張皓淳

(遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 沈陽 110034)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是因?yàn)榉侵挢i瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)所導(dǎo)致的家豬、野豬等相關(guān)動(dòng)物品種所產(chǎn)生的一類熱性、高度接觸性的出血性傳染病，臨床主要以高熱、淋巴結(jié)及臟器嚴(yán)重出血作為特征，具有較高的接觸傳染性，不同品種和年齡段的豬均可感染，發(fā)病率和死亡率較高，感染ASFV強(qiáng)毒株后致死率可高達(dá)100%[1]。ASFV首次在非洲肯尼亞地區(qū)發(fā)現(xiàn)，2007年擴(kuò)散到亞美尼亞等地，隨后在北歐各國相繼發(fā)生[2]。我國首例病例于2018年10月發(fā)生在遼寧省沈陽市沈北新區(qū)，之后在國內(nèi)各地區(qū)廣泛暴發(fā)和流行，嚴(yán)重影響了我國的養(yǎng)豬業(yè)，目前已被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列為一類動(dòng)物疫病[3]?，F(xiàn)階段市場上流行的ASF疫苗尚未經(jīng)過政府相關(guān)部門的認(rèn)可，且保護(hù)率還有待提高，因此對(duì)ASF的疫病防控應(yīng)及時(shí)采取早期預(yù)防、及時(shí)撲殺和阻斷傳播等有效方式[4]。所以，確立靈敏度高的測定手段是該病的重要預(yù)防和控制方案之一。作為非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬唯一的病毒種類，ASFV的直徑為175 nm～215 nm，是一種二十面體帶囊膜的雙鏈DNA病毒。該病毒的遺傳物質(zhì)大小介于170 kb～190 kb，其中含有151個(gè)開放閱讀框，遺傳物質(zhì)可以編碼150～200個(gè)蛋白[5-7]。本研究通過構(gòu)建重組原核質(zhì)粒pGEX-6P-1-p54，進(jìn)行原核表達(dá)，優(yōu)化表達(dá)條件，確立測定ASFV抗體的間接ELISA方法，為深入探究ASFV測定試劑盒打下夯實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

限制性內(nèi)切酶均購自中國大連寶生物試劑有限公司，GST標(biāo)簽蛋白純化試劑盒購自美國Clontech公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Sigma公司，GSH-瓊脂糖凝膠預(yù)裝柱購自生工生物工程(上海)股份有限公司，HRP標(biāo)記的山羊抗豬IgG、山羊抗兔IgG均購自英國Abcam公司，pGEX-6P-1原核表達(dá)載體由錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供和保存，ASFV-p54基因質(zhì)粒、非洲豬瘟陰性和陽性血清、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬口蹄疫病毒、豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒陽性血清均由國家外來動(dòng)物疫病研究中心提供和保存。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank(序列號(hào)：NC_044943.1)公布的ASFVp54的基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，上游引物p54-F序列：5′-CATATGATGGAT TCTGAATTTTTTCA-3′，下游引物p54-R序列：5′-AAGCTTTTACAAGGAGTTTTCTAGGT-3′，擴(kuò) 增片段大小為552 bp。為了方便構(gòu)建質(zhì)粒，給引物添加相應(yīng)的酶切位點(diǎn)(BamHI，XhoI)，引物由上海生工合成。

1.3 ASFV-p54重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以ASFV-p54基因質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。目的片段用DNA凝膠回收與純化試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行回收純化。將回收純化的目的基因片段與相同酶切位點(diǎn)酶切回收的pGEX-6P-1載體在16 ℃下連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂于LB瓊脂平板上(含80 μg/mL氨芐西林)，37 ℃下恒溫過夜培養(yǎng)。次日，選擇長勢狀態(tài)良好的單個(gè)菌落，將其接種到5 mL的LB液體培養(yǎng)基中(該培養(yǎng)基含有濃度為80 μg/mL的氨芐西林)，37 ℃ 170 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，菌液PCR和雙酶切鑒定正確后，送去測序。PCR反應(yīng)體系如下(25 μL)：ddH2O 19.75 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture(10 mmol/L)1.0 μL，引物(10 μmol/L) 0.5 μL，ExTaq 0.25 μL，cDNA 1.0 μL。其相關(guān)條件參數(shù)設(shè)置為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。

1.4 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)

將連接產(chǎn)物pGEX-6P-1均勻涂于LB瓊脂平板上(含80 μg/mL氨芐西林)，37 ℃過夜培養(yǎng)。次日，選取長勢狀態(tài)良好的單個(gè)菌落，將其接種到5 mL的LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL氨芐西林)中，37 ℃，200 r/min至OD600nm為0.5時(shí)，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，之后繼續(xù)振搖培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后收菌(初步誘導(dǎo)表達(dá)條件為：IPTG至終濃度 1.0 mmol/L、30 ℃、220 r/min震蕩6 h后收菌[7])。

1.5 誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

將目的蛋白誘導(dǎo)的三個(gè)重要條件進(jìn)行優(yōu)化，將溫度(20 ℃、24 ℃、28 ℃、30 ℃、35 ℃)、IPTG終濃度(0、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L、2.0 mmol/L)、誘導(dǎo)時(shí)間(0、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h)設(shè)置梯度，聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gellectrohoresis，SDSPAGE)分析，通過灰度掃描，最終確定誘導(dǎo)表達(dá)的最佳條件。

1.6 重組蛋白的收集純化

收集誘導(dǎo)后的菌液，5 000 r/min下離心20 min，棄盡上清，依據(jù)菌液沉淀量加入適量磷酸緩沖液。經(jīng)超聲波破碎(一次超聲10 s，間歇10 s，直至溶液澄清)后，放入低溫超速離心機(jī)中離心，12 000 r/min，4 ℃，30 min，收集上清液于4 ℃下保存。使用還原性谷胱甘肽瓊脂糖凝膠預(yù)裝柱對(duì)收集的上清液進(jìn)行蛋白純化，用BCA法測定蛋白含量。

1.7 SDS-PAGE與免疫印跡檢測

將純化蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后觀察分析，同時(shí)將重組蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，4 ℃過夜封閉，使用ASFV陽性血清為一抗，HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG與山羊抗兔IgG為二抗分別進(jìn)行雜交1 h，最后ECL顯色。

1.8 建立間接ELISA方法

1.8.1 確定重組蛋白最佳包被濃度和血清最佳稀釋倍數(shù)

使用方陣滴定試驗(yàn)明確最好的反應(yīng)環(huán)境條件，將純化后的重組蛋白的濃度調(diào)整到38.4 μg/mL、19.2 μg/mL、9.6 μg/mL、4.8 μg/mL、2.4 μg/mL、1.2 μg/mL、0.6 μg/mL，包被96孔板，100 μL/孔，4 ℃過夜。每孔加入200 μL封閉液，37 ℃下孵育1 h。ASFV陽性血清和陰性血清為一抗，分別稀釋到1∶25、1∶50、1∶100、1∶200，100 μL/孔，37 ℃下孵育1 h。HRP標(biāo)記的山羊抗豬IgG為二抗，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h。加入TMB顯色液，100 μL/孔，37 ℃孵育10 min，之后加入顯色終止液，酶標(biāo)儀上機(jī)讀數(shù)，根據(jù)P/N值確定最佳包被濃度和血清最佳稀釋倍數(shù)。

1.8.2 特異性試驗(yàn)

選取豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬口蹄疫病毒、豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒的陽性血清，每個(gè)10份，并設(shè)定ASFV陽性血清和相關(guān)的陰性對(duì)照，使用已經(jīng)優(yōu)化的條件進(jìn)行間接ELISA檢測。

1.8.3 靈敏度試驗(yàn)

將ASFV陽性血清依照1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400的要求進(jìn)行調(diào)整，使用優(yōu)化后的條件對(duì)其進(jìn)行間接ELISA測定，明確陽性血清需要稀釋的最大數(shù)值。

1.8.4 重復(fù)性試驗(yàn)

組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)：用同一次包被的96孔板檢測ASFV血清10份，每份做5個(gè)復(fù)孔；組間重復(fù)性試驗(yàn)：用5次包被的96孔板檢測ASFV血清10份。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

利用設(shè)計(jì)的引物成功擴(kuò)增AFSVp54基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到522 bp長度的目的片段(圖1)，與設(shè)計(jì)結(jié)果一致。將目的基因連接至pGEX-6P-1原核表達(dá)質(zhì)粒，得到pGEX-6P-1-p54質(zhì)粒，經(jīng)BamHI、XhoI雙酶切鑒定(圖2)及測序結(jié)果，顯示pGEX-6P-1-p54重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒與pGEX-6P-1空載體分別進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，在大腸桿菌BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)用未誘導(dǎo)菌作為陰性對(duì)照組，SDSPAGE分析蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，pGEX-6P-1空載體表達(dá)GST標(biāo)簽為26 kDa，與GST標(biāo)簽重組的蛋白分子量約為46 kDa，與理論值一致(圖3)。

2.3 表達(dá)條件的優(yōu)化確定

將目的蛋白誘導(dǎo)的溫度、IPTG終濃度、誘導(dǎo)時(shí)間三個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果表明當(dāng)誘導(dǎo)溫度為30 ℃，IPTG濃度為0.8 mmol/L、離心速度為220 r/min、反應(yīng)時(shí)間為8 h時(shí)，表達(dá)量最大(圖4、圖5、圖6)。

2.4 免疫印跡檢測重組蛋白

在試驗(yàn)中，分別用GST標(biāo)簽抗體和ASFV陽性血清為一抗，對(duì)重組蛋白進(jìn)行免疫印跡分析。結(jié)果顯示，優(yōu)化后的重組蛋白與GST抗體和ASFV陽性血清均發(fā)生特異性反應(yīng)，在46 kDa處均有明顯特異性條帶(圖7、圖8)，兩次結(jié)果與SDS-PAGE分析結(jié)果和蛋白分子量計(jì)算值一致。

2.5 間接ELISA條件的確定

2.5.1 重組蛋白最佳包被濃度和血清最佳稀釋倍數(shù)

將上述已經(jīng)純化好的重組蛋白按照38.4 μg/mL、19.2 μg/mL、9.6 μg/mL、4.8 μg/mL、2.4 μg/mL、1.2 μg/mL、0.6 μg/mL的指標(biāo)進(jìn)行調(diào)整，ASFV陽性血清和陰性血清為一抗，分別稀釋到1∶25、1∶50、1∶100、1∶200，結(jié)果如表1所示，抗原包被濃度最終需要調(diào)整到1.2 μg/mL，血清稀釋程度達(dá)到1∶100時(shí)該物質(zhì)的OD450nm值接近于1，在這個(gè)過程中P/N值是高的，所以重組蛋白最好的包被濃度需要達(dá)到1.2 μg/mL，血清最佳稀釋倍數(shù)1∶100。根據(jù)OD450nm的x-值，被檢測樣本大于0.313可以評(píng)判為陽性，低于這一數(shù)值可以評(píng)判為陰性。

2.5.2 特異性試驗(yàn)

用建立的ELISA方法分別以豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬口蹄疫病毒、豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒的陽性血清學(xué)為一抗，進(jìn)行對(duì)比測定，結(jié)果如圖9所示。六種病毒的血清OD450nm值均低于0.313，檢測結(jié)果均為陰性，證明建立的ELISA方法具有良好的特異性。

2.5.3 特異性試驗(yàn)

將ASFV陽性血清(原始濃度為38.4 μg/mL)按照1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400的倍數(shù)進(jìn)行稀釋，采用優(yōu)化后的條件進(jìn)行間接ELISA檢測，其數(shù)據(jù)如圖10所示。由圖10可知，當(dāng)該病毒陽性血清稀釋到1∶1 600時(shí)，OD450nm值依然高于0.313，證明建立的ELISA方法具有較好的敏感性。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn)

分別通過組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)與組間重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果如圖11所示，組內(nèi)變異系數(shù)與組間變異系數(shù)都小于10%，這證實(shí)所建立的ELISA方法具有比較可觀的重復(fù)性。

3 討論

ASF屬于一類熱性、出血性傳染病，臨床主要以高熱、淋巴結(jié)及臟器嚴(yán)重出血為特征，具有較高的接觸傳染性，所有品種和年齡段的豬均可感染，發(fā)病率和死亡率較高，ASFV強(qiáng)毒株的致死率可達(dá)100%，嚴(yán)重威脅全球養(yǎng)豬業(yè)。目前ASF尚無有效的預(yù)防和治療措施，所以規(guī)?；i場需要結(jié)合早期檢測和實(shí)時(shí)監(jiān)控等方法方能有效防控ASF[8]。ASF與經(jīng)典豬瘟、豬丹毒等疾病具有相似的臨床癥狀，在進(jìn)行鑒別診斷時(shí)，可以采用病毒分離、血清學(xué)檢測、免疫熒光法、免疫組化法以及核酸檢測等多種比較常見的方法，目前血清學(xué)檢測法已得到了廣泛的應(yīng)用，不僅所需成本低，而且具有較高的準(zhǔn)確性，便于操作處理，適用于大多數(shù)豬場實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行診斷操作，所以建立一種靈敏度高且特異性強(qiáng)的ASFV血清學(xué)檢測方法有助于ASF的防控[9-11]。目前，在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的血清學(xué)診斷方法中，OIE首選ELISA方法作為診斷ASFV的血清學(xué)方法，該方法具有操作簡便、特異性較好、靈敏度高的特點(diǎn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的硬件和實(shí)驗(yàn)人員的操作水平要求較低，可同時(shí)檢測大批量樣本。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，ASFV表達(dá)的蛋白多達(dá)150余種，其中p30蛋白、p54蛋白、p72蛋白具備血清學(xué)診斷價(jià)值[12-14]。p54蛋白主要位于病毒的內(nèi)囊膜上，具有良好的免疫原性。同時(shí)，p54蛋白在病毒衣殼的運(yùn)輸和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮重要作用[15]。所以，重組蛋白p54可以作為良好的診斷抗原，用于ASFV感染中期或者后期的血清學(xué)診斷。

本研究主要參考了發(fā)布于GenBank上的從中國的發(fā)病豬上分離的ASFVp54基因序列，并優(yōu)化大腸桿菌密碼子，在全序列克隆基因之后，通過原核表達(dá)的方式，對(duì)可溶性重組蛋白GST-p54進(jìn)行表達(dá)，且該蛋白的反應(yīng)原性較佳。通過對(duì)p54蛋白原核表達(dá)體系的探索，建立了大量制備可溶性p54蛋白的體系，可用于后續(xù)的抗體制備、ELISA試劑的研制以及蛋白結(jié)晶的解析等，具有潛在的應(yīng)用研究和基礎(chǔ)研究價(jià)值。

本研究選擇的包被抗原——GST-p54重組蛋白，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，構(gòu)建了ASFV抗體間接ELISA檢測方式。試驗(yàn)結(jié)果表明，此種方式具有良好的重復(fù)性與敏感性，而且特異性較佳，具有重要的研究意義。