王小喬，許曉輝*，張虹艷，馮 翀, 2，吳福祥，潘秀麗，李 赟

(1.蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院，蘭州 730050；2.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730050)

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent 1290 UPLC/6460C超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧離子源(美國安捷倫科技有限公司)；Vortex-genie2渦旋混合器(美國Scientific)；H1850離心機(jī)(湖南湘儀)；MS105DU分析天平(梅特勒-托利多)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)；SBL-10DT超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司，功率為300 W)；GENO2010組織研磨儀(美國SPEX)。

1.2 試劑 甲醇、乙腈、乙酸乙酯(色譜純，德國Merck公司)；甲酸、乙酸銨(色譜純，東京化成工業(yè)株式會社)； EMR-Lipid dSPE 凈化管(美國安捷倫科技有限公司)；硫酸鈉、氯化鈉(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。對照品：馬來酸咪達(dá)唑侖(批號：171250-201002；純度：99.9%)、艾司唑侖(批號：171219-201003；純度：99.7%)、奧沙西泮(批號：171229-201505；純度：99.8%)、硝西泮(批號：171217-201403；純度：99.9%)、勞拉西泮(批號：171253-201102；純度：99.2%)、阿普唑侖(批號：171218-201305；純度：99.5%)、氯硝西泮(批號：171227-201404；純度：99.9%)、三唑侖(批號：171230-201203；純度：99.6%)、地西泮(批號：171225-200903；純度：99.9%)均購自中國食品藥品檢定研究院；熊膽粉樣品購自中藥材市場。

1.3 溶液制備

1.3.1 EDTA-Mcllvaine緩沖液 稱取檸檬酸8.4 g，Na2EDTA 19.5 g，磷酸氫二鈉7.1 g，溶于650 mL水中，超聲溶解。

1.3.3 供試品溶液的制備 提取：取熊膽粉樣品適量，研細(xì)，混勻；精密稱取熊膽粉約1 g置于50 mL離心管中，加入3 mL EDTA-Mcllvaine緩沖液，加入1粒陶瓷均質(zhì)子，振蕩搖勻，再加入乙腈10.00 mL，在組織研磨儀上振蕩渦旋5 min，在300 W功率下超聲提取5 min，加入含4 g 硫酸鈉和1 g 氯化鈉的萃取鹽包，再渦旋2 min，在4 ℃下以4000 r/min速率離心15 min，取上清液待凈化。

凈化：精密移取上述上清液2.00 mL于EMR-Lipid dSPE凈化管中，渦旋1 min，在4 ℃下以4000 r/min離心15 min，取上清液過0.22 μm濾膜，供液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件 ACQUITY BEH C18色譜柱(1.7 μm，2.1×100 mm)；流動相：以含0.1 %甲酸-2 mmol/L乙酸銨的水溶液為流動相A，以含0.1%甲酸的乙腈溶液為流動相B，梯度洗脫程序：0～3.0 min，10%～30%B；3.0～5.0 min，30%～90%B；5.0～7.0 min，90%B；7.0～8.0 min，90%～10%B；8.0～9.0 min，10%B。柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量： 2 μL；流速：0.3 mL/min；分析時間：9 min。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電離源：噴射流電噴霧離子源(AJS ESI)；離子源模式：正離子模式；采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)；干燥氣：N2；干燥氣流量：8 L/min；干燥氣溫度：325 ℃；霧化氣壓力：45 psi；毛細(xì)管電壓：4000 V；鞘流氣流量：12 L/min；鞘流氣溫度：350 ℃，相關(guān)質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇 本實驗分別選擇甲醇、乙腈、乙酸乙酯為提取溶劑，以相同水平濃度的9種目標(biāo)分析物加標(biāo)對應(yīng)回收率為依據(jù)，按照1.3.3和1.4項下條件進(jìn)行前處理和上機(jī)分析，考察提取溶劑的提取效果。結(jié)果表明，以甲醇為提取溶劑時，回收率處于15%～56%之間，且大多數(shù)目標(biāo)分析物的回收率小于40%；以乙酸乙酯為提取溶劑時，回收率處于51%～180%之間，且除硝西泮之外，其余目標(biāo)分析物回收率普遍偏高；以乙腈為提取溶劑時，目標(biāo)分析物的回收率整體較好，這可能是乙腈對目標(biāo)分析物具有較好的溶解性，同時能很好地沉淀蛋白質(zhì)，去除雜質(zhì)比較充分，整體上降低了基質(zhì)的干擾(圖1)。因此，最終選擇乙腈為提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑對9種苯二類藥物提取效率的影響Fig 1 Influence of different extraction solvents on theextraction efficiency of nine benzodiazepine drugs

2.1.2 凈化方法的選擇 由于熊膽粉樣品基質(zhì)中含有較多熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸、膽酸、去氧膽酸及少量脂肪和蛋白質(zhì)，這些類別的雜質(zhì)會在提取過程中進(jìn)入提取液，在分析目標(biāo)化合物時會產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，對檢測結(jié)果造成干擾，這些雜質(zhì)大部分是脂溶性的，因此需要采用高脂類凈化方式來除雜，而增強(qiáng)型脂質(zhì)去除分散固相萃取凈化管(EMR-Lipid dSPE)是專門為多脂樣品中脂質(zhì)性雜質(zhì)的選擇性凈化而設(shè)計，因此，本實驗選擇EMR-Lipid dSPE方式進(jìn)行凈化。

2.2 色譜質(zhì)譜條件優(yōu)化

表1 9種苯二類藥物檢測離子對及相關(guān)參數(shù)Tab 1 Ion pairs and related parameters for nine benzodiazepine drugs

2.3 基質(zhì)效應(yīng) 本實驗通過取空白樣品，按照前處理方法制備成空白樣品基質(zhì)溶液，再分別用空白樣品基質(zhì)溶液與純?nèi)軇┡渲瞥上嗤瑵舛鹊膶φ掌啡芤?，以兩者同一藥物質(zhì)譜響應(yīng)值比值的百分?jǐn)?shù)來評價基質(zhì)效應(yīng)(Matrix Effect，ME)，若ME大于100%，則存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；若ME小于100%，則存在基質(zhì)抑制效應(yīng)；若ME接近100%，則不存在基質(zhì)效應(yīng)，本實驗設(shè)計了兩個濃度級別10 ng/mL和30 ng/mL，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，9種化合物在10 ng/mL的條件下，除勞拉西泮存在基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)效應(yīng)外，其余分析物存在一定程度的基質(zhì)抑制效應(yīng)，其中基質(zhì)抑制效應(yīng)最強(qiáng)的是咪達(dá)唑侖和硝西泮；在30 ng/mL的濃度下，艾司唑侖、奧沙西泮、阿普唑侖存在一定程度的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，其余待測物存在不同程度的基質(zhì)抑制效應(yīng)。雖然各待測物存在不同程度的基質(zhì)效應(yīng)，但不影響檢測結(jié)果(圖2)。

圖2 9種苯二類藥物的基質(zhì)效應(yīng)Fig 2 Matrix effect of nine benzodiazepine drugs

表2 9種苯二類藥物的線性關(guān)系、檢出限和定量限Tab 2 Linear relationship, LOD and LOQ of nine benzodiazepine drugs

2.5 回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差考察 取空白樣品，分別按10、50、100 μg/kg 添加3個水平的混合對照品溶液，考察方法的回收率和日間、日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。每個添加水平制備平行樣6份，在1.3.3項和1.4項條件下進(jìn)行前處理和上機(jī)分析，計算相應(yīng)的回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative Standard Deviation，RSD)，結(jié)果顯示，在3個加標(biāo)水平下，9種目標(biāo)分析物的加標(biāo)平均回收率為69.1%～108.0%，日內(nèi)RSD為1.8%～9.0%，日間RSD為2.6%～9.3%(表3)。

表3 9種苯二類藥物的平均回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Tab 3 Average recovery and RSD of nine benzodiazepine drugs(n=6)

3 討論與結(jié)論