袁 禛，程述震，吳 迪，林澤鑫，杜 明,*

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué)，海洋食品精深加工省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

隨著生活水平的日益提高，人們飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，各個國家痛風(fēng)發(fā)病率也明顯升高，痛風(fēng)已成為我國僅次于糖尿病的第二大代謝類疾病。Chen Yuzhu等統(tǒng)計表明，我國痛風(fēng)患病率農(nóng)村高于城市，沿海高于內(nèi)陸，但內(nèi)陸高寒地區(qū)高于其他地區(qū)。據(jù)報道，我國男性痛風(fēng)的發(fā)病率高于女性，男性30歲和女性50歲是發(fā)病的危險年齡。痛風(fēng)是由于嘌呤類物質(zhì)代謝增加或尿酸排泄異常引起的一種反復(fù)發(fā)作的炎癥性疾病。痛風(fēng)與高尿酸血癥是同一疾病的不同病程時期，高尿酸血癥是一個先決條件，臨床上，男性血尿酸水平大于7.0 mg/dL、女性血尿酸水平大于6.0 mg/dL即可確診為高尿酸血癥。高尿酸血癥是痛風(fēng)發(fā)作的第一個病程時期，只有一部分高尿酸血癥患者發(fā)展為痛風(fēng)，痛風(fēng)的患病率遠低于高尿酸血癥的患病率，原因目前尚不清楚。

目前痛風(fēng)尚無法徹底根治，對患者的治療主要是控制血尿酸水平和急性關(guān)節(jié)炎發(fā)作，預(yù)防尿酸鹽沉積，防止痛風(fēng)石形成及腎功能損害。現(xiàn)有痛風(fēng)藥物如別嘌呤醇、苯溴馬隆、秋水仙堿等，有很多副作用。有研究證明，黃酮類、酚酸類、萜類、生物堿類等化合物具有良好的降尿酸作用，但是天然活性物質(zhì)的提取成本極高，限制了其工業(yè)化應(yīng)用。蛋白來源的小分子降尿酸肽具有制備成本低、安全性高、易吸收、高活性、穩(wěn)定性和特異性等特點，已引起研究者的關(guān)注。一些肽不僅在體外具有黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）抑制活性，在體內(nèi)也被發(fā)現(xiàn)具有降尿酸的活性。所以開發(fā)食品來源的、新型的、低毒副作用的降尿酸活性物質(zhì)具有重要的意義。雖然活性肽已成為降尿酸研究領(lǐng)域的熱點，但鮮見關(guān)于此方面的研究，目前國內(nèi)外有關(guān)降尿酸活性的研究聚焦于XO抑制劑的篩選。

1 黃嘌呤氧化酶概述

新鮮牛奶中含有一種物質(zhì)，可使加入醛類的美蘭或靛藍溶液褪色，這種物質(zhì)被命名為沙爾丁格酶（Shardinger enzyme），也就是后來發(fā)現(xiàn)的XO。XO是嘌呤代謝中的關(guān)鍵酶，廣泛存在于各種生物體中，哺乳動物的XO不僅大量存在于肝臟，而且也大量存在于肺、乳腺、腎臟、腸道等具有血管內(nèi)皮細胞的器官。

XO結(jié)構(gòu)和功能研究中的XO大多是從牛乳中分離出來的，盡管也對人、禽和細菌來源的XO進行了表征，但是研究發(fā)現(xiàn)所有這些來源的酶氧化還原中心的結(jié)構(gòu)都相同。XO是一種底物非專一性的羥化酶，主要功能是催化次黃嘌呤氧化為黃嘌呤，再進一步催化黃嘌呤氧化生成尿酸，其底物包括嘌呤、嘧啶、蝶呤、芳雜環(huán)和某些醛類等。體內(nèi)的黃嘌呤轉(zhuǎn)化成尿酸的過程中，鉬中心首先得到2個電子，由正六價降低至正四價，經(jīng)兩個鐵硫中心（2Fe-2S）中心傳遞，然后通過黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）將電子傳給NAD或氧分子，將其轉(zhuǎn)化成NADH或O。此外，XO還在小腸吸收鐵離子和肝臟轉(zhuǎn)運鐵的過程中發(fā)揮重要作用。不同來源的XO均為分子質(zhì)量為300 kDa的蛋白質(zhì)，由兩個相同的亞基組成，每一個亞基全長1 333～1 358個氨基酸，具體數(shù)目依不同物種而定。圖1A所示為XO中的1個亞基，圖1B紅色透明圓球所示為XO的活性位點及抑制劑作用區(qū)域，每個亞基有3個結(jié)構(gòu)域（圖1C）：1個鉬輔因子（molybdopterin，Mo-pt）；兩個鐵硫中心（2Fe-2S）和1個FAD，3個部分幾乎呈線性排列。其中包含Mo-pt的鉬蝶呤中心是XO催化的關(guān)鍵位點，它通過兩個S原子與蝶呤相連，以Mo＝O中的O為頂點形成一個四面錐體的結(jié)構(gòu)。氨基酸殘基Glu802、Arg880、Glu1261（牛乳XO的氨基酸順序）是促進催化反應(yīng)的關(guān)鍵殘基。黃嘌呤氧化酶抑制劑（xanthine oxidase inhibitor，XOI）一般與鉬蝶呤中心的催化活性位點結(jié)合，可逆或不可逆地抑制XO活力，防止底物發(fā)生羥化反應(yīng)，減少尿酸生成，降低血清中尿酸的濃度，達到治療高尿酸的效果。XOI通過抑制XO活性減少尿酸的生成，進而降低血清中尿酸的濃度。

圖1 XO的結(jié)構(gòu)及氨基酸序列Fig.1 Structure and amino acid sequence of XO

2 黃嘌呤氧化酶混合肽類抑制劑

目前研究發(fā)現(xiàn)的XO混合肽類抑制劑原料分為乳類、牲畜類、海產(chǎn)品類3種，其中以海產(chǎn)品類研究居多。表1列出了XO混合肽類抑制劑的原料、酶解用酶及抑制效果。劉丹等發(fā)現(xiàn)乳清蛋白粉酶解物具有顯著的降尿酸活性；張瑞雪等發(fā)現(xiàn)富含鵝肌肽的雞胸肉酶解物能有效降低尿酸水平，緩解小鼠的急性高尿酸血癥；趙謀明等研究發(fā)現(xiàn)6.4 mg/mL（以氮計）秋刀魚酶解物的XO抑制率達到（39.24f0.01）%；鄒琳等研究發(fā)現(xiàn)8.8 mg/mL（以氮計）鰹魚背腹肉酶解物的XO抑制率為62.26%；劉洋使用不同種類單酶和復(fù)合酶酶解海洋魚，其中復(fù)合酶獲得的酶解物體外XO抑制率最高，為39.24%；吉薇等研究發(fā)現(xiàn)扁舵鰹魚低聚肽能抑制XO的活力，減少尿酸的生成和尿酸鹽晶體的沉積。

表1 XO混合肽類抑制劑的來源與活性Table 1 Sources and activity of mixed peptide inhibitors of XO

3 黃嘌呤氧化酶單一肽類抑制劑

為了確定混合肽類抑制劑中發(fā)揮作用的肽，研究者們通常要將混合肽進行分離純化，質(zhì)譜鑒定得到肽序列，固相合成后對其進行研究。圖2展示了肽類抑制劑酶解、分離純化的通用步驟和技術(shù)，表2列舉了近年來已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的XO單一肽類抑制劑及其抑制效果，由于不同研究體系對應(yīng)的陽性對照別嘌呤醇的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC）不同，故將不同文獻中別嘌呤醇的IC值也列出。

表2 XO單一肽類抑制劑及其對XO的抑制效果Table 2 Single-peptide inhibitors of XO and their XO-inhibitory effects

圖2 肽類抑制劑制備的通用步驟Fig.2 General steps for the preparation of peptide inhibitors

Liu Naixin等將制得的水稻提取物用Sephadex G-50凝膠過濾柱純化后，進行兩輪高效液相色譜分離，得單一肽AAAAGAKAR（RDP1）；進一步體外研究表明1 mg/mL RDP1對XO有明顯的抑制作用，是1 mg/mL別嘌呤醇抑制作用的1/4，高尿酸血癥大鼠模型也證明了1 mg/kg RDP1對XO的抑制活性高于10 mg/kg別嘌呤醇。Jang等以平菇為原料制得提取物，通過Sephadex G-50凝膠色譜層析、超濾、C固相萃取色譜和反相高效液相色譜等方法純化得單一肽FCH，F(xiàn)CH的IC值為0.9 mg/mL。Nongonierma等研究發(fā)現(xiàn)在不同的乳蛋白底物中，只有乳鐵蛋白水解液表現(xiàn)出XO抑制作用。研究的12種二肽中，只有含Trp的肽Val-Trp及其反肽Trp-Val具有XO抑制活性，且XO抑制率分別為（37.2f2.2）%、（36.7f11.2）%。Nongonierma等還發(fā)現(xiàn)除Trp外，其他氨基酸均不能抑制XO。黎青勇等將脫脂脫酚核桃蛋白酶解物用Sephadex G-15凝膠色譜層析和反相高效液相色譜法分離純化后，采用超高壓液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用共解析出7種核桃蛋白肽片段：WDD、HCPF、WDQW、PPKNW、WPPKN、ADIYTE和WSREEQE；其對XO的IC值分別為（2.41f0.02）、（15.07f1.74）、（0.95f0.01）、（2.21f0.04）、（2.06f0.05）、（7.37f0.14）、（1.88f0.00）mmol/L。Murota等以鯊魚鰭軟骨為原料進行酶解，在酶解產(chǎn)物中鑒定出兩條肽YLDNY和SPPYWPY，這兩條肽在體外時并沒有XO抑制活性，但一些來源于YLDNY的二肽或三肽如Asp-Asn卻表現(xiàn)出體外XO抑制活性。這可能是肽在消化吸收的過程中分解成更小的肽段，從而發(fā)揮XO抑制活性或誘導(dǎo)了內(nèi)源性XO抑制劑的活性，這些片段肽的IC值是別嘌呤醇的13～23 倍。Li Yujuan等以鰹魚糜蛋白為原料，用木瓜蛋白酶酶解得水解產(chǎn)物。用離子交換色譜法、凝膠過濾色譜法純化具有強XO抑制活性的組分，通過液相色譜電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜鑒定出兩條抑制活性隨濃度的增加而增加的多肽PGACSN、WML。He Weiwei等用堿性蛋白酶水解得金槍魚肉得酶解物，用Sephadex G-15分離乙醇可溶組分后，進一步利用超高效液相色譜進行分離，通過質(zhì)譜鑒定出13 條肽，其中FH對XO的抑制率最高，IC值為25.7 mmol/L。宋敏杰通過固定化XO的磁性顆粒，采用配體垂釣的方法從藍點馬鮫魚肉蛋白水解物中獲得能夠與XO相互作用的配體，發(fā)現(xiàn)IIAPPER和AGFAGDDAPR這兩段序列都具有一定的XO抑制效果，IC值分別為6.08 mg/mL和6.15 mg/mL。Zhong Hao等以鰹魚為原料用中性蛋白酶酶解得酶解液，超濾收集600～1 000 Da部分后，通過基質(zhì)輔助激光解吸

串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜分析鑒定得到五肽ACECD，發(fā)現(xiàn)其具有較強的XO抑制活性且其IC值為7.23 mg/mL。盛周煌以羅非魚皮膠原蛋白為原料用復(fù)合蛋白酶酶解后，通過超濾、離子交換柱層析、Sephadex G-25凝膠過濾、反相高效液相色譜分離純化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜鑒定得到TSPW，IC值為3.51 mg/mL。

4 黃嘌呤氧化酶肽類抑制劑的活性機制

研究者們通常使用分子對接的方法來說明XO肽類抑制劑的活性機制，表3列出并對比了文獻中敘述的單一肽類抑制劑和本綜述中這些肽與XO（PBD ID：1FIQ）對接時使用的分子對接軟件、使用酶的PDB ID及抑制機制。Nongonierma等將所有20種氨基酸和400種二肽與XO進行對接，結(jié)果表明，XO與Trp或含有Trp的二肽之間的對接涉及到與XO中至少6個疏水氨基酸殘基的相互作用。AAAAGAKAR占據(jù)了XO的藥物活性腔之一的Mo-pt結(jié)構(gòu)域，Glu232作為黃嘌呤與XO相互作用的結(jié)合位點之一，在該反應(yīng)中起重要作用。WPPKN進入疏水通道，阻礙了黃嘌呤和XO的相互作用。而ADIYTE位于B鏈表面，阻止了底物進入疏水通道。ADIYTE由于與Mo-pt結(jié)構(gòu)域的相互作用較弱，因此ADIYTE對XO的抑制作用不如WPPKN。Li Qingyong等將20個氨基酸、400個二肽和8 000個三肽進行了分子對接，結(jié)果表明：Trp是混合型抑制類型，Trp與XO的關(guān)鍵殘基Glu802、Leu873、Ser876、Arg880、Phe914、Phe1 009、Thr1 010、Val1 011、Leu1 014、Ala1 078、Ala1 079和Mos3 004有活性相互作用，包括氫鍵、疏水相互作用和范德華力，W和別嘌呤醇（降尿酸藥物）與XO的相互作用方式類似；PPKNW的XO抑制作用為非競爭性抑制類型，PPKNW與殘基Phe649、Leu712、His875、Glu879、Phe883、Pro1 012、Phe1 013、Tyr1 140、Phe1 142和Glu1 143有相互作用，包括氫鍵、疏水相互作用和范德華力；WDQW的XO抑制作用為混合型抑制類型，WDQW與關(guān)鍵殘基Glu802、Leu873、Ser876、Arg880、Phe914、Phe1 009、Thr1 010、Val1 011、Leu1 014、Ala1 078、Ala1 079和Mos3 004相互作用。PGACSN的氨基酸殘基與XO的關(guān)鍵殘基Glu802、Arg880、Glu1 261之間存在氫鍵和吸引電荷；而WML則主要通過疏水相互作用進入疏水通道，然后在Leu和Asn768之間只觀察到一個氫鍵（2.036 ?），在Trp和Mos3 004活性位點之間形成一個π-硫鍵。FH與XO中的Ser876、Thr1 010之間存在兩個氫鍵，與Phe914有π-π堆積的相互作用。IIAPPER整條序列無法對接成功，而去掉兩端任意1個氨基酸之后的序列IIAPPE及IAPPER卻能對接成功，由于XO活性口袋接近蛋白表面，而不在內(nèi)部，因此有理由猜測該活性肽并非完全進入活性口袋，而是有一部分留在活性口袋外側(cè)，阻止了底物進入活性中心，同樣達到了抑制酶活的效果。ACECD能插入到XO中含Mo原子的活性中心，并且通過氫鍵、疏水作用力和范德華力等與活性中心周圍的氨基酸殘基產(chǎn)生相互作用，ACECD可能與底物黃嘌呤之間存在競爭同一結(jié)合位點的現(xiàn)象。

表3 XO抑制肽抑制機制Table 3 Mechanism of action of XO inhibitory peptides

為了更好地表現(xiàn)分子對接結(jié)果，本文將相關(guān)研究中已知抑制肽的序列AAAAGAKAR、WPPKN、ADIYTE、W、PPKNW、WDQW、PGACSN、WML、FH、IIAPPER（IAPPER、IIAPPE）、ACECD與XO（PBD ID：1FIQ）進行對接，酶的對接位點如圖1B所示，對接結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出，AAAAGAKAR與Glu879、Thr1 010之間存在范德華力、氫鍵、碳氫鍵和吸引電荷。WPPKN與Thr1 010、Glu879、Ser876、His875、Phe649之間存在范德華力、鹽橋、氫鍵、碳氫鍵、π-π堆積和π-π T型相互作用。ADIYTE與Arg871、Glu879、Phe649、Phe1 142、Ser1 141、Tyr1 140之間存在范德華力、鹽橋、氫鍵、碳氫鍵和π-烷基相互作用。W與Glu802、Pro1076、Lys771、Phe914、Ala1 079、Phe1 009、Leu1 014、Val1 011、Thr1 010之間存在范德華力、吸引電荷、氫鍵、碳氫鍵、π-π堆積、π-π T型和π-烷基相互作用。PPKNW與Thr1 010、Glu879、Phe649、Lys771、Pro1 076、Leu873、Leu1 014、Phe1 009、Val1 011之間存在范德華力、鹽橋、吸引電荷、氫鍵、碳氫鍵、π-陽離子、π-π T型和π-烷基相互作用。WDQW與Pro1 012、Tyr1 140、Leu712、His875、Glu879之間存在范德華力、鹽橋、碳氫鍵、π-孤電子對、π-π堆積、π-π T型和π-烷基相互作用。PGACSN與Glu879、Thr1 010、Ser876、His875、Arg871、Asp872之間存在范德華力、吸引電荷、氫鍵和碳氫鍵相互作用。WML與Arg871、Phe1 013、Lys771、Met770、Ala1 079、Phe914、Leu1 014、Thr1 010、Phe1 009、Val1 011之間存在范德華力、鹽橋、氫鍵、π-Sigma鍵、π-π堆積、π-π T型、烷基和π-烷基相互作用。FH與Ser1 080、Ser1 082、Ala1 078、Phe914、Gly799、Gly1 260、Arg912、Gln1 194、Phe798、Met1 038、Cys150之間存在范德華力、氫鍵、碳氫鍵、π-π堆積、π-π T型和π-烷基相互作用。IIAPPER與XO對接不成功，而去掉兩端任意1個氨基酸之后的序列IAPPER及IIAPPE卻能對接成功，IAPPER與Phe1 013、Ser1 141、Val1 011、Phe1 142、Tyr1 140、Glu879之間存在范德華力、鹽橋、氫鍵、碳氫鍵、烷基和π-烷基相互作用。IIAPPE與Phe914、Ser876、Phe1 009、Leu648、Phe647、Pro1 012、Thr1 010之間存在范德華力、氫鍵、碳氫鍵、烷基和π-烷基相互作用。ACECD與Arg871、Ser876、His875、Phe914、Glu802、Lys771、Glu879之間存在范德華力、吸引電荷、氫鍵、碳氫鍵、π-陽離子、π-氫鍵供體和π-硫相互作用。從對接結(jié)果可以推測出，較小分子的肽可以進入疏水通道，進入活性中心，從而阻礙底物的進入而達到抑制酶活的效果，較大分子的肽段對接在疏水通道表面入口處，阻斷底物進入活性中心，達到抑制酶活的效果。

圖3 1FIQ與AAAAGAKAR（A）、WPPKN（B）、ADIYTE（C）、W（D）、PPKNW（E）、WDQW（F）、PGACSN（G）、WML（H）、FH（I）、IAPPER（J）、IIAPPE（K）、ACECD（L）分子對接結(jié)果Fig.3 Molecular docking results of 1FIQ with AAAAGAKAR (A),WPPKN (B), ADIYTE (C), W (D), PPKNW (E), WDQW (F), PGACSN (G),WML (H), FH (I), IAPPER (J), IIAPPE (K) and ACECD (L)

5 黃嘌呤氧化酶肽類抑制劑的結(jié)構(gòu)特性

研究XO肽類抑制劑的結(jié)構(gòu)特性可為研究者發(fā)現(xiàn)此類抑制劑提供一定的思路。Kubomura等實驗結(jié)果表明，含有肌肽及鵝肌肽的鯉魚提取物能夠降低血尿酸水平。而肌肽及鵝肌肽是否通過抑制XO活力來發(fā)揮降尿酸作用尚不明確。鄒琳等實驗結(jié)果表明，肌肽、鵝肌肽含量與XO抑制活性不存在明顯的量效關(guān)系，其認為肌肽或鵝肌肽是通過其他機制達到了降尿酸的目的。Li Yujuan等發(fā)現(xiàn)中性或弱堿性肽比酸性肽更容易成為有效的XO抑制劑。Li Qingyong等發(fā)現(xiàn)含有Trp的肽具有相對較高的XO抑制活性，且Trp的位置對肽的XO抑制活性有一定的影響，Trp殘基數(shù)量的增加能有效提高含Trp肽的XO抑制活性。Nongonierma等的研究也表明含Trp的多肽對XO的抑制作用主要歸因于Trp殘基。除Trp外，其他氨基酸均不能抑制XO活性。He Weiwei等發(fā)現(xiàn)含Trp的肽有顯著的XO抑制活性。含Phe的肽比含Trp的肽具有更強的XO抑制活性。由于XO的活性中心由一個疏水囊組成，是XO抑制劑發(fā)揮抑制作用的重要區(qū)域。因此，含有較多疏水氨基酸的部分可能更容易進入XO活性中心的疏水區(qū)。除此之外，He Weiwei等還發(fā)現(xiàn)堿性氨基酸對含有Phe二肽的XO抑制活性起到關(guān)鍵作用，包含Phe和堿性氨基酸的二肽具有更強的XO抑制活性。鄒琳等認為酶解液中發(fā)揮XO抑制活性的物質(zhì)主要是小分子的肽段。黎青勇的分子對接結(jié)果表明，芳香族氨基酸（包括Trp、Tyr、Phe和His）具有較高的Vina分數(shù)，預(yù)測這類氨基酸能促使多肽具有較高的XO抑制活性；總體上，芳香族的氨基酸殘基在N端位置有利于多肽具有較高的Vina分數(shù)，芳香族的氨基酸殘基在中間位置卻不利于多肽Vina分數(shù)的提高，從而預(yù)測不能有效抑制XO的催化活性。綜上所述，小分子、疏水性（含芳香族氨基酸）、中性或弱堿性、芳香族的氨基酸殘基在N端位置的多肽可能具有更高的XO抑制活性。

6 結(jié) 語

現(xiàn)有痛風(fēng)藥物有很多副作用。天然活性物質(zhì)的提取成本極高，限制了其工業(yè)化應(yīng)用，開發(fā)食品來源的、新型的、低毒副作用的降尿酸活性物質(zhì)具有重要的意義。根據(jù)其結(jié)構(gòu)共性，研究者在開發(fā)一種新的XO肽類抑制劑時可著重分離純化小分子、疏水性、中性或弱堿性多肽，這樣更容易得到XO抑制率高的肽段。因此，研究此類抑制劑的結(jié)構(gòu)共性，可為研究者發(fā)現(xiàn)新的XO肽類抑制劑提供方向。這類抑制劑擺脫了藥物有副作用的缺點，更加安全健康，可作為保健食品提供給消費者。目前XO肽類抑制劑的篩選與制備多使用分離純化的方法，且大多停留在實驗室研究階段。基于生物信息學(xué)，QSAR及分子對接等方法的篩選與制備可以為大幅度提高生產(chǎn)效率提供技術(shù)支撐，這些新方法可給研究者提供新的研究思路，這也將是未來的研究熱點之一；同時，通過動物模型和細胞模型準確解析XO肽類抑制劑的構(gòu)效關(guān)系及活性機制，這對于功能性食品的開發(fā)具有重要意義；另外，XO肽類抑制劑在產(chǎn)品開發(fā)中應(yīng)用時，苦味控制、水溶性提高、活性保持等關(guān)鍵技術(shù)有待進一步研究，這些方面也將是研究的熱點。