾皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-（1→4）-[α-L-吡喃鼠李糖基-（1→2）]-β-D-吡喃葡萄糖苷，為首次從狹葉重樓中分離得到。

化合物5：白色無定形粉末，Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)均呈陽性，表明該化合物可能是皂苷類化合物。ESI-MS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z1069 [M+Na]＋和1045 [M-H]-，提示其相對(duì)分子質(zhì)量為1046，結(jié)合NMR數(shù)據(jù)推斷其分子式為C52H86O21。通過與化合物4對(duì)照，其苷元部分的NMR信號(hào)基本一致，可以確定化合物4的苷元亦為偏諾皂苷元?；衔?的13C-NMR譜中比化合物4多了一組甲基五碳糖信號(hào)，根據(jù)Rha Ⅱ C-4的化學(xué)位移值（δC81.0）提示該糖基與Rha Ⅱ 的C-4位相連接。通過2D-NMR分析歸屬了化合物5的所有碳?xì)湫盘?hào)，重要的1H-NMR（800 MHz，C5D5N）信號(hào)如下：δH0.99，1.11（each 3H，s），0.74（3H，d，J＝5.7 Hz），1.26（3H，d，J＝7.1 Hz），1.75（3H，d，J＝5.6 Hz，Rha Ⅰ H-6），1.55（3H，d，J＝5.9 Hz，Rha Ⅱ H-6），1.57（3H，d，J＝5.7 Hz，Rha Ⅲ H-6），3.86（1H，m，H-3），5.36（1H，br d，J＝3.0 Hz，H-6），4.94（1H，d，J＝7.1 Hz，Glc H-1），6.30（1H，s，Rha Ⅰ H-1），5.76（1H，s，Rha Ⅱ H-1），6.19（1H，s，Rha Ⅲ H-1）；13C-NMR數(shù)據(jù)見表2。

按與化合物1相同的方法，對(duì)化合物5進(jìn)行酸水解及衍生，經(jīng)GC分析表明其糖基為L-Rha和D-Glc（3∶1）。根據(jù)HMBC譜分析確定了其糖鏈的結(jié)構(gòu)：Glc H-1與C-3（δC78.9）的遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)表明Glc連接于苷元C-3位，Rha Ⅰ H-1與Glc C-2（δC78.9）以及Rha Ⅱ H-1與Glc C-4（δC78.6）的遠(yuǎn)程相關(guān)，表明Rha Ⅰ和Rha Ⅱ分別連接于Glc的2位和4位，Rha Ⅲ H-1與Rha Ⅱ C-4的相關(guān)信號(hào)表明Rha Ⅲ連接于Rha Ⅱ的4位。因此，確定了化合物5的結(jié)構(gòu)為重樓皂苷Ⅶ，波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[17]。

化合物6：白色無定形粉末，Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)均呈陽性，表明該化合物可能是皂苷類化合物。ESI-MS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z1073 [M+Na]＋和1049 [M-H]-，提示其相對(duì)分子質(zhì)量為1050，結(jié)合NMR數(shù)據(jù)推斷其分子式 為C50H82O23。在1H-NMR（800 MHz，C5D5N）高場區(qū)存在5個(gè)甲基氫信號(hào)δH1.40（d，J＝7.0 Hz），0.91（d，J＝6.2 Hz），1.02（s），1.79（d，J＝6.0 Hz）和1.10（s），與13C-NMR中的δC11.0，17.8，18.0，19.2和19.9信號(hào)對(duì)應(yīng)。NMR分析表明化合物6的結(jié)構(gòu)中存在3個(gè)季碳（δC37.6、45.7和91.3）、1個(gè)三取代雙鍵（δH5.30；δC141.3，δC122.4）和1個(gè)半縮醛季碳（δC110.1）。在HMBC譜中，H3-19（δH1.10）和C-5（δC141.3）的遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)，以及烯烴質(zhì)子與C-8（δC32.6）的遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)，同時(shí)H-6（δH5.30）與H-7（δH1.91）在1H-1H COSY譜中相關(guān)，表明三取代雙鍵為Δ5（6）。與化合物2對(duì)照，發(fā)現(xiàn)δC-26位移了＋8.4，說明F環(huán)開環(huán)，該化合物為3位和26位連糖的呋甾烷醇型甾體皂苷。通過H2-26化學(xué)位移值（δH3.97和3.64）的差值（ΔδH＝0.33＜0.48），可以確定25位碳為R構(gòu)型。

按與化合物1相同的方法，對(duì)化合物6進(jìn)行酸水解及衍生，經(jīng)GC分析表明其糖基為D-Glc、L-Ara和L-Rha（2∶1∶1）。NMR譜中顯示4個(gè)糖的端基氫和端基碳信號(hào)[δH4.96（d，J＝7.2 Hz，Glc Ⅰ H-1），4.84（d，J＝7.8 Hz，Glc Ⅱ H-1），5.94（d，J＝1.5 Hz，Ara H-1），6.30（d，J＝3.9 Hz，Rha H-1）；δC100.8（Glc Ⅰ C-1），105.4（Glc Ⅱ C-1），102.4（Rha C-1），110.1（Ara C-1）]。通過HMBC譜分析確定了糖的連接方式：Glc Ⅰ H-1與C-3（δC78.6）的遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)表明Glc Ⅰ連接于苷元C-3位，Glc Ⅱ H-1與C-26（δC75.8）的遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)表明Glc Ⅱ連接于苷元C-26位，Rha H-1與Glc Ⅰ C-2（δC77.9）以及Ara H-1與Glc Ⅰ C-4（δC77.6）的遠(yuǎn)程相關(guān)，表明Rha和Ara分別連接于Glc Ⅰ的2位和4位。與文獻(xiàn)[18]報(bào)道的化合物的波譜數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)照，基本一致，從而確定化合物6為26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-17，22-二羥基-（25R）-呋甾-5-烯-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖基-（1→4）-[α-L-吡喃鼠李糖基-（1→2）]-β-D-吡喃葡萄糖苷，為首次從狹葉重樓植物中得到。

化合物7：白色無定形粉末，Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)均呈陽性，表明該化合物可能是皂苷類化合物。ESI-MS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z1233 [M+Na]＋和1209 [M-H]-，提示其相對(duì)分子質(zhì)量為1210，結(jié)合NMR數(shù)據(jù)推斷其分子式為C57H94O27。通過與化合物6對(duì)照，發(fā)現(xiàn)兩者苷元部分的NMR數(shù)據(jù)一致，重要的1H-NMR（800 MHz，C5D5N）信號(hào)如下：δH1.02，1.10（each 3H，s），1.02（3H，d，J＝4.2 Hz），1.40（3H，d，J＝6.9 Hz），1.79（3H，d，J＝6.0 Hz，RhaⅠ H-6），1.61（3H，d，J＝6.0 Hz，Rha Ⅱ H-6），1.62（3H，d，J＝5.8 Hz，Rha Ⅲ H-6），3.86（1H，m，H-3），5.30（1H，br d，J＝4.2 Hz，H-6），4.96（1H，d，J＝6.4 Hz，GlcⅠH-1），4.84（1H，d，J＝7.8 Hz，Glc Ⅱ H-1），6.43（1H，s，RhaⅠH-1），5.87（1H，s，Rha Ⅱ H-1），6.32（1H，s，Rha Ⅲ H-1）；13C-NMR數(shù)據(jù)見表2。因此確定化合物7亦為雙糖鏈呋甾烷型甾體皂苷。

表2 化合物2～7的13C-NMR數(shù)據(jù)(200 MHz，in C5D5N) Tab 2 13C-NMR data of compounds 2-7 (200 MHz，in C5D5N)

按與化合物1相同的方法，對(duì)化合物7進(jìn)行酸水解及衍生，經(jīng)GC分析表明其糖基為D-Glc和L-Rha，組成比為2∶3。根據(jù)HMBC譜分析可確定苷元3位和26位的寡糖基分別為Rha Ⅲ-（1→4）-Rha Ⅱ-（1→4）-[Rha Ⅰ（1→2）]-Glc Ⅰ-和Glc Ⅱ-。對(duì)照文獻(xiàn)報(bào)道[19]，確定化合物7的結(jié)構(gòu)為26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-17，22-二羥基-（25R）-呋甾-5-烯-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-（1→4）-吡喃鼠李糖基-（1→4）-[α-L-吡喃鼠李糖基-（1→2）]-β-D-吡喃葡萄糖苷，為首次從狹葉重樓植物中分離得到。

4 結(jié)果與討論

中藥重樓的市場需求逐年增加，致使其資源緊缺，因此，除了少數(shù)稀有種外，幾乎所有重樓屬植物均在實(shí)際市面流通中作為中藥重樓使用。狹葉重樓與藥典收載的兩種重樓植物同為重樓（Parispolyphylla）的變種，亦在民間有大量應(yīng)用。鑒于此，有必要對(duì)其化學(xué)成分開展系統(tǒng)研究，為其作為中藥重樓的替代基源植物提供科學(xué)依據(jù)。本文所報(bào)道的7個(gè)甾體皂苷成分包括1個(gè)環(huán)膽甾烷醇型、4個(gè)異螺甾烷醇型和2個(gè)呋甾烷醇型皂苷，其中1個(gè)為新化合物、3個(gè)為首次從狹葉重樓中分離得到的化合物。膽甾烷醇型皂苷屬于較為少見的甾體皂苷，在重樓屬植物中亦較少發(fā)現(xiàn)，而膽甾烷醇型皂苷化合物1的骨架結(jié)構(gòu)更為罕見，具有這一新穎骨架的皂苷為首次從本屬植物中得到，從化學(xué)分類學(xué)角度可能具有一定意義。生源途徑分析認(rèn)為[9]，可能是由具有3β，26-二羥基-（25R）-膽甾-5，17（20）-二烯-16，22-二酮苷元的皂苷通過23，16-醇醛縮合而形成了化合物1中具有α，β-不飽和酮基團(tuán)的環(huán)戊烷結(jié)構(gòu)（E環(huán)），因此，有必要進(jìn)一步尋找該前體皂苷在狹葉重樓中是否存在。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[6，20-21]，以偏諾皂苷元為苷元的皂苷2～5對(duì)多種腫瘤細(xì)胞都具有顯著的抑制作用，本課題組進(jìn)行初步的活性篩選亦發(fā)現(xiàn)它們具有抗膠質(zhì)瘤活性，這說明民間使用狹葉重樓作為重樓藥材具有一定合理性，為陜產(chǎn)狹葉重樓作為中藥重樓的藥用資源補(bǔ)充提供了理論依據(jù)，值得對(duì)這些成分進(jìn)行進(jìn)一步的活性研究。此外，除本文中報(bào)道的化合物，狹葉重樓中還含有豐富的皂苷成分，亦可能含有新的活性成分，未來將對(duì)其開展進(jìn)一步的化學(xué)和藥理活性研究，以明確狹葉重樓治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)，為其合理開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。