柯群華，呂亞楠，彭 晶，吳雪琴，嚴(yán)作廷，王勝義*

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室，蘭州 730050)

母豬圍產(chǎn)期常會表現(xiàn)出一系列的癥候群，主要包括母豬產(chǎn)前產(chǎn)后便秘、不食，母豬產(chǎn)程長，母豬產(chǎn)后癱瘓、缺乳、奶水質(zhì)量差，產(chǎn)后不發(fā)情等[1-2]。依據(jù)中獸醫(yī)辨證理論，“氣血虧虛”是母豬分娩前后的主要問題，也是影響產(chǎn)仔數(shù)和仔豬成活率的核心因素。因此，母豬分娩前后的保健主要圍繞“氣血”進行。參黃顆粒是針對母豬氣血兩虛研制的中獸藥。固體制劑具有穩(wěn)定性好、體積小，攜帶方便，易于獸用臨床應(yīng)用等優(yōu)點，同時加入矯味劑，可以明顯改善藥物口感。顆粒劑臨床使用、運輸便捷，性狀穩(wěn)定，都極大的優(yōu)于合劑[3-4]。中藥顆粒劑的制備一般要經(jīng)過中藥材提取、分離純化和濃縮、輔料的選擇及制粒成型等過程，處理方式往往會因方劑的不同而有所差異，故中藥顆粒劑制備工藝的優(yōu)化要從藥材的性質(zhì)、提取溶劑的種類、成型工藝的特點等多個方面進行考慮。試驗依據(jù)藥材的性質(zhì)采用水煎煮并冷凝回流工藝進行提取、真空冷凍濃縮干燥，并采用正交設(shè)計法對參黃顆粒劑敷料配比工藝進行優(yōu)化，優(yōu)選出成型工藝，為處方臨床大規(guī)模生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 中藥粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；標(biāo)準(zhǔn)檢驗篩(浙江上虞市金鼎標(biāo)準(zhǔn)篩具廠)，DHG—9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海鴻都電子科技有限公司)；Waters2695高效液相色譜儀(Waters公司); AL104電子天平(梅特勒有限公司)；KQ5200DE型臺式數(shù)控超聲波清洗器(東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司)；電熱套(上海瑞茲儀器設(shè)備有限公司)；SCIENT2—10 N冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.1.2 藥品與試劑 黨參、熟地黃和陳皮等中藥飲片均購自黃河中藥材市場，無水乙醇(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，橙皮苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110721-201617，含量以96.1%計)，可溶性淀粉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20190618)，蔗糖(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20190617)，糊精(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：F1904115)。

甲醇、乙腈為色譜純，冰醋酸(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20181030)為優(yōu)級純。

1.2 方法

1.2.1 提取工藝設(shè)計

1.2.1.1 正交實驗： 采用L9(34)因素水平正交實驗對參黃顆粒提取工藝進行優(yōu)選。以料液比(A)、提取次數(shù)(B)和提取時間(C)作為考察因素，每因素分設(shè)3個水平[5]。以橙皮苷含量、浸膏率作為考察指標(biāo)，因素水平安排見表1。

表1 工藝因素水平設(shè)計表Tab 1 Design table of process factor level

按照處方比例分別稱取黨參、熟地、麥冬、茯苓、白術(shù)、木香、陳皮和甘草，共9份(每份100 g)。按照表1所示，依次以水為溶媒加熱冷凝回流提取、過濾合并濾液，80 ℃濃縮，定容至100 ml，測定各樣品中橙皮苷含量；精確量取各提取液60 ml，轉(zhuǎn)入干燥至恒重的蒸發(fā)皿中水浴蒸干處理，轉(zhuǎn)移至干燥箱中，100 ℃干燥4 h，于干燥箱中冷卻至室溫后迅速稱重；最后計算得出膏率(總干膏/藥材總質(zhì)量×100%)，重復(fù)三次。

1.2.2 干浸膏粉的制備 在確定最佳提取工藝后，根據(jù)散劑處方準(zhǔn)確稱取中藥飲片，適當(dāng)粉碎后，放入大容量圓底燒瓶中，冷凝回流提取，藥材質(zhì)量9倍的水，回流提取3次，每次提取時間1 h，提取完成后，雙層紗布過濾藥渣，合并提取液。將所有濾液常壓濃縮到粘稠狀，之后分裝于冷凍干燥托盤中，放置于-80 ℃冰箱冷凍6 h，后放入冷凍減壓(≤-40 ℃，0.1 pa)干燥機中干燥，干燥后的浸膏劑進行粉碎，備用[6]。

1.2.3 輔料的篩選 輔料和藥物的配比以及輔料的種類是影響顆粒質(zhì)量的關(guān)鍵因素，根據(jù) 2020 年《中國獸藥典》第二部(附錄8)中的要求，輔料量一般不超過藥物量的2倍，因此，試驗選擇藥物和輔料的配比為3∶4。輔料種類是影響制粒成型的重要因素，根據(jù)預(yù)實驗選擇可溶性淀粉、糊精和蔗糖作為制粒輔料，干浸膏粉與輔料的配比見表2。

表2 不同處方顆粒劑配方表(份)Tab 2 Formula table of Different prescription Granules (copies)

1.2.4 濕法制粒 按處方準(zhǔn)確稱取藥物(干浸膏粉)和輔料，混合均勻，使用乙醇作為潤濕劑，通過噴淋的方法加入，邊加邊攪拌，直至能形成軟材，使其“手握成團，輕壓即散”，使用 10 目篩手動制粒，在60 ℃下干燥，用 10 目篩整粒，用于指標(biāo)的測定。

采用成型率、堆密度、休止角、溶化性以及吸濕指標(biāo)來綜合評價顆粒的質(zhì)量，綜合指標(biāo) =(20/最大成型性值)×成型性值 + (15/最大堆密度值)×堆密度值 +(最小休止角值 ×15)/45止角值 +(20/最大溶化性值)×溶化性值 +(最小吸濕率值 ×30)/吸濕率值，通過采用加權(quán)評分法分析試驗結(jié)果，優(yōu)化輔料的篩選和顆粒的成型工藝。

1.2.5 正交試驗優(yōu)化 根據(jù)2020版《中國獸藥典》及現(xiàn)有文獻資料關(guān)于制粒的要求，選擇藥物與輔料配比(A)，乙醇濃度(B)，烘干溫度(C)，通過正交設(shè)計助手ⅡV3軟件設(shè)計進行L9(34)的正交實驗優(yōu)化顆粒劑的制備[7]，優(yōu)化實驗表見表3。按1.2.4制粒，測定顆粒的成型率、堆密度、休止角、溶化性、吸濕性指標(biāo)[8-10]。

表3 正交試驗設(shè)計因素水平表Tab 3 Factor level table of orthogonal experiment design

1.2.5.1 成型率測定 將制備好的顆粒稱重，先過一號篩，再過四號篩，收集能通過一號篩但不能通過四號篩的顆粒，稱重。成型率=過篩后顆粒質(zhì)量/過篩前顆粒質(zhì)量×100%。成型性分值計算運用公式：(20/最大成型性值)×成型性值。

1.2.5.2 堆密度的測定 將過篩后的顆粒放入干燥的量筒中，輕輕振動，讀出其近刻度處的mL數(shù)(V)；將過篩后的質(zhì)量作為M(g)，兩者的比值即為堆密度。堆密度=M/V堆密度分值計算運用公式：(15/最大堆密度值)×堆密度值。

1.2.5.3 休止角測定 采用固定漏斗法，將3只漏斗串聯(lián)并固定于鐵架臺上水平放置的同心圓坐標(biāo)紙上1 cm的高度處，小心地將顆粒沿漏斗壁倒入最上的漏斗中，直到坐標(biāo)紙上形成的顆粒圓錐體尖端接觸到漏斗口為止，由坐標(biāo)紙測出圓錐底部的直徑(2R)，計算出休止角tan=H/R，做5次，計算平均值。休止角分值計算運用公式：(最小休止角值×15)/休止角值。

1.2.5.4 溶化性測定 在干燥恒重的50 mL離心管中加入精密稱定的顆粒，精密加入沸水至50 mL刻度線，攪拌振搖5 min，3000 r/分鐘離心15 min，棄去上清液，在70 ℃將殘渣烘干至恒重，精密稱定，計算溶化率。溶化率=溶化顆粒質(zhì)量/顆粒質(zhì)量×100%。溶化率分值計算運用公式：(20/最大溶化性值)×溶化性值。

1.2.5.5 吸濕性測定 取一定量的顆粒劑，置30 ℃烘箱中恒重48 h。將底部放有NaCl飽和溶液的玻璃干燥器中定時放入NaCl直到形成NaCl過飽和溶液，此時干燥器內(nèi)的相對濕度為 75%。在已知恒重的小燒杯中放入約10 g參黃顆粒，準(zhǔn)確稱重后置于上述干燥器內(nèi)。48 h后稱量，計算吸濕百分率。共做兩組，計算平均值。吸濕百分率%=(吸濕后重量-吸濕前重量)/吸濕前重量×100%。吸濕率分值計算運用公式：(最小吸濕率值 ×30)/吸濕率值。

1.2.6 驗證性實驗 根據(jù)制備顆粒劑正交試驗的結(jié)果，重復(fù)制備三批顆粒制劑。按處方配比準(zhǔn)確稱取原料，按正交試驗優(yōu)選工藝進行制粒，測定各項評價指標(biāo)，計算綜合評分。

1.2.7 統(tǒng)計與分析 采用正交設(shè)計助手ⅡV3軟件對計算處理后的數(shù)據(jù)進行正交統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 橙皮苷系統(tǒng)適應(yīng)性試驗結(jié)果 試驗結(jié)果見圖1-圖3。結(jié)果，樣品中橙皮苷與相鄰雜峰分離良好，陰性樣品在橙皮苷處無吸收，不干擾參黃顆粒中橙皮苷的含量測定，表明在利用HPLC-UV方法測定參黃顆粒中橙皮苷含量中，該方法的系統(tǒng)適應(yīng)性好。理論塔板數(shù)按橙皮苷計為8132。

圖1 橙皮苷對照品色譜圖Fig 1 Chromatogram of Hesperidin standard

圖2 參黃顆粒劑供試品中中橙皮苷色譜圖Fig 2 Chromatogram of Hesperidin in Shenhuang granules

圖3 陰性樣品中橙皮苷色譜圖Fig 3 Chromatogram of Hesperidin in negative sample

2.2 中藥提取工藝正交實驗結(jié)果 中藥提取工藝正交交試驗結(jié)果及極差分析見表4.1、4.2，影響參黃顆?；亓魈崛⌒Ч囊蛩卮笮∫来螢锳>C>B，最佳組合為A2B2C3，即最佳水提工藝為加9倍水，回流提取3次，每次提取時間1 h。總評分=A1+A2；A1=(橙皮苷/最大橙皮苷含量)×50、A2=(出膏率/最大出膏率)×50；提取工藝驗證：為考察參黃顆粒優(yōu)選工藝的可靠性和穩(wěn)定性，需按照最佳優(yōu)選方案對3批次參黃顆粒水提液進行驗證，結(jié)果表明橙皮苷含量分別為1.005、0.995、1.007 mg/g，出膏率分別為26.08%、25.31%、26.46%，符合預(yù)期設(shè)計。

表4-1 正交實驗結(jié)果Tab 4-1 Orthogonal experiment results

表4-2 方差分析表Tab 4-2 AnOVA table

2.3 成型率測定 成型率測定結(jié)果見表5。

表5 成型性測定結(jié)果Tab 5 Test results of formability

2.4 堆密度測定 堆密度測定結(jié)果見表6。

表6 堆密度測定結(jié)果Tab 6 Measurement results of heap density

2.5 休止角測定 休止角測定結(jié)果見表7。

表7 休止角測定結(jié)果Tab 7 Measurement results of Angle of repose

2.6 溶化性測定 溶化性測定結(jié)果見表8。

表8 溶化性測定結(jié)果Tab 8 Solubility test results

2.7 吸濕性測定 吸濕性測定結(jié)果見表9。

表9 吸濕性測定結(jié)果Tab 9 Results of hygroscopicity measurement

2.8 綜合評價 通過對制備顆粒的成型性、堆密度、休止角、溶化性、吸濕性按一定百分比綜合評價來得出顆粒劑的最終評價得分，綜合評價結(jié)果見表10。

表10 綜合評價結(jié)果Tab 10 Comprehensive evaluation results

2.9 正交試驗結(jié)果及分析 通過正交實驗結(jié)果分析可知，確定各因素與水平的最佳組合應(yīng)為A2B1C2，即最佳制粒工藝為：選用浸膏粉∶可溶性淀粉∶糊精∶蔗糖比例為3∶2∶2∶1，用80%乙醇制成軟材，過16目篩制粒，于60 ℃烘干。結(jié)果見表11。

表11 正交實驗結(jié)果Tab 11 Orthogonal experiment results

2.10 成型工藝驗證 取1.2.1項下制得的干浸膏粉，按照選出的成型工藝平行操作制備三批顆粒劑，按照上述制備3批顆粒劑，按上述方法綜合評分，計算綜合評分97.18，96.99，97.21，RSD值為0.13%，驗證結(jié)果與正交試驗結(jié)果基本一致，說明提取工藝穩(wěn)定，可行，重復(fù)性好。將上述按最佳方案所制得的顆粒分別取 10 g，加熱水 200 mL，攪拌 5 min，其顆粒基本全部溶化，均符合2020 版《中國獸藥典》二部(附錄8)顆粒劑項下的有關(guān)規(guī)定。

3 討論與結(jié)論

長期以來，由于湯劑易吸收、起效快、療效好、制備方法簡單等特點，一直是中獸醫(yī)臨床的主要用藥形式，歷代中獸醫(yī)在使用中獸藥時，也大多采用湯劑，然而在實際生產(chǎn)應(yīng)用過程中湯劑卻存在很多缺點，比如口味不佳、不易攜帶、不易儲存、保質(zhì)期短等，因此本實驗本著中獸藥制劑向著療效好、質(zhì)量穩(wěn)定可控，便于貯存、攜帶、運輸，使用方便的發(fā)展原則，且適用于工業(yè)生產(chǎn)，故將顆粒劑作為首選劑型[11-12]。

中獸藥復(fù)方的作用與多種成分相關(guān)，用一種評價指標(biāo)篩選參黃顆粒的提取工藝和制備工藝的條件往往不夠全面。出膏率是中成藥制藥行業(yè)提取中一個特有名詞以及重要的質(zhì)量管理指標(biāo)。同時，浸膏是中獸藥藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，是中獸藥制劑制備的中間品，是提取工藝最直觀的產(chǎn)物，對評價一種提取工藝的優(yōu)劣有著重要意義。有效成分是中獸藥復(fù)方發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，但是復(fù)方中的有效成分多且復(fù)雜，若是選取所有的有效成分作為指標(biāo)考核制備工藝顯然無法實現(xiàn)，因此實驗中多采用選取復(fù)方中主藥的有效成分作為指標(biāo)來評價制備工藝的優(yōu)劣[13-14]。在預(yù)試驗階段，選擇對黨參中黨參炔苷進行含量測定，結(jié)果顯示黨參炔苷含量較低，不宜作為參黃顆粒工藝優(yōu)化的定量測定；同時，在預(yù)試驗階段也選擇了熟地黃中毛蕊花糖苷進行含量測定，結(jié)果顯示毛蕊花糖苷含量也較低，且分離度較差，故也不宜作為參黃顆粒工藝優(yōu)化的定量測定；而采用以陳皮中橙皮苷為含量測定指標(biāo)時，結(jié)果表明橙皮苷的峰型較高，分離度和對稱性好，陰性無干擾。最終，確定本試驗通過多因素正交試驗的方法，以橙皮苷含量和浸膏得率為指標(biāo)，考察提取工藝；以顆粒劑成型性、堆密度、休止角、溶化性以及吸濕性進行綜合評價，考察制備工藝。通過綜合評價處理數(shù)據(jù)，以及直觀分析和方差分析，優(yōu)化實驗條件，得到的結(jié)果更為科學(xué)合理。

在對藥材水提后的浸膏進行干燥時，因為采用普通烘干箱烘干所需時間會較長，同時制得的干膏干燥程度不夠，質(zhì)地粘軟，不宜粉碎，此外，整個干燥過程在低溫和非常稀薄的空氣中進行，可避免常見的干燥加工過程中物料熱敏性成分的破壞和易氧化成分等劣變反應(yīng)，處理后的產(chǎn)品活性物質(zhì)(特別是藥用有效成分)保存率高，芳香物質(zhì)揮發(fā)性降低，產(chǎn)品性味濃厚，所以在濃縮到稠浸膏后選用冷凍真空干燥進行干燥處理。同時考慮到藥材水提物粘度大，干膏打粉后極易吸潮結(jié)塊，在制粒過程中產(chǎn)生死顆粒，所以將傳統(tǒng)制粒步驟加以改進，在真空冷凍干燥步驟前向浸膏中加入一定量的可溶性淀粉攪拌均勻，來防止發(fā)生這種問題，結(jié)果表明效果良好。

中藥提取物工藝采用正交試驗法，以橙皮苷及浸膏得率為評價指標(biāo)，篩選出最佳提取工藝為：稱取黨參，熟地，麥冬，木香，茯苓，白術(shù)，陳皮，甘草，加 9倍量回流3次，每次1 h，合并三次提取液，過濾既得。驗證試驗結(jié)果基本一致，該提取方法穩(wěn)定、可行。

以顆粒劑成型性、堆密度、休止角、溶化性以及吸濕性為綜合評價，設(shè)計正交試驗，篩選出最佳制粒工藝為：選用可溶性淀粉、糊精、蔗糖為輔料，浸膏粉：可溶性淀粉：糊精：蔗糖比例為3∶2∶1∶1，用80%乙醇制成軟材，過 16 目篩制粒，于 60 ℃烘干。驗證結(jié)果與正交試驗結(jié)果基本一致，說明提取工藝穩(wěn)定，可行，重復(fù)性好。

根據(jù)以上實驗結(jié)果，確定了參黃顆粒劑的制備工藝：加 9 倍量的水回流提取3次，每次 1 h，合并3次提取液，過濾。取濾液濃縮至相對密度為 2 g/mL的清膏，鋪平冷凍干燥圓盤(3 mm厚度，多次少量)，減壓冷凍干燥(-50 ℃以下，0.0001Mpa)至恒重，粉碎成細(xì)粉得干膏粉。以浸膏粉：可溶性淀粉：糊精：蔗糖= 3∶2∶1∶1 的比例，混合均勻，加 80%乙醇制成軟材，過10目篩制粒，60 ℃烘干，整粒后，既得。