李曉惠，任仙娥*，楊 鋒，黃永春，黃承都，張昆明，劉純友

（廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西高校糖資源加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 柳州 545006）

大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）是從低溫脫脂豆粕中除去碳水化合物和灰分等，得到的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于90%（干基）的全價(jià)蛋白。具有來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)，是一種應(yīng)用廣泛的食品基料。SPI具有良好的凝膠性、乳化性和持水性等功能特性，尤其凝膠性受到廣泛關(guān)注，利用這一特性可以改善豆腐、豆干和豆腐腦等傳統(tǒng)豆制品的感官和質(zhì)構(gòu)，將其應(yīng)用到火腿腸和香腸等肉制品中，能夠起到保水和穩(wěn)定脂肪的重要作用。

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（transglutaminase，TG）是一種細(xì)胞外催化轉(zhuǎn)移酶，可催化蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)的谷氨酰胺和賴氨酸殘基發(fā)生催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)、脫酰胺反應(yīng)和交聯(lián)聚合反應(yīng)。酶促反應(yīng)可使食品中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，改善凝膠性能，提高凝膠強(qiáng)度。酶促反應(yīng)條件溫和，還可以通過(guò)誘導(dǎo)含有互補(bǔ)限制性氨基酸結(jié)構(gòu)的異源蛋白間的交聯(lián)來(lái)生產(chǎn)具有更高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的蛋白產(chǎn)品。

空化技術(shù)作為新興的物理改性技術(shù)，受到了國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者的關(guān)注，主要方式為超聲空化和水力空化兩種。相比較于超聲空化，水力空化的能量利用率更高，產(chǎn)生的空化場(chǎng)更均勻，更具有工業(yè)化優(yōu)勢(shì)。在空化過(guò)程中空化泡的潰滅產(chǎn)生瞬時(shí)的局部高溫高壓，并伴隨著高速剪切力、強(qiáng)沖擊波、高速湍流等，可以促進(jìn)一些化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生。白銀等研究發(fā)現(xiàn)隨射流空化處理時(shí)間的延長(zhǎng)，SPI溶解性、乳化性、持油性以及表面疏水性均顯著提高。Li等研究發(fā)現(xiàn)水力空化處理可以使?jié)饪s乳蛋白的流變性質(zhì)得到改善，降低濃縮乳蛋白的黏度，提高乳粉噴霧干燥的效率。Meletharayil等研究發(fā)現(xiàn)水力空化可改善希臘酸奶的流變特性和微觀結(jié)構(gòu)。課題組前期研究結(jié)果表明，水力空化處理能改變SPI的理化和結(jié)構(gòu)性質(zhì)，如溶解性增加、表面疏水性增加，還會(huì)改變其二級(jí)結(jié)構(gòu)。這些理化和結(jié)構(gòu)性質(zhì)的改變可能會(huì)使其凝膠行為發(fā)生改變，但是關(guān)于水力空化對(duì)蛋白質(zhì)凝膠行為的影響研究還鮮有報(bào)道?；诖耍緦?shí)驗(yàn)采用基于渦流的水力空化來(lái)處理SPI，再在TG的催化作用下制備凝膠，分析SPI經(jīng)水力空化處理后其酶促凝膠行為的變化規(guī)律和機(jī)理，為有效調(diào)控大豆蛋白凝膠制品的品質(zhì)提供理論依據(jù)，同時(shí)為將水力空化應(yīng)用到食品工業(yè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPI（蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥90%） 山東禹王生態(tài)食品有限公司；TG（酶活力為100 U/g） 江蘇泰興市東圣生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JXN-26冷凍高速離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特股份有限公司；DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器 河南予華儀器有限公司；MCR 72流變儀 奧地利Anton Paar有限公司；GSL-1010全自動(dòng)激光顆粒分布測(cè)量?jī)x 遼寧儀表研究所有有限責(zé)任公司；TA-XT plus質(zhì)構(gòu)分析儀 英國(guó)Stable Micro System公司；UV-2600紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 島津儀器（蘇州）有限公司；AE2204電子分析天平 湘儀天平儀器設(shè)備有限公司；HY-4調(diào)速振蕩器長(zhǎng)沙創(chuàng)滿電子科技有限公司；AlpHal-4LDpus真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)CHRIST公司；Phenom ProX掃描電子顯微鏡上海復(fù)納科學(xué)儀器有限公司；iS10紅外光譜儀 美國(guó)尼力高儀器公司；水力（渦流）空化裝置 實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 方法

1.3.1 水力空化處理SPI

用去離子水配制質(zhì)量濃度分別為60、80、100 g/L的SPI分散液，磁力攪拌2 h使其充分溶解。將不同質(zhì)量濃度的SPI分散液倒入水力（渦流）空化裝置的分散液貯箱中，開(kāi)啟冷凝水，控制整個(gè)處理過(guò)程中SPI分散液的溫度不超過(guò)40 ℃，開(kāi)啟渦流泵，調(diào)節(jié)壓力為0.4 MPa，分別處理10、20、30、60 min后取樣測(cè)定其粒徑、黏度并進(jìn)行酶促凝膠制備。

1.3.2 SPI分散液粒徑的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[13]的方法，使用GSL-1010全自動(dòng)激光顆粒分布測(cè)量?jī)x測(cè)定SPI樣品的粒徑。SPI樣品的折射率和吸收參數(shù)分別為1.450和0.001。將SPI樣品加入去離子水中，調(diào)整遮光率為20%～25%，測(cè)量樣品的粒徑分布情況和體積平均粒徑（）。

1.3.3 SPI分散液黏度的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[14]的方法，使用MCR 72流變儀進(jìn)行SPI黏度的測(cè)定，選擇直徑50 mm的平板進(jìn)行SPI樣品剪切速率掃描。設(shè)定剪切速率范圍為10～1 000 s，記錄黏度隨剪切速率的變化情況。

1.3.4 酶促凝膠的制備

參考文獻(xiàn)[15]的方法向1.3.1節(jié)制得的樣品以及未經(jīng)過(guò)水力空化處理的SPI樣品中加入TG（添加量為3 g/L），于37 ℃水浴中保溫2 h后，取出置于4 ℃冰箱中，靜置8～12 h，測(cè)定樣品的凝膠性質(zhì)。

1.3.5 凝膠強(qiáng)度的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[16]的方法，使用質(zhì)構(gòu)分析儀對(duì)1.3.4節(jié)制得的凝膠樣品進(jìn)行凝膠強(qiáng)度的測(cè)定。使用P/0.5探頭，設(shè)定測(cè)前速度為5 mm/s，穿刺和測(cè)后速度為1 mm/s，壓縮距離為10 mm，觸發(fā)力為5.0 g。凝膠強(qiáng)度為下壓至10 mm時(shí)的最大力。

1.3.6 凝膠持水性的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[17]的測(cè)定方法，分別準(zhǔn)確稱取5 g 1.3.4節(jié)制得的凝膠樣品于離心管中，記錄離心管和凝膠樣品的總質(zhì)量，8 000 r/min離心20 min，取出離心管，將其倒置使水分排干，用濾紙擦干離心管內(nèi)外的殘留液體，記錄此時(shí)的總質(zhì)量，按下式計(jì)算持水性。

1.3.7 凝膠形成過(guò)程的流變學(xué)特性測(cè)定

參考文獻(xiàn)[18]的方法并稍作修改。使用流變儀進(jìn)行模擬凝膠形成實(shí)驗(yàn)，選擇直徑為50 mm的平板，設(shè)置間隙為1 mm，應(yīng)變?yōu)?.5%，角頻率為1 Hz。平板間充滿樣品后刮去多余的樣品，為了防止水分蒸發(fā)，在樣品周圍滴2～3 滴植物油。實(shí)驗(yàn)中的溫度掃描由加熱階段、恒溫階段和降溫階段組成，即由2 ℃/min的速率從25 ℃升溫至37 ℃并保溫2 h，再以2 ℃/min的速率從37 ℃降溫至25 ℃，測(cè)定儲(chǔ)能模量（′）和損耗模量（″）隨溫度和時(shí)間的變化。

1.3.8 凝膠分子間作用力的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[19-20]的方法，通過(guò)不同溶劑破壞SPI凝膠形成過(guò)程中的分子作用力，NaCl溶液（0.6 mol/L）可破壞離子鍵，低濃度（1.5 mol/L）尿素可破壞氫鍵，高濃度（8 mol/L）尿素可破壞疏水相互作用，而-巰基乙醇（0.5 mol/L）會(huì)破壞二硫鍵。將1.3.4節(jié)制得的凝膠樣品用大蒜壓制器壓碎后，采用逐級(jí)溶解法測(cè)定4種不同溶劑（S1：0.6 mol/L NaCl；S2：1.5 mol/L尿素＋0.6 mol/L NaCl；S3：8 mol/L尿素＋0.6 mol/L NaCl；S4：0.5 mol/L-巰基乙醇＋8 mol/L尿素＋0.6 mol/L NaCl）中溶解的凝膠的蛋白質(zhì)含量，分別以溶解于S1～S4的蛋白質(zhì)含量占總蛋白質(zhì)含量的比例來(lái)表征凝膠中離子鍵、氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵的相對(duì)含量，經(jīng)S4提取后最終所得沉淀的蛋白質(zhì)含量占總蛋白質(zhì)含量的比例表示非二硫共價(jià)鍵的相對(duì)含量。具體操作步驟和計(jì)算方法參考文獻(xiàn)[12]。

1.3.9 掃描電子顯微鏡觀察

參考文獻(xiàn)[21]的方法，將1.3.4節(jié)制得的80 g/L SPI酶促凝膠樣品冷凍干燥后進(jìn)行噴金，電壓為10 kV，用Phenom ProX掃描電子顯微鏡進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)觀察。

1.3.10 傅里葉變換紅外光譜分析

參考文獻(xiàn)[22]的方法，將1.3.4節(jié)制得的80 g/L SPI凝膠樣品冷凍干燥，與KBr粉末混合研磨，將混合粉末壓制成薄片，使用紅外光譜儀進(jìn)行全波段掃描，設(shè)置分辨率為4 cm，掃描次數(shù)32 次，測(cè)量范圍為4 000～400 cm。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 26軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析確定統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，采用Duncan多重比較進(jìn)行顯著性分析，＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 水力空化對(duì)SPI粒徑的影響

水力空化對(duì)不同質(zhì)量濃度SPI分散液粒徑分布的影響如圖1所示，未經(jīng)水力空化處理的SPI樣品顯示出相對(duì)較寬的粒徑分布范圍，且具有更多更大尺寸的粒子。經(jīng)過(guò)水力空化處理后的SPI粒徑分布明顯變窄，且分布峰向較小粒徑方向移動(dòng)較大。由圖2可知，水力空化處理使SPI的體積平均粒徑顯著降低（＜0.05），并且在處理30 min內(nèi)，平均粒徑隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷降低。這說(shuō)明空化過(guò)程中產(chǎn)生的剪切力或沖擊波等空化效應(yīng)能破壞蛋白分子間的相互作用，使大的聚集體解聚，粒徑降低。但是當(dāng)處理時(shí)間延長(zhǎng)至60 min后，粒徑又有所增加，這可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間空化處理促進(jìn)蛋白發(fā)生了聚合。胡昊采用超聲波處理SPI時(shí)也觀察到類似現(xiàn)象。

圖1 水力空化對(duì)SPI分散液粒徑分布的影響Fig.1 Effect of HC on particle size distribution of SPI

圖2 水力空化對(duì)SPI粒徑的影響Fig.2 Effect of HC on particle sizes of SPI

2.2 水力空化對(duì)SPI分散液黏度的影響

由圖3可知，在10～1 000 s的剪切范圍內(nèi)，所有樣品的黏度都隨著剪切速率的增加而不斷降低，表現(xiàn)出典型剪切變稀的非牛頓流體特征。在相同剪切速率下，經(jīng)水力空化處理后的SPI黏度均比未處理的低，并且在空化處理30 min內(nèi)，黏度隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，這主要是因?yàn)榭栈^(guò)程中產(chǎn)生的局部高溫、高壓、剪切或沖擊波等空化效應(yīng)使SPI中的聚集體解聚，粒徑降低，黏度減小。當(dāng)空化處理時(shí)間延長(zhǎng)至60 min后，SPI的黏度又有所增加，這可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的空化處理引起了蛋白顆粒的重新聚集，使其粒徑增大，黏度增加。劉冉等使用超聲波處理SPI分散液時(shí)也發(fā)現(xiàn)超聲波能使SPI粒徑減小，黏度降低，但是SPI黏度并沒(méi)有隨著超聲功率的增加而一直降低，當(dāng)使用較大功率（400、600 W）處理時(shí)SPI重聚集，黏度反而增大。

圖3 水力空化對(duì)SPI分散液黏度的影響Fig.3 Effect of HC on the viscosity of SPI dispersion

2.3 水力空化對(duì)SPI酶促凝膠強(qiáng)度的影響

水力空化處理對(duì)不同質(zhì)量濃度SPI酶促凝膠強(qiáng)度的影響如圖4所示。在相同處理時(shí)間下，凝膠強(qiáng)度隨著SPI質(zhì)量濃度的增加而顯著增強(qiáng)（＜0.05），這與臧學(xué)麗等的研究結(jié)果一致。這是因?yàn)殡S著蛋白質(zhì)量濃度增加，SPI與TG作用的機(jī)率增加，更多的SPI分子在TG的作用下發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)了凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成。另外，蛋白質(zhì)量濃度的增加也促進(jìn)了蛋白分子之間的相互作用，也有利于凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成。由圖4可知，水力空化處理能增加SPI酶促凝膠的強(qiáng)度。這是因?yàn)橐环矫?，SPI經(jīng)水力空化處理后黏度下降，TG能更好地分散到SPI分散液中，有利于TG與蛋白分子的充分接觸，促進(jìn)蛋白分子中賴氨酸殘基和谷氨酰胺殘基交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生；另一方面，前期研究結(jié)果表明，SPI經(jīng)水力空化處理后粒徑減小，溶解性增大，表面疏水性增加，蛋白分子的結(jié)構(gòu)變得更加松散，這就使得原本埋藏在分子內(nèi)部的賴氨酸殘基和谷氨酰胺殘基暴露出來(lái)，增加了TG的作用位點(diǎn)，二者在TG的作用下發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，形成了蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。Hu Hao等研究發(fā)現(xiàn)SPI經(jīng)超聲處理后，其粒徑減小、表面疏水性和游離巰基含量增加，形成的凝膠強(qiáng)度明顯增加。另外，當(dāng)水力空化處理時(shí)間延長(zhǎng)至60 min時(shí)，SPI所形成的凝膠強(qiáng)度相比30 min有所降低，這可能是過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的處理使得SPI重聚集，分散液的黏度又開(kāi)始增大引起的。

圖4 水力空化對(duì)SPI酶促凝膠強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of HC on gel strength of transglutaminase-catalyzed SPI gel

2.4 水力空化對(duì)SPI酶促凝膠持水性的影響

由圖5可知，未經(jīng)水力空化處理的SPI形成的酶促凝膠持水性隨SPI質(zhì)量濃度的增加而增加，當(dāng)SPI質(zhì)量濃度分別為60、80、100 g/L時(shí)，凝膠的持水性分別為（42.15±0.87）%、（58.49±1.39）%、（70.26±1.21）%，表現(xiàn)為凝膠經(jīng)離心后均有不同量的水滲出。水力空化處理使SPI酶促凝膠的持水性顯著增加（＜0.05）。經(jīng)水力空化處理20 min后的SPI酶促凝膠經(jīng)離心后基本沒(méi)有水滲出，持水性接近100%。這可能是因?yàn)榻?jīng)過(guò)水力空化處理后的SPI形成的酶促凝膠強(qiáng)度增加，空間結(jié)構(gòu)更加致密、均一，能將水分子更好地束縛在凝膠內(nèi)部。Zhang Peipei等也發(fā)現(xiàn)超聲空化可以提高SPI酶促凝膠的持水性，超聲空化可以有助于形成更均勻、更致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)，可以緊密結(jié)合更多的水，因此導(dǎo)致持水性增加。

圖5 水力空化對(duì)SPI酶促凝膠持水性的影響Fig.5 Effect of HC on water-holding capacity of transglutaminasecatalyzed SPI gel

2.5 水力空化對(duì)SPI酶促凝膠流變學(xué)性質(zhì)的影響

儲(chǔ)能模量（’）又稱為彈性模量，代表黏彈行為的彈性部分，描述的是樣品的固態(tài)特性；損耗模量（”）又稱黏性模量，代表黏彈行為的黏性部分，描述的是樣品的液態(tài)特性。’＞G”說(shuō)明樣品表現(xiàn)出黏彈性固體的特性，’＜”則說(shuō)明樣品表現(xiàn)黏彈性流體的特性。SPI質(zhì)量濃度為60 g/L時(shí)的凝膠曲線如圖6A所示。未經(jīng)水力空化處理和經(jīng)水力空化處理10 min的SPI在整個(gè)過(guò)程中，’一直小于”，表現(xiàn)出黏彈性流體的特性，說(shuō)明凝膠未形成。經(jīng)空化處理20、30、60 min的SPI分別在7 603、4 615、4 399 s時(shí)’＝”，說(shuō)明凝膠網(wǎng)絡(luò)開(kāi)始形成，之后’和”繼續(xù)增加，表明凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在加強(qiáng)，整個(gè)過(guò)程結(jié)束后，最終形成凝膠的’分別達(dá)到2.81、11.52、7.12 Pa。SPI質(zhì)量濃度為80 g/L和100 g/L的凝膠曲線分別如圖6B、C所示，這兩個(gè)質(zhì)量濃度下未處理的SPI由于黏度大，一開(kāi)始’就大于”，表現(xiàn)出黏彈性固體的特性，但是在整個(gè)過(guò)程中，’和”都沒(méi)有隨著溫度的變化和時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯增加。80 g/L的SPI經(jīng)水力空化處理不同時(shí)間后，黏度降低，一開(kāi)始’＜”，表現(xiàn)出黏彈性液體的特性，在升溫和保溫過(guò)程中’和”一直隨著溫度的變化和時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，經(jīng)空化處理10、20、30、60 min的SPI分別在6 847、2 383、727.5、871.5 s時(shí)’＝”，說(shuō)明凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)開(kāi)始形成，此后’和”繼續(xù)增加，在整個(gè)過(guò)程結(jié)束后，最終形成的凝膠的’值分別為24.76、82.28、1 384.70、726.23 Pa，其中經(jīng)水力空化處理30 min的SPI形成凝膠的’值高于未處理的’值。100 g/L的SPI經(jīng)水力空化處理后凝膠形成過(guò)程中的流變學(xué)性質(zhì)與80 g/L的類似，經(jīng)空化處理10、20、30、60 min的SPI分別在1 592、1 543、205.5、439.5 s時(shí)’＝”，最終形成的凝膠的’值分別為96.14、128.90、14 304.00、3 394.90 Pa，其中經(jīng)水力空化處理30 min和60 min的SPI形成凝膠的’值均高于未處理的’值。由此可見(jiàn)，SPI經(jīng)水力空化處理后的成膠的蛋白質(zhì)量濃度降低，成膠時(shí)間隨著蛋白質(zhì)量濃度的增加而提前，并且各個(gè)質(zhì)量濃度的SPI經(jīng)水力空化處理30 min后，所形成凝膠的’相比未處理的均明顯增加。Shen Xue等研究發(fā)現(xiàn)相對(duì)未處理樣品，超聲處理（20 KHz，20 min）的乳清蛋白在流變模擬凝膠形成過(guò)程中’和”顯著增大。Gregersen等的研究結(jié)果表明，超聲處理牛奶后導(dǎo)致開(kāi)始形成酸促凝膠時(shí)間顯著縮短，還引起最終’的顯著增大。

圖6 水力空化對(duì)SPI酶促凝膠G’和G”的影響Fig.6 Effect of HC on G’ and G” of transglutaminase-catalyzed SPI gel

此外，需要說(shuō)明的是，流變學(xué)測(cè)試結(jié)果與凝膠強(qiáng)度結(jié)果基本一致，但不是一一對(duì)應(yīng)的，如80 g/L的SPI經(jīng)水力空化處理20 min和60 min后的凝膠強(qiáng)度顯著高于未處理組（＜0.05），但是其’值卻小于未處理組。這可能是在測(cè)定流變特性和凝膠強(qiáng)度時(shí)施加在樣品上的力的類型不同造成的?！凳峭ㄟ^(guò)流變儀在保證形變的線性范圍內(nèi)給予蛋白質(zhì)樣品的剪切壓力，它對(duì)樣品的結(jié)構(gòu)沒(méi)有破壞。而凝膠強(qiáng)度是使用測(cè)試儀的探針對(duì)樣品進(jìn)行的穿刺破壞性測(cè)試，它涉及探針與樣品之間的壓縮力和剪切力，還與蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)中的填充物有關(guān)，因此’并不總是代表凝膠強(qiáng)度。

2.6 水力空化對(duì)SPI酶促凝膠分子間作用力的影響

由于水力空化對(duì)60、80、100 g/L SPI形成的酶促凝膠的強(qiáng)度、持水性和流變特性的影響趨勢(shì)大致相同，因此選取了中間質(zhì)量濃度80 g/L的SPI酶促凝膠來(lái)繼續(xù)研究凝膠的分子間作用力、微觀結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，從而探討水力空化對(duì)SPI酶促凝膠行為的影響機(jī)制。由表1可知，未經(jīng)空化處理的SPI形成的酶促凝膠中分子間作用力以非二硫共價(jià)鍵和離子鍵為主，疏水相互作用和二硫鍵次之，氫鍵所占比例較小。經(jīng)過(guò)空化處理后的SPI形成的酶促凝膠中，二硫鍵和非二硫共價(jià)鍵相對(duì)含量顯著增加（＜0.05），成為凝膠形成的主要分子間作用力，而離子鍵、氫鍵和疏水相互作用相對(duì)含量均顯著降低（＜0.05）。前期研究結(jié)果表明，SPI經(jīng)水力空化處理后粒徑減小，溶解性增大，表面疏水性增加，蛋白分子的結(jié)構(gòu)變得更加松散，這就使得更多的賴氨酸殘基和谷氨酰胺殘基暴露出來(lái)，二者在TG的作用下交聯(lián)形成-(-谷氨酰基)-賴氨酸共價(jià)結(jié)合鍵，使凝膠中非二硫共價(jià)鍵的相對(duì)含量增加，有利于凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。此外，前期研究結(jié)果還表明，水力空化處理能使SPI中的二硫鍵斷裂，蛋白分子結(jié)構(gòu)展開(kāi)，游離巰基含量增多，這就導(dǎo)致在TG誘導(dǎo)蛋白分子交聯(lián)形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的同時(shí)，巰基互相靠近再形成二硫鍵，使凝膠中二硫鍵的相對(duì)含量增加，進(jìn)一步促進(jìn)凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成。金楊等研究發(fā)現(xiàn)隨著凝固溫度的升高，填充豆腐的二硫鍵相對(duì)含量增多，與填充豆腐的硬度和彈性顯著正相關(guān)。Jia Dan等研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)添加TG，鯉魚(yú)肌動(dòng)球蛋白凝膠中非二硫鍵含量大大提高，凝膠強(qiáng)度、持水性及’顯著增大。結(jié)合前面凝膠強(qiáng)度和持水性的結(jié)果來(lái)看，經(jīng)水力空化處理后的SPI形成的酶促凝膠強(qiáng)度和持水性增加，這與凝膠中二硫鍵和非二硫共價(jià)鍵相對(duì)含量的增加有關(guān)。

表1 水力空化對(duì)80 g/L SPI酶促凝膠分子間作用力的影響Table 1 Effect of HC on intermolecular forces of transglutaminasecatalyzed gel from 80 g/L SPI

2.7 水力空化對(duì)SPI酶促凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

采用電子掃描顯微鏡放大300 倍觀察80 g/L的SPI在水力空化處理前后所形成的酶促凝膠微觀結(jié)構(gòu)的變化。如圖7所示，經(jīng)過(guò)水力空化處理后的SPI形成的凝膠微觀結(jié)構(gòu)與未處理組有明顯差異。未處理的SPI形成了松散、孔洞大小不一、無(wú)規(guī)則的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，經(jīng)水力空化處理20 min后的SPI形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相對(duì)緊湊，經(jīng)水力空化30 min和60 min后形成的SPI凝膠網(wǎng)絡(luò)，結(jié)構(gòu)變得更加致密、孔洞較小而且均勻。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是由于水力空化顯著降低了蛋白粒徑，增加了暴露于蛋白表面的活性基團(tuán)，促進(jìn)TG交聯(lián)反應(yīng)形成更加均勻致密的凝膠結(jié)構(gòu)。致密均勻的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加有利于水分的截留，提高持水性，這與前面持水性的研究結(jié)果一致。Zhang Peipei等發(fā)現(xiàn)通過(guò)高強(qiáng)度超聲空化處理SPI形成的TG酶促凝膠的微觀結(jié)構(gòu)變得致密、均勻，并顯著提高了SPI酶促凝膠的凝膠強(qiáng)度、保水能力。

圖7 水力空化對(duì)80 g/L SPI酶促凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.7 Effect of HC on microstructure of transglutaminase-catalyzed gel from 80 g/L SPI

2.8 水力空化對(duì)SPI酶促凝膠二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

SPI酶促凝膠樣品在4 000～400 cm范圍內(nèi)的傅里葉變換紅外光譜如圖8所示。SPI酶促凝膠的酰胺I帶二階導(dǎo)數(shù)光譜圖如圖9所示。采用Omnic 8.3和 Peakfit 4.12 軟件進(jìn)行分析，包括在酰胺I帶（1 700～1 600 cm）范圍內(nèi)進(jìn)行兩點(diǎn)基線校正、平滑處理、去卷積、作二階導(dǎo)數(shù)，同時(shí)采用Gaussian法進(jìn)行多次曲線擬合，最后將擬合出的子峰歸屬給蛋白的4種二級(jí)結(jié)構(gòu)，并通過(guò)計(jì)算各子峰面積百分比推導(dǎo)蛋白樣品的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成。各子峰與二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)關(guān)系：1 600～1 640cm為-折疊，1 650～1 660 cm為-螺旋，1 640～1 650 cm為無(wú)規(guī)卷曲，1 660～1 700 cm為-轉(zhuǎn)角。不同處理80 g/L SPI酶促凝膠二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量如表2所示。

圖8 80 g/L SPI酶促凝膠的傅里葉變換紅外光譜Fig.8 Fourier transform infrared spectra of transglutaminasecatalyzed gel from 80 g/L SPI

圖9 80 g/L SPI酶促凝膠的酰胺I帶二階導(dǎo)數(shù)光譜圖Fig.9 Second-derivative amide I spectra of transglutaminase-catalyzed gel from 80 g/L SPI

表2 水力空化對(duì)80 g/L SPI酶促凝膠二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Table 2 Effect of HC on secondary structure of transglutaminasecatalyzed gel from 80 g/L SPI

由表2可知，經(jīng)過(guò)水力空化處理后的SPI酶促凝膠二級(jí)結(jié)構(gòu)中的各個(gè)組成的含量發(fā)生明顯變化。與未處理的樣品相比，經(jīng)過(guò)水力空化處理后的SPI酶促凝膠-折疊、-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)相對(duì)含量顯著增加，-螺旋、無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對(duì)含量顯著降低，表明-螺旋、無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化成-折疊、-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。-螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)含量減少一般伴隨著氫鍵相對(duì)含量的降低，-折疊相對(duì)含量升高表明蛋白質(zhì)疏水相互作用降低，這與前文分子間作用力測(cè)定結(jié)果一致。無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量的降低，說(shuō)明凝膠二級(jí)結(jié)構(gòu)從無(wú)序向有序轉(zhuǎn)變，這與凝膠的微觀結(jié)構(gòu)結(jié)果相印證。Herrero等研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)-折疊和-轉(zhuǎn)角的相對(duì)含量與形成的凝膠強(qiáng)度顯著正相關(guān)，可見(jiàn)經(jīng)水力空化處理后的SPI酶促凝膠強(qiáng)度的增加還與凝膠二級(jí)結(jié)構(gòu)中-折疊和-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量的增加有關(guān)。

3 結(jié) 論

SPI經(jīng)水力空化處理后形成的酶促凝膠微觀結(jié)構(gòu)更加致密均勻；二級(jí)結(jié)構(gòu)中-螺旋、無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量降低，-折疊、-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量增加；凝膠形成過(guò)程中的分子間作用力也發(fā)生變化，二硫鍵和非二硫共價(jià)鍵的相對(duì)含量增加，成為凝膠形成的主要分子間作用力，而離子鍵、氫鍵相對(duì)含量和疏水相互作用均降低。這些凝膠結(jié)構(gòu)和分子間作用力的變化，使得經(jīng)水力空化處理后的SPI形成的酶促凝膠持水性、凝膠強(qiáng)度和最終的’增大，其中以處理30 min后形成的酶促凝膠最大。結(jié)果表明，一定時(shí)間的水力空化處理可以改善SPI酶促凝膠的性能，可為預(yù)測(cè)和控制大豆蛋白凝膠的性能和工藝優(yōu)化提供理論指導(dǎo)。