齊科研，楊 鍇，閆有圣，王一鵬，陰赪宏

據(jù)第二次殘疾人抽樣調(diào)查顯示，我國(guó)聽力殘疾者數(shù)量達(dá)2780萬。其中50%以上病例是由遺傳學(xué)因素所導(dǎo)致的，不合并其他表型的非綜合征性耳聾(non-syndromic hearing impairment，NSHI)占70%。我國(guó)通過近20年大規(guī)模的先天性耳聾分子流行病學(xué)調(diào)查，逐步建立“孕前-產(chǎn)前-出生后”三級(jí)防控體系，為減少聾兒出生或早期干預(yù)提供依據(jù)。多種分子遺傳學(xué)檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用，也極大提高了先天性耳聾患者的檢出率。GJB2基因(間隙連接蛋白2，MIM編號(hào)*121011，又名Connecxin 26，CX26)編碼間隙連接復(fù)合物的一個(gè)重要亞基，幫助相鄰細(xì)胞間形成液體孔隙通道，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的物質(zhì)流通。GJB2基因突變是引起非綜合征遺傳性耳聾最常見的原因，我國(guó)有21%中重度以上NSHI患者攜帶有GJB2基因突變。然而，由于GJB2突變所引發(fā)疾病的異質(zhì)性和表型可變程度很強(qiáng)，需多科室綜合分析，以提供準(zhǔn)確的咨詢意見及再生育指導(dǎo)意見。

本研究納入了4例先天性耳聾家系，對(duì)其進(jìn)行全面臨床表現(xiàn)、家族病史評(píng)估，并利用耳聾基因芯片、全外顯子組測(cè)序技術(shù)進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)，Sanger測(cè)序?qū)μ囟ㄎ稽c(diǎn)驗(yàn)證，從而明確其發(fā)病原因。并且對(duì)新檢出的3個(gè)錯(cuò)義突變所影響的氨基酸進(jìn)行了進(jìn)化保守性分析，4個(gè)病例均與GJB2基因相關(guān)，但卻存在著不同的情況。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 本研究納入2020-05至2022-01于我院產(chǎn)前診斷中心遺傳咨詢門診就診的4例先天性耳聾家系。由患者家屬配合完成臨床信息采集，包括患者基本信息、耳聾病史、出生史、家族史、個(gè)人相關(guān)病史(外傷、耳毒性藥物使用史、感染史)等。全部納入?yún)⑴c者均簽署書面知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 TIANamp Genomic DNA Kit離心柱式血液gDNA提取試劑盒(天根，北京)，十五項(xiàng)遺傳性耳聾基因檢測(cè)試劑盒(博奧晶芯，成都)，xGenExome Research Panel外顯子捕獲試劑盒(IDT，美國(guó))；NovaSeq 6000二代測(cè)序平臺(tái)(Illumina，美國(guó))，晶芯EasyArray3A集成化芯片工作站(博奧晶芯，成都)，晶芯LuxScanDx24微陣列芯片掃描儀(博奧晶芯，成都)，ABI 3730基因分析儀(Thermo Fisher，美國(guó))，Bioanalyzer 2100(Agilent，美國(guó))，ND 2000紫外分光光度計(jì)(Thermo Fisher，美國(guó))。

1.2.2 樣本采集和DNA提取 根據(jù)所采集家系背景資料，以先證者為核心，使用Cyrillic軟件繪制系譜圖。采集每位參與成員3 ml EDTA抗凝血，提取總DNA。取2 μl利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度及純度。

1.2.3 耳聾基因芯片 采用十五項(xiàng)遺傳性耳聾基因突變微陣列診斷芯片對(duì)納入的6名家系成員(包括患者1、患者2及其配偶、患者3及其配偶、患者4)進(jìn)行初篩。該芯片包含了GJB2基因的4個(gè)熱點(diǎn)突變，即35delG、176del16、235delC、299delAT；SLC26A4基因的8個(gè)熱點(diǎn)突變，即IVS7-2A>G、2168A>G、1229C>T、1975G>C、1174A>T、1226G>A、2027T>A和IVS15+5G>A；線粒體DNA(mtDNA)的2個(gè)熱點(diǎn)突變，即1555G>A、1494C>T；以及GJB3基因的538C>T突變。實(shí)驗(yàn)過程中的PCR擴(kuò)增、磁珠捕獲分離、磁珠雜交和結(jié)果檢測(cè)的各部分操作均依據(jù)廠家提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行。

1.2.4 全外顯子組測(cè)序 對(duì)經(jīng)過1.2.2初篩實(shí)驗(yàn)仍無法明確診斷的病例，進(jìn)行全外顯子組測(cè)序分析。用xGenExome Research Panel進(jìn)行外顯子區(qū)序列雜交捕獲，定量熒光PCR的方法測(cè)試文庫富集情況、大小分布及濃度。NovaSeq 6000平臺(tái)完成測(cè)序；Picard v軟件(1.57)去除PCR重復(fù)，軟件(Burrows-Wheeler Aligner)將原始數(shù)據(jù)比對(duì)人類基因組參考序列(GRCh38版本)。Verita TrekkerVariants Detection systemv2.0(貝瑞基因，中國(guó))和Genome Analysis Toolkit軟件進(jìn)行變異calling；再利用ANNOVAR(v 2.0)和EnlivenVariants Annotation Interpretation系統(tǒng)(貝瑞基因，中國(guó))根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)協(xié)會(huì)(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)發(fā)布的通用指南進(jìn)行變異注釋解讀。

1.2.5 Sanger測(cè)序驗(yàn)證 針對(duì)各疑似致病的位點(diǎn)利用Primer 5在線軟件(網(wǎng)址：http://frodo.wi.mit.edu/primer3)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。PCR方法擴(kuò)增，利用Qiagen純化試劑盒對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化；進(jìn)行上機(jī)測(cè)序，系統(tǒng)軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.6 錯(cuò)義變異分析 依據(jù)先前方法，使用MEGA7在線軟件對(duì)新檢測(cè)出的錯(cuò)義變異所影響的氨基酸在各物種間的進(jìn)化保守性進(jìn)行分析，全部參數(shù)為默認(rèn)值。同時(shí)，利用Revel在線軟件對(duì)新錯(cuò)義變異的危害性加以評(píng)分。

2 結(jié) 果

2.1 臨床檢查 患者1，女，5歲，診斷感音神經(jīng)性耳聾(雙耳)、白甲病、掌跖角化?。黄渌黜?xiàng)體征均正常，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室血液檢測(cè)(血常規(guī)、血生化等)未見異常。其父母表型正常，否認(rèn)家族內(nèi)有耳聾等遺傳性疾病患病史，否認(rèn)患兒致聾性外傷、耳毒性藥物使用史、感染史。本例家系圖如圖1A所示?；颊?，女，35歲，出生即診斷先天感音神經(jīng)性耳聾，其他體征無異常；其妹妹同患先天性耳聾；其丈夫，34歲，出生時(shí)聽力正常，2歲左右開始聽力逐漸下降，直至5歲左右耳聾?；颊?，男，2歲，診斷為先天性耳聾、全面發(fā)育落后，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室血液檢測(cè)未見異常。其父母表型均正常。其母親就診時(shí)孕第二胎7周，要求明確患兒遺傳學(xué)診斷，并對(duì)第二胎進(jìn)行產(chǎn)前診斷。本例的家系圖如圖1E所示?；颊?，男，33歲，聽力下降十余年，因備孕來我中心咨詢，要求行遺傳學(xué)診斷。

2.2 遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果 由于耳聾基因芯片的篩查效率有限，不能滿足充分明確遺傳診斷目的，故利用WES檢測(cè)，結(jié)果均以Sanger測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，4個(gè)先天性耳聾病例均與GJB2基因突變相關(guān)，然而其具體情況卻存在各異性。4個(gè)病例的家系圖及遺傳檢測(cè)結(jié)果見圖1；其中，A-B為病例1情況，C-D為病例2，E-F為病例3，G-H為病例4。在病例1中，第II代男性個(gè)體為患者(圖1A)，攜帶GJB2: c.167T>C雜合突變(圖1B)，家系驗(yàn)證證明其為新發(fā)突變。病例2中，患者2攜帶MYO7A: c.1214G>A(圖1C，左側(cè))和MYO7A: c.3545A>G(圖1C，右側(cè))的復(fù)合雜合突變，這兩個(gè)突變均為錯(cuò)義突變，且是未報(bào)道過的新突變；而患者2的丈夫攜帶GJB2: c.299delAT(圖1D，左側(cè))和GJB2: c.235delC(圖1D，右側(cè))的復(fù)合雜合突變，與患者2為不同基因?qū)е碌倪z傳性耳聾。病例3中，患者3(圖1E)存在GJB2: c.257C>G(p.Thr86Arg)(圖1F，左側(cè))和GJB: c.235delC(圖1F，右側(cè))的復(fù)合雜合突變；進(jìn)一步的羊水產(chǎn)前診斷驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)患者3的同胞胎兒攜帶c.257C>G突變，而在c.235delC為野生型，僅為雜合子攜帶者，不會(huì)發(fā)病。在病例4中，患者4存在GJB: c.109G>A (p.Val37Ile)(圖1G)和GJB: c.235delC(圖1H)的復(fù)合雜合突變，這是導(dǎo)致其后天聽力下降的原因。

遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果細(xì)節(jié)見表1。如表所示，本研究檢出3個(gè)與遺傳性耳聾相關(guān)的新突變體，分別為GJB2: c.167T>C，MYO7A: c.1214G>A和MYO7A: c.3545A>G，擴(kuò)展了該疾病的突變譜。

2.3 錯(cuò)義變異分析結(jié)果 本研究檢出3個(gè)新的錯(cuò)義變異，分別是GJB: c.167T>C(p.Leu56Pro)、MYO7A: c.1214G>A(p.Arg405Gln)及MYO7A: c.3545A>G(p.Asn1182Ser)。經(jīng)MEGA軟件分析，這3個(gè)變異體所影響的氨基酸在各物種間保持著高度的進(jìn)化保守性(圖2)。Revel評(píng)分預(yù)測(cè)這3個(gè)新的錯(cuò)義變異均對(duì)蛋白有害(表1)。

3 討 論

遺傳性耳聾在新生兒中的發(fā)病率約為1/1000，該類疾病具有很強(qiáng)的遺傳異質(zhì)性，可涉及上百種基因；其中，非綜合征性遺傳性耳聾約占70%，另外30%為綜合征性耳聾，GJB2的基因突變占據(jù)非綜合征感音神經(jīng)性耳聾常染色體隱性致病原因的近50%；同時(shí)，GJB2突變還可以常染色體顯性形式致病，或造成合并有耳聾表型的綜合征性疾病。最初，Kelsell等報(bào)道了GJB2基因可導(dǎo)致遺傳性耳聾。大量的研究揭示了在不同的種族中，該基因存在不同的熱點(diǎn)突變分布情況，東亞人群中235delC最常見，歐洲和中東地區(qū)35delG最多，W24X在印度人群中最多。從基因型-表型關(guān)聯(lián)角度講，一般的，截短性突變(無義、移碼突變等)會(huì)導(dǎo)致更嚴(yán)重的表型，而氨基酸替代(錯(cuò)義突變等)癥狀較輕。由于GJB2基因有大量頻率較高的突變存在，各個(gè)突變相互組合后可能產(chǎn)生的預(yù)后情況又不盡相同，因此臨床中需格外注意。

在本研究中的4例入組家系，經(jīng)臨床評(píng)估和遺傳檢測(cè)分析后，證明其均存在GJB2的突變，但均有差異。家系1的患兒臨床除了耳聾表型還有白甲病、掌跖角化癥，遺傳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)新發(fā)錯(cuò)義突變GJB: c.167T>C(p.Leu56Pro)，符合常染色體顯性模式。綜合判斷，該患兒特征較符合Bart-Pumphrey綜合征(MIM #148350)。另外，已經(jīng)有過在此突變臨近位置的錯(cuò)義突變導(dǎo)致Bart-Pumphrey綜合征的報(bào)道，佐證了上述判斷。一般情況下，該患兒的父母再次生育受累個(gè)體的概率較低，但不能完全排除父母存在生殖腺細(xì)胞嵌合的情況。家系2中，夫妻雙方雖然均為先天聾人，但兩人屬于在不同的基因上存在復(fù)合雜合突變，孕育先天耳聾患兒的機(jī)會(huì)非常低，不建議依據(jù)雙方所攜帶的突變?nèi)ミM(jìn)行產(chǎn)前診斷，而是采取常規(guī)產(chǎn)檢即可?；颊?攜帶MYO7A基因的兩個(gè)新突變，且其致病性受到生物信息學(xué)分析結(jié)果的支持，這個(gè)發(fā)現(xiàn)擴(kuò)充了該基因的突變譜。家系3為典型的GJB2復(fù)合雜合突變導(dǎo)致常染色體隱性先天性耳聾的情況，對(duì)胎兒羊水細(xì)胞進(jìn)行GJB2基因測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果顯示其帶有c.257C>G雜合突變，應(yīng)當(dāng)為無癥狀攜帶者，建議繼續(xù)妊娠。家系4屬于GJB2復(fù)合雜合突變導(dǎo)致常染色體隱性遲發(fā)性耳聾，這在一定程度上反映了GJB2: c.109G>A突變?cè)谂R床咨詢中的挑戰(zhàn)。由于該突變存在人群頻率高、表型異質(zhì)性強(qiáng)的問題，常與遲發(fā)性耳聾相關(guān)。因此，在臨床咨詢中，應(yīng)當(dāng)就此為患者進(jìn)行詳細(xì)解釋，對(duì)再次妊娠說明情況，尊重夫妻雙方的選擇。

本研究對(duì)4例先天性耳聾相關(guān)病例進(jìn)行了詳細(xì)的遺傳診斷及咨詢，明確了其不同的發(fā)病原因。同時(shí)，檢出了一個(gè)GJB2基因新突變，兩個(gè)MYO7A基因新突變，擴(kuò)充了遺傳性耳聾的突變譜，為后續(xù)研究和臨床診療實(shí)踐奠定了基礎(chǔ)。本研究樣本量較小，無法充分反映GJB2基因相關(guān)耳聾的臨床表型多樣性之全貌，?？漆t(yī)院在監(jiān)控先天性耳聾病例的診療全過程無法覆蓋患者初診、產(chǎn)前篩查及診斷、治療及妊娠處置的全過程，會(huì)造成部分信息丟失。筆者將繼續(xù)關(guān)注該疾病，進(jìn)一步開展研究工作。