吳羅燕，周斌，葉東梅，何崇武，程波，鄔黎青

（1.南昌市第一醫(yī)院病理科 南昌大學研究生院，江西 南昌 330008； 2.江西省迪安華星醫(yī)學檢驗實驗室，江西 南昌 330072；3.江西省腫瘤醫(yī)院乳腺外科，江西 南昌 330029；4.九江市第三人民醫(yī)院病理科，江西 九江 332000）

乳腺癌的發(fā)生是一個多步驟的過程。 一般認為乳腺癌的發(fā)展模式是： 組織學正常的乳腺上皮發(fā)展為平坦上皮非典型增生(Flat Epithelial Atypia,FEA)非典型導管上皮增生(Atypical Ductal Hyperplasia, ADH)和導管原位癌(DCIS)，進而發(fā)展為浸潤性導管癌(IDC)[1]。 DCIS 并不代表IDC 的早期階段，IDC 可以從DCIS 發(fā)展而來， 也可以從其他途徑進展而來，包括直接從腫瘤干細胞演變而來。 乳腺癌是女性最常見的癌癥，發(fā)病率約為30%，死亡率在女性所有惡性腫瘤中位居第二[2-3]。 當前的治療方法旨在通過闡明腫瘤發(fā)生的分子機制及早期發(fā)展階段來預防腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。 人們普遍接受腫瘤的發(fā)生是由多個體細胞突變導致的[4-7]。 在健康細胞中， 腫瘤抑制因子和癌基因的失調(diào)會導致表型轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生。 最近，研究表明腫瘤發(fā)生過程出現(xiàn)基因異常修飾的作用[8]。 其中，CpG 島的高甲基化是癌癥最早和最頻繁的變化之一[9]。

轉(zhuǎn)錄延伸調(diào)節(jié)因子1-like（TCERG1L）位于10號染色體，調(diào)節(jié)DNA 轉(zhuǎn)錄、延伸和mRNA 剪接[10-11]。TCERG1L 于2010年被首次報告，因為其異常與兒童的精神集中障礙有關。隨后，TCERG1L 基因的幾種突變形式在非腫瘤性疾病中被發(fā)現(xiàn)，包括肥胖、炎癥和糖尿病。 相關[12]報道，TCERG1L 在潰瘍性結(jié)腸炎、 結(jié)腸癌和癌前病變中失表達是由其啟動子的CpG 甲基化所致，這表明TCERG1L 的失表達與結(jié)腸癌的發(fā)生、 發(fā)展存在相關性， 提示TCERG1L在結(jié)腸癌中起著抑癌作用。

本研究中，我們檢測TCERG1L 在正常的乳腺上皮細胞、DCIS 和IDC 細胞中的表達，并探究其與ERα 表達和其他臨床病理參數(shù)的相關性。 我們發(fā)現(xiàn)TECRG1L 在正常乳腺導管上皮細胞和乳腺良性病變的導管上皮細胞中高表達。 然而，TECRG1L 在DCIS 和IDC 細胞中表達顯著降低，并且與ERα 表達呈負相關。結(jié)果表明，TCERG1L低表達是ERα 陽性IDC 的特征之一，可作為ERα的IDC 的病理診斷生物標記物。

1 資料與方法

1.1 樣本資料 收集南昌市第一醫(yī)院及江西省迪安華星醫(yī)學檢驗實驗室2006年1月至2013年9月石蠟包埋的乳腺組織樣本181 例，包括60 例乳腺良性病變（腺瘤、纖維腺瘤、導管擴張和纖維性囊性乳腺疾?。挲g18～62 歲（平均40.1 歲）；61 例DCIS 組織，年齡36～63 歲 （平均47.2 歲）；60 例IDC 組織，年齡29～73 歲（平均53.1 歲）及其相對應的鄰近正常乳房組織。 根據(jù)2019 版乳腺WHO對DCIS 的組織學分類，低級別DCIS 7 例，中級別DCIS 20 例，高級別DCIS 34 例。 根據(jù)IDC 的組織學分類，I 期16 例，II 期33 例，III 期11 例。所有標本均經(jīng)倫理委員會批準， 并獲得參與本研究所有患者的知情同意。

1.2 免疫組織化學染色 兔抗人TCERG1L 多克隆抗體（1:80 稀釋）和兔抗人ERα 多克隆抗體（1∶500稀釋）購自Abcam。HRP 偶聯(lián)的二抗購自北京中山金橋公司（1∶200 稀釋）。 免疫組織化學檢測試劑盒和增強型DBA 顯影劑購自廣州勝達生物制劑公司。 將樣本固定在10%福爾馬林中，石蠟包埋，并以3 μm 切片，烤片、脫蠟后按免疫組化說明書進行免疫組化染色，封片后于顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.2.1 免疫組織化學結(jié)果判讀 TCERG1L 陽性染色定位于核上， 在高分辨率光學顯微鏡下對每個樣品連續(xù)計數(shù)五個視野。 使用半定量分級進行分析。 根據(jù)染色強度對染色結(jié)果進行評分， 未著色評分為0，淺黃色為1 分，淺棕色為2 分，深褐色為3 分。 根據(jù)陽性染色細胞的百分比評估：陽性細胞占總細胞數(shù)比例<25%得分為1，25%～49%得分 為2，50%～75%得 分 為3，>75% 得 分 為4。TCERG1L 在細胞染色強度和所占百分比的總分相加：0～2 為 陰 性/（-），3～4 為 弱 陽/（+），5 為 陽 性/（++），6～7 為強陽性/（+++）。 陽性/（++） 和強陽性/（+++）的病例數(shù)除以病例總數(shù)；陰性染色率即弱陽性染色/（+）和陰性染色/（-）病例數(shù)除以總病例數(shù)得出。

1.3 細胞培養(yǎng) 人乳腺癌細胞系MCF-7、MDAMB-231 和正常乳腺上皮細胞系HBL-100，均來源于中國醫(yī)學科學院上海研究所。 細胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，于37℃、含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 按照我們之前的研究，每兩天更換一次培養(yǎng)基[14]。

1.4 免疫印跡分析 收集人乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231 和正常乳腺上皮細胞系HBL-100，提取細胞總蛋白，并裂解，加入SDS-PAGE 上樣緩沖液后變性5 min，通過SDS-PAGE 電泳分離。 將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，封閉液封閉1.5 h，并在4℃冰箱孵育β-actin（1∶2 000）和TCERG1L（1∶500）抗體過夜。 將膜放入TBST 中漂洗，室溫孵育含HRP 的二抗（1∶2 000） 2 h，洗滌并顯影。

1.5 統(tǒng)計分析 運用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件分析實驗結(jié)果。 卡方檢驗分析免疫組織化學染色結(jié)果；Western blot 實驗數(shù)據(jù)運用One-way ANOVA 做統(tǒng)計分析，P<0.05 和P<0.01 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TCERG1L 在乳腺癌組織低表達 為了觀察乳腺癌組織和正常乳腺上皮、 乳腺良性病變TCERG1L 表達的差異， 我們應用免疫組織化學染色評估了60 例IDC 組織、61 例DCIS 組織和60 例乳腺良性病變組織中TCERG1L 的表達。TCERG1L陽性染色定位于細胞核和細胞質(zhì)，見圖1。TCERG1L在IDC 陽性染色率為63.4%，癌旁正常乳腺上皮細胞陽性率83.3%；DCIS 中TCERG1L 陽性染色率為73.8%，DCIS 旁正常乳腺上皮細胞陽性率90.2%；乳腺良性病變中正常的乳腺上皮細胞TCERG1L陽性率90%， 見表1。 與正常乳腺組織相比，TCERG1L 在DCIS 和IDC 中的表達顯著降低，但TCSRG1L 在DCIS 與IDC 癌旁正常乳腺組織與乳腺良性病變中正常乳腺組織中表達無明顯差異（P＞0.05）。結(jié)果表明TCERG1L 在正常乳腺上皮細胞中高表達，但在DCIS 和IDC 細胞中表達水平顯著降低（P＜0.01）。

圖1 TCERG1L 蛋白在乳腺組織中的表達

表1 TCERG1L 蛋白在乳腺良性病變、原位導管癌和浸潤性導管癌及癌旁正常乳腺組織中的表達

2.2 ERα 抑制TCERG1L 在乳腺癌細胞中的表達本研究購買的乳腺癌MCF-7 細胞陽性表達ERα，而MDA-MB-231 細胞不表達ERα，正常乳腺上皮細胞表達ERα 和TCERG1L。 TCERG1L 在ERα 陽性表達的HBL-100 細胞和ERα 陰性表達的MDA-MB-231 細胞中高表達， 而在ERα 陽性的MCF-7 細胞中表達顯著減弱， 見圖2。結(jié)果提示ERα 的表達抑制乳腺癌細胞中TCERG1L 的表達，但不削弱TCERG1L 在正常上皮細胞HBL-100 中的表達。 隨后結(jié)合臨床病例資料我們分析了TCERG1L 在IDC 中的表達與臨床病理參數(shù)的關系，見表2。結(jié)果顯示，IDC 細胞中TCERG1L 表達與ERα 呈負相關 （P=0.005）， 而與PR 表達無關（P=0.082）。 IDC 細 胞 中 的TCERG1L 的 表 達 與CerbB-2 或Ki-67 表達水平無關（P>0.05），并與腫瘤塊的大小、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和患者年齡無關。

圖2 Western blot 檢測TCERG1L 在乳腺癌MDA-MB-231細胞、MCF-7 細胞和正常乳腺上皮HBL-100 細胞中的表達

表2 浸潤性導管癌中TCERG1L 蛋白與ERα 表達及與其他臨床病理參數(shù)的關系

3 討論

轉(zhuǎn)錄延長調(diào)節(jié)因子1-like (TCERG1L)類似于轉(zhuǎn)錄延長調(diào)節(jié)因子1 (TCERG1)，可以調(diào)節(jié)DNA 的轉(zhuǎn)錄、延長和mRNA 的剪接[11]。TCERG1 使RNA 聚合酶II 羧基末端結(jié)構(gòu)域（CTD）中的蘇氨酸磷酸化以增強基因轉(zhuǎn)錄并調(diào)節(jié)癌癥相關基因 （包括Bclx）[11,13]。 我們發(fā)現(xiàn)TCERG1L 在正常的導管上皮細胞核中陽性表達，但在DCIS 和IDC 細胞中表達明顯降低。TCERG1L 陰性表達可能是由于DNA 甲基化或LncRNA 靶向?qū)е碌霓D(zhuǎn)錄活性喪失所致。 翻譯后修飾引起的加速降解和ERα 的直接降解作用也不能被忽視。

CpGs 的高甲基化被認為是癌癥轉(zhuǎn)化過程中最早和最頻繁的變化之一[14-15]，并被認為可以促進基因沉默。 基因突變可導致TCERG1L 的低甲基化，相關研究發(fā)現(xiàn)TCERG1L 在潰瘍性結(jié)腸炎[13]和結(jié)腸癌[16]中高甲基化。 在健康細胞中，腫瘤抑制基因和癌基因之間存在著一種平衡。 當這種平衡被破壞，癌基因占主導地位時， 細胞就會轉(zhuǎn)化為發(fā)育不良細胞或癌細胞。

在這項研究中， 免疫組織化學染色結(jié)果顯示TECRG1L 在正常乳腺導管上皮細胞和乳腺良性病變的導管上皮細胞中高表達，但在DCIS 和IDC 細胞中表達水平顯著降低。 TECRG1L 表達水平的變化原因可能是由于細胞周期不同階段或整個細胞系中ERα 表達的改變造成。由于并非所有的DCIS細胞都直接來源于正常的導管上皮細胞， 有些源于非典型上皮細胞，DCIS 表現(xiàn)出異質(zhì)性，從而影響細胞生物學行為[17]。 此外，IDC 源于DCIS，但某些IDC 源于干細胞。 IDC 細胞顯示出多變的形態(tài)，且并非全部細胞表達相同水平的TECRG1L 或ERα，導致變異。

正常乳腺導管上皮細胞TECRG1L 高表達，但TECRG1L 在DCIS 和IDC 細胞表達上水平顯著降低，提示TCERG1L 是腫瘤抑制因子。 TCERG1L 在IDC 細胞中的表達水平與ERα 呈負相關， 表明直接或間接調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達的相互作用。 以往研究表明，ERα 通過slug 調(diào)控E-鈣黏蛋白和EMT[18]。ERα 也可能直接或間接促進TCERG1L 甲基化。總之， 我們的研究表明，ERα 陽性 的乳 腺IDC 中TCERG1L 表達顯著降低， 當診斷有困難時，TCERG1L 是個有用的生物標記物。TCERG1L 表達顯著降低應優(yōu)先考慮IDC。 ERα 和TECRG1L 相互調(diào)控的機制尚需進一步探究。