謝成茂，周 琦

卵巢癌是死亡率最高的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴(yán)重影響生命健康，但目前其發(fā)病機(jī)制仍不明確。脂肪酸是細(xì)胞代謝的能量貯存物質(zhì)，在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化及增殖過程中起到了重要作用，與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1 (ATP binding cassette transporter A1, ABCA1)是1996年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因，在體內(nèi)脂質(zhì)代謝過程中起到了關(guān)鍵的限速作用，與多種腫瘤關(guān)系密切。但是目前關(guān)于ABCA1與卵巢癌之間的關(guān)系并不清楚，國內(nèi)外未見有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究旨在探討ABCA1與卵巢癌之間的關(guān)系，為卵巢癌診治提供潛在的靶點(diǎn)及理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇北京婦產(chǎn)醫(yī)院2016-01至2020-12住院手術(shù)患者，選取卵巢癌106例作為卵巢癌組，良性卵巢上皮性腫瘤106例作為對(duì)照組。入選標(biāo)準(zhǔn)為：臨床診斷為卵巢癌及良性卵巢上皮性腫瘤患者；年齡15～80歲，體重指數(shù)在19～25 kg/m，非素食患者；無手術(shù)禁忌。排除標(biāo)準(zhǔn)為：入院之前已行放、化療患者；伴其他系統(tǒng)惡性腫瘤患者；伴糖尿病及其他內(nèi)分泌疾病以及嚴(yán)重的胃腸道、心肺及肝臟疾病患者。血液標(biāo)本于次日晨收集4 ml空腹外周血用于血脂含量檢測(cè)；組織標(biāo)本于手術(shù)切除后立即收集，其中一份固定于甲醛中制作石蠟切片，另一份保存于液氮中用于蛋白質(zhì)的提取。所有患者術(shù)后均經(jīng)病理科檢查證實(shí)。所取標(biāo)本已與患者及家屬簽署知情同意書，且經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過。

1.2 材料 SDS蛋白提取液購自美國Invitrogen公司。小鼠抗人ABCA1及β-actin單克隆抗體購自美國Abcam公司，羊抗鼠二抗、BCA檢測(cè)試劑盒、免疫組化SP劑盒及DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司。其他Western-blot電泳和轉(zhuǎn)膜及封閉試劑購于北京索萊寶科技有限公司。

1.3 血脂檢測(cè) 常規(guī)收集兩組患者空腹時(shí)肘靜脈血4 ml，4℃1000 r/min，離心5 min，吸取上層血清，加入 HVE-505400型全自動(dòng)生化分析儀。采用CHOD-PAP法測(cè)定血液中總膽固醇(CHO)濃度，甘油激酶氧化法測(cè)定三酰甘油(TG)，一步法測(cè)定低密度脂蛋白(LDL)與高密度脂蛋白(HDL)。

1.4 免疫組化檢測(cè)ABCA1表達(dá) 采用SP法檢測(cè)卵巢癌及良性卵巢上皮性腫瘤組織中ABCA1的表達(dá)情況。嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，用PBS代替一抗作空白對(duì)照。ABCA1一抗稀釋濃度為1∶200，二抗稀釋濃度為1∶1000。以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核呈棕黃色或棕褐色為陽性。

1.5 蛋白提取及Western-Blot檢測(cè)ABCA1表達(dá) 用SDS Lysis Buffer提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法檢測(cè)總蛋白濃度，取20μg蛋白樣品與6×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣緩沖液按5∶1比例混勻煮沸變性10 min，SDS-PAGE電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，5%牛奶封閉2 h，一抗在4℃冰箱中搖晃孵育過夜、用PBS洗膜，二抗室溫孵育2 h、洗膜，化學(xué)發(fā)光法顯色，膠片曝光適當(dāng)時(shí)間，經(jīng)顯影、定影后，掃描讀取各組條帶灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 臨床特征與脂質(zhì)水平 兩組患者的年齡及BMI比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(>0.05，表1)，具有可比性。卵巢癌組的血脂水平顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05，表1)。

2.2 免疫組化檢測(cè)ABCA1在卵巢癌及良性卵巢上皮性腫瘤組織中表達(dá)情況 免疫組化結(jié)果顯示ABCA1在卵巢癌及良性卵巢上皮性腫瘤組織中均存在表達(dá)，但在卵巢癌組織(圖1A)中表達(dá)量明顯高于良性卵巢上皮性腫瘤組織(圖1B、C)，空白對(duì)照組(圖1D)中未見陽性表達(dá)結(jié)果。我們進(jìn)一步用Western-blot檢測(cè)ABCA1在卵巢癌及對(duì)照組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，卵巢癌組的表達(dá)量(0.15±0.02)明顯高于對(duì)照組(0.06±0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.01，圖2)。

2.3 ABCA1表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系 所有卵巢癌患者的中位隨訪時(shí)間是53.0個(gè)月[95%CI:(50.2～54.1)個(gè)月]。ABCA1陽性表達(dá)組的中位總生存期為48.0個(gè)月[95%CI: (45.9～51.5)個(gè)月]，其1、3、5年的總生存率分別是 100.0%、91.8%、54.1%。ABCA1陰性表達(dá)組的中位總生存期為57.0個(gè)月[95%CI:(54.7～58.9)個(gè)月]，其1、3、5年的總生存率分別是100.0%、 100.0%、 84.4%。 Kaplan-Meier生存曲線圖分析顯示，ABCA1陰性表達(dá)組患者的總生存率顯著高于陽性表達(dá)組(<0.01，圖3)。

3 討 論

癌細(xì)胞需要持續(xù)的能量供應(yīng)以滿足其增殖、分化及侵襲，而癌基因則積極地調(diào)控體內(nèi)能量代謝以提供能量。近些年來，脂質(zhì)代謝異常逐漸被認(rèn)為是惡性腫瘤細(xì)胞的一個(gè)共同特征，可為惡性腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移提供能量，同時(shí)提供細(xì)胞膜所需的組成成分和相應(yīng)的信號(hào)調(diào)節(jié)傳導(dǎo)通路。研究證實(shí)脂質(zhì)代謝的失調(diào)與癌癥的發(fā)生顯著相關(guān)，尤其是乳腺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌及前列腺癌等。卵巢癌有轉(zhuǎn)移至大網(wǎng)膜的明顯傾向，而大網(wǎng)膜主要由脂肪細(xì)胞組成。與原發(fā)性卵巢腫瘤相比，大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移腫瘤瘤體組織中脂肪酸結(jié)合蛋白4(FABP4)表達(dá)上調(diào)，并在脂肪細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞界面的卵巢癌細(xì)胞中檢測(cè)到FABP4的過表達(dá)。脂質(zhì)代謝在卵巢癌發(fā)病過程中起到了重要作用，其中涉及到多種具有不同代謝功能、不同細(xì)胞定位或組織分布的異構(gòu)體的代謝酶及多種不同的反饋機(jī)制等。卵巢癌患者血液中溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid, LPA)明顯升高，甚至在早期階段就出現(xiàn)異常，同時(shí)體外研究證實(shí)，LPA可以刺激卵巢癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲，在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要的作用。我們研究證實(shí)，卵巢癌患者脂質(zhì)代謝存在異?，F(xiàn)象，其外周血中血脂含量明顯低于卵巢囊腫等卵巢良性腫瘤患者。這些研究表明脂質(zhì)代謝異常在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能起到了重要的作用。

ABCA1是體內(nèi)脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵基因，主要表達(dá)于細(xì)胞膜上，參與細(xì)胞膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)及免疫機(jī)制調(diào)控，長度為149 kb，含有50個(gè)外顯子，其cDNA包含6783個(gè)堿基，它編碼的蛋白質(zhì)分子量為254 kDa，由2261個(gè)氨基酸組成。我們對(duì)ABCA1在卵巢癌組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織中ABCA1的表達(dá)量顯著高于良性卵巢上皮性腫瘤，并且ABCA1的表達(dá)與卵巢癌患者的預(yù)后負(fù)相關(guān)，即ABCA1陽性表達(dá)的卵巢癌患者其預(yù)后較ABCA1陰性表達(dá)患者更差。ABCA1屬于ABC超家族中的一員，是跨膜蛋白的一種，包含兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)、一個(gè)跨膜的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域及兩個(gè)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在正常細(xì)胞中，ABCA1主要是將細(xì)胞內(nèi)的游離膽固醇、磷脂轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外并與載脂蛋白A-1 (apoA-1)結(jié)合，形成扁平高密度脂蛋白(HDL)，后者再接受游離膽固醇和磷脂形成成熟HDL，在維持細(xì)胞膽固醇穩(wěn)態(tài)中的正常作用已得到證實(shí)。在癌細(xì)胞中，ABCA1的作用尚不清楚，但其所調(diào)控的膽固醇是細(xì)胞膜的重要組成部分，對(duì)腫瘤細(xì)胞的快速生長和分裂及遷移具有限速作用，可影響細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和藥物敏感性。ABCA1敲除后對(duì)細(xì)胞生長和遷移起到了明顯的抑制作用，同時(shí)在卵巢癌細(xì)胞系和卵巢癌患者組織樣本中觀察到ABCA1啟動(dòng)子甲基化，并且發(fā)現(xiàn)ABCA1高甲基化的卵巢癌患者生存期明顯縮短。卵巢癌發(fā)病過程中ABCA1被高甲基化與卵巢癌患者的預(yù)后不良相關(guān)，ABCA1在這個(gè)過程中可能起到了促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。

綜上所述，脂質(zhì)代謝與卵巢癌的發(fā)病密切相關(guān)，在其發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。而作為脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵基因ABCA1，在卵巢癌中存在異常高表達(dá)，并可影響卵巢癌患者的預(yù)后，其可能通過調(diào)控體內(nèi)脂質(zhì)代謝而參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。然而，目前關(guān)于ABCA1在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的確切作用機(jī)制尚不明確，需要我們?cè)诤罄m(xù)研究中進(jìn)一步深入的探索。