楊明珠，陳曉春，張 媛，王秀麗，李俊平

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

豬偽狂犬病是一種由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)感染引起的急性傳染病，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害巨大，主要造成仔豬腹瀉、發(fā)熱、呼吸癥狀、神經(jīng)癥狀、衰竭死亡，生長豬呼吸困難、生長停滯，母豬不育、流產(chǎn)、死亡胎、木乃伊胎，康復(fù)豬可能存在潛伏感染，當(dāng)康復(fù)豬免疫低下，會(huì)存在排毒的風(fēng)險(xiǎn)[1]。2011年以來，偽狂犬病病毒變異株在我國暴發(fā)流行并不斷蔓延全國[2]，研究發(fā)現(xiàn)其致病力顯著增強(qiáng)，傳統(tǒng)疫苗Bartha-K61株不能提供完全的保護(hù)，迫切需要研制出針對(duì)變異株的新型疫苗。同時(shí)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，關(guān)于偽狂犬病的分子生物學(xué)研究取得了很大進(jìn)展。PRV含有多個(gè)復(fù)制非必需區(qū)，容納外源基因的能力強(qiáng)，其中有些基因與病毒的毒力有關(guān)而不參與病毒的復(fù)制[3]，若通過基因工程技術(shù)將PRV的毒力基因失活或者缺失，或者將外源基因插入到PRV基因組中構(gòu)建重組病毒，不僅保持了原病毒的良好抗原性，還可以同時(shí)預(yù)防重組蛋白相關(guān)疫病，起到了一針多防的效果，大大提高生產(chǎn)效率，對(duì)多種病毒的防控具有重要意義。本研究在實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)PRV研究的基礎(chǔ)上將綠色熒光蛋白標(biāo)記基因插入到PRV基因組的UL4-UL3基因間區(qū)域，構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhance green fluorescent protein，EGFP)的重組偽狂犬病毒，并對(duì)其穩(wěn)定性、體外增殖特性進(jìn)行了研究，為下一步構(gòu)建重組偽狂犬活載體疫苗奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 毒株與細(xì)胞 PRV-SX株為中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所在2012年于山西某豬場(chǎng)分離得到的一株高致病性流行毒株；rPRV-bc-8，是以PRV-SX株為基礎(chǔ)構(gòu)建的TK基因突變、US8與US9基因缺失的弱毒株。PK15細(xì)胞由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存。

1.1.2 載體及質(zhì)粒 質(zhì)粒pMD-US6+7-EGFP-US2由實(shí)驗(yàn)室自行制備保存；pESAY-Blunt Simple Cliong kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。全基因合成質(zhì)粒pUC-polyA-UL3訂購于北京六合華大基因科技股份有限公司。

1.1.3 主要試劑 Top10感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒小提試劑盒、質(zhì)粒小提中量試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；Axy Prep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒購自康寧生命科學(xué)有限公司；快捷型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒Ⅱ型購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶SbfI、AflII購自NEB(北京)有限公司；Kod one購自東洋紡(上海)有限公司

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GeneBank上的PRV序列，自行設(shè)計(jì)合成系列擴(kuò)增及鑒定用引物(表1)，用于擴(kuò)增左右同源臂以及鑒定重組病毒。

表1 同源臂擴(kuò)增及鑒定用引物Tab 1 Primers for homology arm amplification and identification

1.2.2 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pMD-UL4-EGFP-UL3的構(gòu)建 利用Axy Prep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒提取PRV-SX株基因組，以其為模板用引物rPUL4F/rPUL4R擴(kuò)增左同源臂UL4基因，連接pEASY-Blunt Zero克隆載體，構(gòu)建pEASY-Blunt-UL4，測(cè)序正確后小提質(zhì)粒備用。將質(zhì)粒pMD-US6+7-EGFP-US2與質(zhì)粒pEASY-Blunt-UL4分別 經(jīng)SbfI/AflII雙酶切，回收目的片段后用T4連接酶連接，獲得轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pMD-UL4-EGFP-US2，再將質(zhì)粒PMD-UL4-EGFP-US2與質(zhì)粒pUC-polyA-UL3經(jīng)SpeI/EcoR I雙酶切，回收相應(yīng)片段后經(jīng)T4連接酶連接，獲得轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pMD-UL4-EGFP-UL3(圖1)，提取高濃度無內(nèi)毒素質(zhì)粒，以備轉(zhuǎn)染。

圖1 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pMD-UL4-EGFP-UL3的構(gòu)建示意圖Fig 1 Schematic diagram of the construction of the transfer plasmid pMD-UL4-EGFP-UL3

1.2.3 重組病毒的獲得 準(zhǔn)備一個(gè)鋪有PK-15細(xì)胞的24孔板，在細(xì)胞密度達(dá)90%左右時(shí)，取rPRV-bc-8病毒液1 μL與2 μL轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pMD-UL4-EGFP-UL3，利用脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，待細(xì)胞病變達(dá)80%以上后于-80 ℃及室溫下凍融兩次收毒。將轉(zhuǎn)染后收集的病毒液接種于鋪有單層PK-15細(xì)胞的六孔板中，吸附1 h，棄去吸附液，每孔加入3 mL含有1%瓊脂與5%FBS的培養(yǎng)液，待培養(yǎng)液凝固后倒置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。接種24 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察，挑選單個(gè)熒光蝕斑于0.5 mL DMEM培養(yǎng)液中，震蕩混勻后繼續(xù)接種于長至單層的PK-15細(xì)胞，如此純化4次后獲得純化病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3。

1.2.4 重組病毒的鑒定 將純化獲得的重組病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3利用DNA/RNA提取試劑盒提取其基因組，用引物PUL3F/PUL3R2進(jìn)行PCR鑒定，同時(shí)將野毒株P(guān)RV-SX株、親本株rPRV-bc-8利用相同的引物擴(kuò)增，比較擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.5 體外增殖實(shí)驗(yàn) 將PRV-SX株、rPRV-bc-8以及rPRV-UL4-EGFP -UL3分別按0.1 MOI接種PK-15細(xì)胞，分別在12、24、32、40、48、56、64、72、80、88、96 h收集感染細(xì)胞，并分別測(cè)定TCID50，比較三種毒株在不同培養(yǎng)時(shí)間下的滴度并繪制增殖曲線。

1.2.6 重組病毒的遺傳穩(wěn)定性 將重組病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3在PK-15細(xì)胞上連續(xù)傳20代，分別提取重組病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3以及第5、10、15、20代重組病毒的DNA，按步驟1.2.4的方法進(jìn)行PCR鑒定。取重組病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3以及第20代重組病毒進(jìn)行熒光蝕斑觀察。

1.2.7 熒光蛋白濃度的測(cè)定 將親本株rPRV-bc-8、重組病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3分別按0.1 MOI接種PK-15細(xì)胞，分別在12、24、32、40、48、56、64、72、80、88、96 h收集感染細(xì)胞，離心取上清后通過分子熒光光譜儀進(jìn)行熒光蛋白濃度的測(cè)定并繪制曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建 質(zhì)粒pEASY-Blunt-UL4經(jīng)SbfI/AflII雙酶切，切出997 bp和3956 bp兩個(gè)片段(圖2)，與預(yù)期大小一致，經(jīng)測(cè)序確定結(jié)果與理論序列一致，表明質(zhì)粒pEASY-Blunt-UL4構(gòu)建成功；pMD-UL4-EGFP-US2經(jīng)SbfI/AflII雙酶切，得到大小約為997 bp和5261 bp的兩個(gè)片段(圖3)，與預(yù)期大小一致，經(jīng)測(cè)序確定結(jié)果與理論序列一致，表明質(zhì)粒pMD-UL4-EGFP-US2構(gòu)建成功。質(zhì)粒pMD-UL4-EGFP-UL3經(jīng)SpeI/EcoR I雙酶切得到大小約為1166 bp和5226 bp的兩個(gè)片段(圖4)，與預(yù)期大小一致，經(jīng)測(cè)序確定結(jié)果與理論序列一致，表明質(zhì)粒pMD-UL4-EGFP-UL3構(gòu)建成功。

M: BM2000 DNA Marker；1：質(zhì)粒pMD-UL4-EGFP-UL3圖2 pEASY-Blunt-UL4的Sbf I/Afl II雙酶切產(chǎn)物Fig 2 The double enzyme digestion results of pEASY-Blunt-UL4

M: BM2000 DNA Marker；1：質(zhì)粒pMD-UL4-EGFP-US2圖3 pMD-UL4-EGFP-US2的Sbf I/Afl II雙酶切產(chǎn)物Fig 3 The double enzyme digestion results of pMD-UL4-EGFP-US2

M: BM2000 DNA Marker；1：質(zhì)粒pMD-UL4-EGFP-UL3圖4 pMD-UL4-EGFP-UL3的Spe I/ EcoR I雙酶切產(chǎn)物Fig 4 The double enzyme digestion results ofpMD-UL4-EGFP-UL3

2.2 重組病毒的純化 將轉(zhuǎn)染所收的病毒液接種于鋪有單層PK-15細(xì)胞的六孔板，培養(yǎng)24 h后在倒置熒光顯微鏡下便能觀察到綠色熒光(圖5)，初步判斷重組毒構(gòu)建成功。挑選單個(gè)熒光蝕斑于0.5 mL DMEM培養(yǎng)液中，震蕩混勻后繼續(xù)接種于長至單層的PK-15細(xì)胞，如此純化4次后獲得純化病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3(圖6)。

圖5 培養(yǎng)24 h后產(chǎn)生的綠色熒光(10×10)Fig 5 Green fluorescence after 24 h incubation(10×10)

圖6 純化得到的重組病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3Fig 6 Purified recombinant virus rPRV-UL4-EGFP-UL3

2.3 重組病毒的鑒定 取200 μL重組病毒液利用DNA/RNA提取試劑盒提取其基因組，利用引物PUL3F/PUL3R2進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示rPRV-UL4-EGFP-UL3擴(kuò)增得到大小約為1710 bp的條帶，野毒株P(guān)RV-SX與親本毒rPRV-bc-8分別用相同的引物擴(kuò)增得到同樣的大小約為374 bp的條帶(圖7)。經(jīng)測(cè)序證明重組病毒基因組序列正確。

M: BM2000 DNA Marker；1：rPRV-UL4-EGFP-UL3；2：PRV-SX；3：rPRV-bc-8；4：Negative control圖7 重組病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3的PCR擴(kuò)增鑒定電泳圖Fig 7 Identification of recombinant virus rPRV-UL4-EGFP-UL3 by PCR

2.4 重組病毒的生長特性分析

2.4.1 體外增殖實(shí)驗(yàn) 將rPRV-bc-8以及rPRV-UL4-EGFP-UL3分別按0.1MOI接種PK-15細(xì)胞，分別在12、24、32、40、48、56、64、72、80、88、96 h收集感染細(xì)胞，并分別測(cè)定TCID50，比較兩種毒株在不同培養(yǎng)時(shí)間下的滴度并繪制增殖曲線(圖8)。結(jié)果表明重組病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3在細(xì)胞內(nèi)的增殖速度較快，接種后12 h內(nèi)滴度始終高于親本毒rPRV-bc-8，接種后40 h達(dá)到最高滴度108.3TCID50/mL，但是最高滴度的出現(xiàn)時(shí)間晚于親本毒，親本毒rPRV-bc-8于32 h達(dá)到最高滴度108.4TCID50/mL。重組病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3的病毒滴度平臺(tái)期較短，到達(dá)平臺(tái)后滴度下降的比親本毒快。

圖8 重組病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3與親本毒rPRV-bc-8感染PK15細(xì)胞的一步生長曲線Fig 8 One-step growth curve of recombinant virus rPRV-UL4-EGFP-UL3 and parental virus rPRV-bc-8 infecting PK15 cells

2.4.2 重組病毒的遺傳穩(wěn)定性 將重組病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3在PK-15細(xì)胞上連續(xù)傳20代，分別提取第5、10、15、20代重組病毒的DNA，以其為模板用引物PUL3F/PUL3R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，結(jié)果均擴(kuò)增得到大小約為1710 bp的目的條帶(圖9)。取重組病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3以及第20代重組病毒進(jìn)行熒光 蝕斑觀察，結(jié)果顯示重組病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3以及第20代重組病毒蝕斑大小相近，熒光亮度相似(圖10)，表明重組病毒能夠穩(wěn)定遺傳。

2.4.3 熒光蛋白濃度的測(cè)定 將親本株rPRV-bc-8、重組病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3分別按0.1MOI接種PK-15細(xì)胞，分別在12、24、32、40、48、56、64、72、80、88、96 h收集感染細(xì)胞，離心取上清后通過分子熒光光譜儀進(jìn)行熒光蛋白濃度的測(cè)定并繪制曲線(圖11)。結(jié)果表明重組病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)EGFP蛋白的水平在感染細(xì)胞56 h后達(dá)到最高，熒光蛋白濃度達(dá)4793.9 ng/mL，之后進(jìn)入蛋白表達(dá)平臺(tái)期。

M:BM5000+ DNA Marker；1：rPRV-UL4-EGFP-UL3；2:rPRV-UL4-EGFP-UL3(P5);3:rPRV-UL4-EGFP-UL3(P10);4:rPRV-UL4-EGFP-UL3(P15);5:rPRV-UL4-EGFP-UL3(P20);6：PRV-SX；7：rPRV-bc-8；8：Negative control圖9 重組病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3各代次PCR擴(kuò)增鑒定電泳圖Fig 9 Identification of several generation of recombinant virus rPRV-UL4-EGFP-UL3 by PCR

圖10 第20代重組病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3感染PK15細(xì)胞Fig 10 The 20th generation recombinant virus rPRV-UL4-EGFP-UL3 infects PK15 cells

圖11 綠色熒光蛋白濃度測(cè)定結(jié)果圖Fig 11 Graph of green fluorescent protein concentration measurement results

3 討 論

豬偽狂犬病是危害我國養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病，其弱毒疫苗自使用以來免疫保護(hù)效果良好且應(yīng)用廣泛，是理想的重組病毒載體。近年來，隨著對(duì)PRV分子生物學(xué)研究的深入，其作為重組病毒表達(dá)載體的類型越來越豐富，單毒力基因缺失及多毒力基因共缺失株的構(gòu)建為疫苗株的安全性提供了保障，同時(shí)通過對(duì)PRV基因組上復(fù)制非必需區(qū)進(jìn)行深入研究，可供外源基因插入的大量位點(diǎn)也逐漸被發(fā)掘，并通過多種成熟的重組技術(shù)，如傳統(tǒng)同源重組技術(shù)、構(gòu)建PRV BAC、構(gòu)建PRV Fosmid文庫以及CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)等，實(shí)現(xiàn)了將多種豬的重大疫病病毒抗原基因作為外源基因成功插入到PRV的非必需區(qū)，如將非洲豬瘟病毒的CD2V蛋白基因插入TK基因區(qū)域[4],將豬流行性腹瀉病毒S蛋白基因和豬輪狀病毒VP7 蛋白基因插入到gE基因區(qū)域[5]，將豬圓環(huán)病毒2型的Cap蛋白基因插入PK-gG基因之間[6]、UL22-UL24基因之間[7]、US4-US6基因之間[8-9]，將高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因插入到gG基因區(qū)域[10]等。

目前還沒有研究顯示PRV基因組上的UL4-UL3基因之間的區(qū)域是否可以作為外源基因插入位點(diǎn)，但在同屬皰疹病毒火雞皰疹病毒的重組活載體疫苗研究中常將UL4-UL3基因之間的區(qū)域作為外源基因的插入位點(diǎn)，并且外源基因在此位點(diǎn)具有良好的表達(dá)效果[11]。因此本實(shí)驗(yàn)選取PRV基因缺失株rPRV-bc-8基因組上的UL4-UL3基因之間的區(qū)域作為外源基因插入位點(diǎn)，利用同源重組技術(shù)成功構(gòu)建了表達(dá)EGFP基因的重組病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3。病毒傳至20代，經(jīng)鑒定及測(cè)序顯示基因位置插入正確且無突變；對(duì)綠色熒光表達(dá)情況的觀察說明EGFP基因能夠成功表達(dá)；重組病毒在PK15細(xì)胞中的生長曲線表示重組病毒所達(dá)到的最高滴度與親本毒無差異，說明外源基因的插入對(duì)重組病毒的增殖影響不大；對(duì)重組病毒的外源蛋白表達(dá)量進(jìn)行了測(cè)定顯示該位點(diǎn)可以有效進(jìn)行外源基因的表達(dá)。因此將PRV基因缺失株rPRV-bc-8基因組上的UL4-UL3基因間區(qū)域作為外源基因插入的位點(diǎn)在理論以及實(shí)踐中是可行的，為下一步相關(guān)重組偽狂犬病毒的研發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。