王光娥

(廣西南寧市桃源獸藥廠,南寧 530104)

右旋糖酐系蔗糖經(jīng)腸膜狀明串珠菌L.-M-1226(Leuconostocmesenteroides)發(fā)酵后生成的高分子葡萄糖聚合物，經(jīng)處理精制而得[1]。是一種血容量補(bǔ)充藥，也是生產(chǎn)右旋糖酐鐵的一種主要原料，目前收載的原料品種有右旋糖酐20、右旋糖酐40、右旋糖酐70等，《中國(guó)藥典》[2]和《中國(guó)獸藥典》[1]均未收載相關(guān)右旋糖酐原料的含量測(cè)定方法，右旋糖酐原料除分子量與分子量分布系數(shù)要符合規(guī)定之外，其糖酐含量也是影響右旋糖酐原料質(zhì)量的一個(gè)重要因素，目前國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)尚未見右旋糖酐原料含量檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。只有《英國(guó)藥典》收載的右旋糖酐鐵注射液[3]項(xiàng)下有右旋糖酐含量的檢測(cè)。參照《英國(guó)藥典》收載的右旋糖酐鐵注射液項(xiàng)下右旋糖酐含量的檢測(cè)方法，采用的是蒽酮-硫酸比色法，利用紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。文獻(xiàn)中有蒽酮-硫酸比色法測(cè)定多糖的研究[4]-[10]，其原理是將多糖氧化成葡萄糖[4]，而右旋糖酐是一種高分子葡萄糖聚合物，可利用D-無(wú)水葡萄糖作為對(duì)照品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，求曲線方程，用線性方程式計(jì)算供試品中葡萄糖含量，并將結(jié)果與0.94相乘[3]而得出右旋糖酐的含量。利用蒽酮-硫酸比色法對(duì)右旋糖酐含量檢測(cè)進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，建立了較為準(zhǔn)確、可靠的一種右旋糖酐原料的含量檢測(cè)方法，已申請(qǐng)發(fā)明專利，并獲得了受理通知書。為右旋糖酐鐵生產(chǎn)企業(yè)嚴(yán)把原料質(zhì)量關(guān)提供了一項(xiàng)可行的質(zhì)量控制方法，為修訂右旋糖酐原料的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器 紫外可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司SP-1920)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司HH-4)。

1.2 試劑與材料 國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)D-無(wú)水葡萄糖化學(xué)對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院110833-201707，含量99.9%)；濃硫酸(重慶萬(wàn)盛川東化工有限公司20190101)；蒽酮(上海五聯(lián)化工廠出品);右旋糖酐20樣品(四川新開元制藥有限公司、山東金洋藥業(yè)有限公司等)。

1.3 試驗(yàn)方法 取右旋糖酐原料0.2 g，精密稱定，置500 mL量瓶中，加水振搖使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取10 mL，置100 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻；精密量取3 mL于試管中，放入冰水中冷卻至0 ℃。加入6 mL預(yù)冷至0 ℃的0.2% W/V蒽酮硫酸溶液混勻，立刻將試管浸入沸騰的水浴鍋中加熱12分鐘，取出，冷卻后在625 nm[3]下測(cè)吸光度。另精密稱取D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品約20 mg，加水稀釋至50 mL，搖勻后，再分別精密量取0、1、2、3、4 mL稀釋至25 mL，然后各取3 mL于試管中，自“放入冰水中冷卻至0 ℃”起同法操作，以葡萄糖濃度與吸光度來(lái)建立線性方程。用線性方程式計(jì)算供試品中葡萄糖含量，并將結(jié)果與0.94相乘[3]，即得供試品中右旋糖酐含量。

1.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的確認(rèn) 精密稱取D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品與糖酐20樣品，分別加水稀釋，使對(duì)照品與樣品的濃度均在0.04 mg/mL左右，搖勻。分別精密量取3 mL于試管中，放入冰水中冷卻至0 ℃。加入6 mL預(yù)冷至0 ℃的0.2% W/V蒽酮硫酸溶液混勻，立刻將試管浸入沸騰的水浴鍋中加熱12分鐘，取出，冷卻后，在500 nm～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)[3]進(jìn)行光譜掃描，確定最大吸收值的測(cè)定波長(zhǎng)。

1.5 線性范圍與相關(guān)系數(shù) 精密稱取D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品約20 mg，加水稀釋至50 mL，搖勻后，再分別精密量取0、1、2、3、4 mL加水稀釋至25 mL。然后各取3 mL于試管中，放入冰水中冷卻至0 ℃。加入6 mL預(yù)冷至0 ℃的0.2% W/V蒽酮硫酸溶液混勻，立刻將試管浸入沸騰的水浴鍋中加熱12 min，取出，冷卻后，在625 nm下測(cè)定吸光度。按對(duì)照品的取樣量、含量、稀釋倍數(shù)計(jì)算出各對(duì)照品的濃度值(mg/mL)，從低濃度到高濃度依次檢測(cè)，以濃度為橫坐標(biāo)，測(cè)得的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求線性方程和相關(guān)系數(shù)。

1.6 樣品含量測(cè)定 精密稱取右旋糖酐20約0.2 g，加水稀釋至500 mL，按1.3項(xiàng)方法操作，在625 nm處測(cè)定吸收值，代入線性方程，計(jì)算出葡萄糖含量，并將結(jié)果與0.94相乘[3]，即得供試品中右旋糖酐含量。

1.7 加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知右旋糖酐含量的樣品四份，各平行做三份樣品，加水溶解再取各平行樣下溶液，加已知濃度的D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液進(jìn)行回收率試驗(yàn)：精確稱取右旋糖酐20原料約0.2 g，用水稀釋至500 mL，取此溶液10 mL再稀釋至100 mL。另取此溶液10 mL，分別加入上述定容至50 mL(0.4016 mg/mL)的D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液1、2、4、6 mL，再加水稀釋至100 mL。各取3 mL稀釋后的溶液于試管中，放入冰水中冷卻至0 ℃。分別加入6 mL預(yù)冷至0 ℃的0.2% W/V蒽酮硫酸溶液混勻，立刻將試管浸入沸騰的水浴鍋中加熱12 min，取出，冷卻后在625 nm[3]下測(cè)吸光度，另用3 mL水代替稀釋后的藥液重復(fù)測(cè)定，做空白對(duì)照。加入對(duì)照品溶液的濃度即按對(duì)照品的取樣量、含量、稀釋倍數(shù)計(jì)算出來(lái)的各濃度值(mg/mL)，樣品的濃度為實(shí)際測(cè)得的濃度值，并取三份平行樣的平均值和加入對(duì)照品的量來(lái)求回收率與回收率的批間RSD值。

1.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取不同生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的右旋糖酐20原料共六批次，各批次做2 份平行樣，依1.3試驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)，求相對(duì)偏差。

1.9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試溶液在冷卻后檢測(cè)，在分別放置0.5、1、1.5、2.0 h時(shí)，再次取供試液進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，驗(yàn)證供試溶液放置時(shí)間的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng) 精密取D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品(110833-201707，含量99.9%)0.0011 g，加水稀釋至25 mL(即0.044 mg/mL)，搖勻；精密稱取糖酐20樣品約0.0043 g，加水稀釋至100 mL(即約0.043 mg/mL)，搖勻。依法處理樣品，在500 nm-700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果對(duì)照品和樣品均在625±1 nm內(nèi)有最大吸收，與英國(guó)標(biāo)準(zhǔn)用的波長(zhǎng)一致，故確認(rèn)檢測(cè)波長(zhǎng)為625 nm。見圖1、圖2。

圖1 對(duì)照品的光譜曲線圖Fig 1 Spectral curve of reference substance

圖2 樣品的光譜曲線圖Fig 2 Spectral curve of the sample

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 濃度在0.0161-0.0642 mg/mL范圍內(nèi)，在625 nm處檢測(cè)，測(cè)定的吸光度與濃度呈線性相關(guān)，其線性方程為A=14.15C+0.0009，相關(guān)系數(shù)r=0.9997。

檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液各不同濃度測(cè)得的吸光度Tab 1 Absorbance measured at different concentrations of D-anhydrous glucose reference solution

將以上數(shù)據(jù)以D-無(wú)水葡萄糖濃度為X軸，吸光度為Y軸進(jìn)行回歸分析，其回歸曲線，見圖3.

圖3 D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig 3 Standard curve of D-anhydrous glucose reference

2.3 樣品含量測(cè)定 取樣品(右旋糖酐20原料)約0.2 g三份，精密稱定，按1.6項(xiàng)方法操作，樣品含量為97.2%(RSD=0.08%)。結(jié)果見表2.

表2 樣品檢測(cè)結(jié)果Tab 2 Sample test results

2.4 回收率實(shí)驗(yàn) 取已知右旋糖酐含量(97.2%)的原料樣品，加入D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液，即濃度分別為0.0040 mg/mL，0.0080 mg/mL，0.0161 mg/mL，0.0241 mg/mL，按1.7項(xiàng)下方法操作，將測(cè)得的濃度與已知濃度(原料+對(duì)照品)用XLS工作表計(jì)算相應(yīng)回收率，其結(jié)果在100.1%～100.9%，平均回收率為100.5%，回收率的批間RSD值為0.35%。檢測(cè)結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Experimental results of sample addition and recycling

以在樣品中添加的對(duì)照品濃度(單位為mg/mL)為X軸；以實(shí)際測(cè)得的濃度(單位為mg/mL)為Y軸進(jìn)行回歸分析，其回歸曲線見圖4。

圖4 樣品中添加對(duì)照品濃度與實(shí)際測(cè)得的濃度回收曲線圖Fig 4 Recovery curve of the concentration of standard substance added to the sample and the actual measured concentration

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 各樣品檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)偏差在0.04%～0.31%，均小于0.5%，符合《獸藥檢驗(yàn)操作規(guī)范》[12]要求，證明檢測(cè)結(jié)果可靠，其含量均在95%以上。測(cè)試結(jié)果見表4。

表4 樣品重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab 4 Sample repeatability test results

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 溶液放置2 h后含量下降約0.7%，測(cè)試溶液基本穩(wěn)定，但建議冷卻后及時(shí)測(cè)定。測(cè)試結(jié)果見表5。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab 5 Stability test results

3 討論與結(jié)論

3.1 0.2% W/V蒽酮硫酸溶液的配制 蒽酮試劑見光易分解,所用試劑最好現(xiàn)用現(xiàn)配。先將硫酸與水混勻(硫酸∶水=19∶1 v/v)放入冰浴中冷卻，再將稱好的蒽酮加入，攪拌使溶解完全即可。否則，容易出現(xiàn)顏色偏深現(xiàn)象或者放置時(shí)間略長(zhǎng)，顏色明顯加深。

3.2 沸水浴方法的選擇 因用分光光度法測(cè)定，隨著沸水浴時(shí)間的延長(zhǎng)，測(cè)定液顏色會(huì)隨之加深，直接影響最終檢測(cè)結(jié)果。假如按每個(gè)樣都加熱至沸騰后開始計(jì)時(shí)，容易造成人為因素引起誤差。直接設(shè)置水浴鍋為100 ℃，保持沸騰狀態(tài)，從放入試管即開始計(jì)時(shí)到取出為止，檢測(cè)結(jié)果平行性好，精密度高。

3.3 沸水浴時(shí)間的選擇 分別選擇了5、10、12、15 min進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，結(jié)果平均回收率為 87.9%、92.83%、100.5%、103.7%。故選擇了沸水浴時(shí)間為12 min，平行性好，回收率最接近100%。

3.4 適用性 因右旋糖酐20、右旋糖酐40、右旋糖酐70只是重均分子量的不同，均系蔗糖經(jīng)腸膜狀明串珠菌L.-M-1226號(hào)菌(Leuconostocmesenteroides)發(fā)酵后生成的高分子葡萄糖聚合物，經(jīng)處理精制而得。故對(duì)各種右旋糖酐原料的含量檢測(cè)均適用。

3.5 質(zhì)量控制指標(biāo) 因使用不同供應(yīng)商生產(chǎn)的右旋糖酐原料生產(chǎn)出來(lái)的右旋糖酐鐵產(chǎn)品存在質(zhì)量差異。經(jīng)抽取不同廠家提供的不同批次的右旋糖酐樣品進(jìn)行含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，有的含量在85%左右，有的含量達(dá)98%以上。而使用含量高的右旋糖酐原料生產(chǎn)出來(lái)的產(chǎn)品質(zhì)量會(huì)更好。故認(rèn)為糖酐含量也是影響右旋糖酐原料質(zhì)量的一個(gè)重要因素。目前右旋糖酐的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法項(xiàng)下尚無(wú)糖酐含量的檢測(cè)項(xiàng)，為了進(jìn)一步提高右旋糖酐鐵的產(chǎn)品質(zhì)量，企業(yè)可增加右旋糖酐原料的糖酐含量檢測(cè)項(xiàng)，嚴(yán)把原料質(zhì)量關(guān)，建議控制右旋糖酐原料含量在95%以上。

試驗(yàn)參照了《英國(guó)藥典》收載的右旋糖酐鐵注射液項(xiàng)下的糖酐含量檢測(cè)方法，在其基礎(chǔ)上進(jìn)行了步驟細(xì)化和實(shí)驗(yàn)條件改進(jìn)，并用在了右旋糖酐原料的含量檢測(cè)上，線性良好，回收率高，精密度高，具有創(chuàng)新性，可用于右旋糖酐原料的質(zhì)量控制。