項羽羚,譚立明
(1.鷹潭市人民醫(yī)院檢驗科,江西 鷹潭 335000;2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 江西省醫(yī)學(xué)重點實驗室,江西 南昌 330006)
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA),是 一種病因未明的、 以炎性滑膜炎為主的慢性系統(tǒng)性自身免疫病[1-2]。 其主要特征是小關(guān)節(jié)、多關(guān)節(jié)的對稱性、侵襲性關(guān)節(jié)炎癥[3],治療原則主要為早發(fā)現(xiàn)、早治療。經(jīng)典的RA 可以通過實驗室指標(biāo)結(jié)合影像學(xué)和臨床癥狀確診,但RA 變化多樣,部分不典型的早期以及血清學(xué)指標(biāo)陰性的患者常存在漏診、誤診,故需要尋找新的指標(biāo)來完善RA 的診斷。 通過文獻學(xué)習(xí)發(fā)現(xiàn)鈣衛(wèi)蛋白在RA 患者血清及滑膜液中顯著升高[4-5],提示鈣衛(wèi)蛋白可能參與RA 疾病的發(fā)生。 鈣衛(wèi)蛋白是由S100A8 和S100A9 兩種鈣結(jié)合蛋白組成的異源二聚體。 作為一種炎癥性蛋白質(zhì),廣泛存在于中性粒細胞和吞噬細胞中,參與人體生理代謝, 負責(zé)大部分蛋白質(zhì)生物間的相互作用[6-8]。 本研究通過檢測鈣衛(wèi)蛋白在RA 組、非RA 組和健康對照組中表達水平以及鈣衛(wèi)蛋白水平和疾病活動程度之間的聯(lián)系, 評價鈣衛(wèi)蛋白在RA 患者中的診斷價值。 研究RA 與抗突變型瓜氨酸化波形蛋白 (anti-mutant citrullinated vimentin,anti-MCV)、 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)因子(rheumatoid factor,RF)和抗環(huán)瓜氨酸多肽抗體(anti-cyclic citrullinated peptide antibody, anti-CCP)聯(lián)合診斷的價值。 本研究對南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院和鷹潭市人民醫(yī)院183例RA 患者組、144 例非RA 組和48 例健康對照組進行鈣衛(wèi)蛋白、anti-MCV、RF 和anti-CCP 檢測,結(jié)果進行分析和比較,現(xiàn)報告如下。
1.1 一般資料 選取2020年1月至2020年12月在南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院和鷹潭市人民醫(yī)院確診的RA 患者183 例為RA 組,56 例骨關(guān)節(jié)炎(OA)、46 例痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(GA)和42 例強直性脊柱炎(AS)共同組成144 例非RA 組,48 例健康受試者為對照組,所有患者均符合指南診斷標(biāo)準(zhǔn)[9-13]。所有標(biāo)本均知情同意, 并經(jīng)南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院和鷹潭市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。 根據(jù)歐洲風(fēng)濕病聯(lián)合會推薦的RA 疾病活動指數(shù)DAS28 評分[14],將RA 組患者分為四個亞組: 高疾病活動組 (n=42,DAS28>5.1 分)、 中等疾病活動組 (n=48,3.2 分<DAS28≤5.1 分)、 低疾病活動組 (n=39,2.6 分≤DAS28≤3.2 分)、緩解組(n=54,DAS28<2.6 分)。
1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 符合以下所有條件予以納入:(1)簽署知情同意協(xié)議;(2)診斷明確,影像學(xué)、臨床資料完善;(3)無合并其他自身免疫性疾病;(4)健康體檢者檢驗結(jié)果無異常。
1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 符合以下其中之一條件予以排除:(1)患有其他自身免疫性疾?。唬?)患有某些內(nèi)分泌疾??;(3)患有心血管疾?。唬?)妊娠和哺乳期婦女。
1.4 臨床資料 獲取183 例RA 患者組、144 例非RA 組及48 例健康對照組的臨床資料, 包括疾病持續(xù)時間、性別、年齡、晨僵持續(xù)時間、28 腫脹和疼痛關(guān)節(jié)計數(shù)(28-SJC 和28-TJC)、疼痛持續(xù)時間、患者全身模擬評分(100-mmVAS)。
1.5 方法
1.5.1 標(biāo)本采集與保存 采集實驗對象空腹靜脈血3 mL,采用分離凝膠加速采血管收集,靜置30 min,TD6M 臺式低速離心機,2 500 r/min 離心15 min。-80 ℃保存?zhèn)溆?,避免反?fù)凍融。
1.5.2 鈣衛(wèi)蛋白、anti-MCV、RF 和anti-CCP 的定量測定 取出保存血清標(biāo)本,ELISA(上海恒遠生化試劑有限公司) 三重復(fù)檢測鈣衛(wèi)蛋白和anti-MCV水平;全自動特定蛋白儀PA200(深圳市金瑞生物科技有限公司) 速率散射比濁法檢測RF 水平;貝克曼庫爾特AU5800 (中漢盛泰生物技術(shù)有限公司)速率散射比濁法檢測anti-CCP 水平。計算各指標(biāo)的曲線下面積(area under curve,AUC)、 敏感度(sensitivity,Se)、特異度(specificity,Sp)、準(zhǔn)確度(accuracy)、約登指數(shù)(youden index,YDI)、陽性預(yù)測值(positive predict value,PPV)、 陰性預(yù)測值(negative predict value,NPV)、陽性似然比(+LR) 和陰性似然比(-LR)各指標(biāo)。 以上所有操作嚴(yán)格遵守各試劑盒和儀器使用說明書及南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院和鷹潭市人民醫(yī)院檢驗科質(zhì)量管理手冊。
1.6 統(tǒng)計處理采用SPSS 23.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計、處理及分析 計量資料采用K-S 檢驗和Levene's檢驗分別對數(shù)據(jù)正態(tài)性和方差齊性進行檢驗,正態(tài)分布用±s 表示,偏態(tài)分布用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)[M(QR)]的方式表示。多組正態(tài)分布資料比較用One- way ANOVA 檢驗;偏態(tài)分布資料組間水平差異采用非參數(shù)Kruskal-Wallis 檢驗,繪制受試者工作曲線(ROC),利用logistic 回歸模型建立2 個指標(biāo)聯(lián)合,通過曲線下面積(AUC)評估鈣衛(wèi)蛋白診斷RA 的價值; 實驗室相關(guān)檢測指標(biāo)之間相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)分析,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 各組一般資料 與非RA 組和健康對照組相比,RA 組的鈣衛(wèi)蛋白顯著升高(P<0.01)。組間年齡和性別無顯著差異(P>0.05)。 見表1。
表1 各組間基本資料
2.2 不同RF 水平組的RA 組鈣衛(wèi)蛋白水平 不同RF 組的鈣衛(wèi)蛋白水平RA 組根據(jù)RF 的診斷截斷值(20 ng/mL)進一步分為兩個亞組,即RF 水平高于截斷值的RF 陽性組和RF 水平低于RF 截斷值的RF 陰性組。RF 陽性組的鈣衛(wèi)蛋白水平顯著高于RF 陰性組,且均高于健康對照組(P<0.01)。 見表2。
表2 各組鈣衛(wèi)蛋白水平
2.3 RA 組不同活動度鈣衛(wèi)蛋白水平 RA 組中高疾病活動組、中疾病活動組、低疾病活動組、緩解組鈣衛(wèi)蛋白水平分別為 (950.66±117.82)pg/mL、(771.68 ±81.38)pg/mL、 (593.96 ±98.62)pg/mL 和(492.89±207.76)pg/mL, 各組之間的統(tǒng)計差異,見圖1A。 通過Pearson 相關(guān)分析, 鈣衛(wèi)蛋白水平與DAS28 評分呈正相關(guān)(r=0.572,P<0.01),見圖1B。
圖1 A:箱線圖顯示不同RA 活動和健康對照的鈣衛(wèi)蛋白水平。B:鈣衛(wèi)蛋白與DAS28 相關(guān)性.DSA28, 關(guān)節(jié)疾病活動評估之間的相關(guān)性。
2.4 鈣衛(wèi)蛋白、anti-MCV、RF 和anti-CCP 檢測結(jié)果臨床評價 各指標(biāo)中鈣衛(wèi)蛋白的特異性最高,RF的靈敏度最高,anti-MCV 的靈敏度和特異性均比較高,見表3。
表3 鈣衛(wèi)蛋白、anti-MCV、RF 和anti-CCP 檢測結(jié)果臨床評價
2.5 鈣衛(wèi)蛋白結(jié)果的ROC 曲線分析 通過計算得到鈣衛(wèi)蛋白曲線下面積0.844,其95%CI 為0.792~0.897,達到中等診斷價值,對應(yīng)cutoff 值為584 ng/mL,見圖2A、圖2C;鈣衛(wèi)蛋白、anti-MCV、RF 和anti-CCP 聯(lián)合診斷RA 的ROC 曲線見圖2B、圖2D。
圖2 A:鈣衛(wèi)蛋白、anti-MCV、RF 和anti-CCP 診斷RA 的特異性和敏感性B:鈣衛(wèi)蛋白分別聯(lián)合anti-MCV、RF 和anti-CCP 診斷RA 的特異性和敏感性。C:各指標(biāo)的ROC 結(jié)果。D:指標(biāo)聯(lián)合檢測ROC 結(jié)果。95%CI:95%置信區(qū)間。 anti-MCV,抗突變瓜氨酸波形蛋白;RF,類風(fēng)濕因子;anti-CCP,抗環(huán)瓜氨酸多肽抗體;AUC,曲線下面積;ROC,受試者工作特征。
RA 主要的病理特征有關(guān)節(jié)滑膜持續(xù)炎癥性增生、血管翳形成[15],其經(jīng)典實驗室指標(biāo)主要有RF和anti-CCP。 現(xiàn)階段尚無能逆轉(zhuǎn)該病的特效藥,該病嚴(yán)重危害人民的健康,造成巨大的經(jīng)濟負擔(dān)。 鈣衛(wèi)蛋白屬于S100 蛋白家族中的一種[16],主要表達于樹突狀細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞等,在健康人群中就可以檢測出來。 作為一種炎性蛋白,在炎癥期間,主要是從壞死或者活化的中性粒細胞、單核巨噬細胞中釋放,參與多種自身免疫性疾病的致病過程[17-18]。 比如炎性腸病、特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥等,鈣衛(wèi)蛋白主要是通過與晚期糖基化終產(chǎn)物受體和Toll 樣受體-4 結(jié)合而發(fā)揮作用, 同時還可加速骨小梁的構(gòu)建和軟骨基質(zhì)的鈣化。有文獻明確了鈣衛(wèi)蛋白在不同RA 活動度中表達存在差異[19],提示鈣衛(wèi)蛋白很可能參與了RA 的發(fā)病進程。
本研究結(jié)果顯示RA 組鈣衛(wèi)蛋白水平明顯高于非RA 組和健康對照組,非RA 組結(jié)果顯著高于健康對照組,RA 組結(jié)果也明顯高于OA、GA、AS組,表明在炎性關(guān)節(jié)病變中,尤其是RA 患者中鈣衛(wèi)蛋白確有升高,可能與疾病發(fā)生機制相關(guān)。 按照DAS28 評分分組結(jié)果顯示:高疾病活動組、中疾病活動組、低疾病活動組均高于健康對照組,且各組之間具有顯著差異(P<0.05);緩解組和健康對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 說明鈣衛(wèi)蛋白在RA不同活動度中表達存在顯著差異,和RA 疾病發(fā)展進程呈正相關(guān),與Van Hoovels L 等[20]的結(jié)論基本一致,由此可以判斷鈣衛(wèi)蛋白水平可以用于RA 疾病的診斷及病情發(fā)展評估。
將RA 組分成RF 陽性組和RF 陰性組, 比較RF 陽性組、RF 陰性組、 健康對照組和非RA 組鈣衛(wèi)蛋白水平, 結(jié)果顯示RF 陽性組和RF 陰性組鈣衛(wèi)蛋白水平顯著高于健康對照組和非RA 組。 與Bae S.C 等[21]結(jié)論基本相符。 在RF 陽性RA 患者中,RF 和鈣衛(wèi)蛋白水平顯著升高,提示鈣衛(wèi)蛋白可以輔助RF 診斷RA,提高診斷準(zhǔn)確性;在RF 陰性RA 患者中,鈣衛(wèi)蛋白水平升高,提示鈣衛(wèi)蛋白檢測可避免漏診; 同時可以和非RA 組疾病區(qū)分,避免誤診。 鈣衛(wèi)蛋白擬為RF 陰性的RA 患者的診斷增加新的靶點,從而為RA 患者早期診斷、鑒別診斷、發(fā)展進程評估提供新的思路。
經(jīng)ROC 曲線分析,鈣衛(wèi)蛋白、anti-MCV、RF 和anti-CCP 的AUC 面積 分 別 為0.844、0.914、0.894和0.885,anti-MCV 的AUC 面積最高,鈣衛(wèi)蛋白的AUC 面積接近經(jīng)典指標(biāo)RF、anti-CCP,表明鈣衛(wèi)蛋白同經(jīng)典指標(biāo)一樣有較好的診斷價值; 鈣衛(wèi)蛋白聯(lián)合anti-MCV、RF 和anti-CCP 診斷RA 的AUC面積分別為0.953、0.947 和0.917,診斷效能進一步增強,略高于Zhu J 等[22]結(jié)論,可能和試劑廠家不同有關(guān)。 從4 組指標(biāo)臨床評價分析, 當(dāng)截斷值為584ng/mL 時, 鈣衛(wèi)蛋白對RA 診斷的靈敏度和特異性分別為65.67%、89.72%,其中鈣衛(wèi)蛋白的陽性預(yù)測值(0.909)、陽性似然比(6.669)、特異性(89.72%)均高于其他3 組,陽性預(yù)測價值較高;RF 的靈敏度為88.53%、陰性預(yù)測值為0.806,均高于其他3 組,陰性預(yù)測價值較高, 但RF 在老年人和其他自身免疫性疾病患者血清中也會升高,造成其特異性不高[23-24];anti-MCV 的約登指數(shù)為0.675,高于其他3 組,診斷價值較高。 Van Hoovels L 等[25]研究指出, 鈣衛(wèi)蛋白可以在經(jīng)典指標(biāo)RF 和anti-CCP 陰性情況下顯著升高,具有很高的特異性,通過聯(lián)合診斷,可以提高RA 的診斷效能。
綜上所述,鈣衛(wèi)蛋白檢測對RA 患者的診斷和鑒別診斷具有臨床意義, 并且聯(lián)合RF、anti-CCP和anti-MCV 能進一步提高診斷價值,有望成為輔助診斷RA 患者的一個新的實驗指標(biāo); 同時其與RA 患者臨床疾病活動度之間存在密切關(guān)系,對評估和監(jiān)測RA 患者病情有重要的指導(dǎo)和參考意義。