許梅海，覃永平*，尹家瑜，韋潔勤，潘洋洋，申煒，蔣洪棉，劉剛

廣西醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院

(南寧市第一人民醫(yī)院)放射科1、病理科2、胃腸外科3，廣西 南寧 530022

直腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，若未經(jīng)有效控制治療可能會(huì)出現(xiàn)肝、肺轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重者威脅患者生命[1]。而直腸癌治療目的就是減少局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生，延長(zhǎng)患者生存時(shí)間，及時(shí)明確疾病進(jìn)展并制定出針對(duì)性治療方案是其臨床治療的關(guān)鍵，因此術(shù)前對(duì)該類(lèi)直腸癌患者進(jìn)行較為準(zhǔn)確的術(shù)后復(fù)發(fā)及預(yù)后生存評(píng)估，可指導(dǎo)臨床為其制定更具優(yōu)勢(shì)的治療方案。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，DNA錯(cuò)配修復(fù)蛋白(mismatch repair，MMR)的突變或甲基化，導(dǎo)致微衛(wèi)星不穩(wěn)定性是結(jié)直腸癌發(fā)生的重要機(jī)制之一，存在缺陷的MMR蛋白可影響正常細(xì)胞DNA復(fù)制，使其錯(cuò)配修復(fù)功能喪失，導(dǎo)致細(xì)胞自身突變速度加快及腫瘤形成[2]。錯(cuò)配修復(fù)(MMR)功能缺陷對(duì)結(jié)直腸癌患者的預(yù)后判斷、藥物療效預(yù)測(cè)有明確的指導(dǎo)意義[3]。在10%～20%的結(jié)直腸癌患者中可檢測(cè)到錯(cuò)配修復(fù)缺陷(dMMR)，dMMR引起微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)，是一種特殊的DNA損傷模式。在一些中晚期直腸癌患者中，dMMR表達(dá)與化療反應(yīng)不敏感有關(guān)，且患者的局部區(qū)域轉(zhuǎn)移的發(fā)生率降低，局部區(qū)域轉(zhuǎn)移的發(fā)生率降低，因此早期直腸癌患者能通過(guò)局部切除治愈的機(jī)會(huì)減少，而直腸癌Ⅱ期對(duì)輔助化療的需求減少?；诖耍狙芯恳悦庖呓M織化學(xué)檢測(cè)法檢測(cè)直腸癌患者中常見(jiàn)的4種錯(cuò)配修復(fù)蛋白(MLH1、PMS2、MSH2、MSH6)的表達(dá)情況，并分析其與直腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2014年1月至2020年9月在廣西醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院接受直腸癌根治術(shù)的120例原發(fā)性直腸癌患者的臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤長(zhǎng)徑、腫瘤位置(距離肛門(mén)外緣長(zhǎng)度)、術(shù)前及隨訪截至?xí)r腺癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物[包括癌胚抗原(CEA)、腫瘤相關(guān)糖類(lèi)抗原(CA199、CA125、CA153)]、脈管癌栓、淋巴結(jié)侵犯、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等。對(duì)所有患者在手術(shù)后進(jìn)行隨訪復(fù)查觀察腫瘤和轉(zhuǎn)移情況，對(duì)于腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的判定需要結(jié)合臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查、結(jié)腸鏡、組織學(xué)或病理學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床病理檢查確診為直腸癌；(2)原發(fā)灶均行全直腸系膜根治術(shù)，切緣陰性患者；(3)術(shù)后均行規(guī)律性輔助治療；(4)臨床病理及隨訪資料完整等。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前院內(nèi)接受過(guò)放化療者；(2)合并其他惡性腫瘤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；(3)臨床資料不完整者等。本研究獲得廣西醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院院內(nèi)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。最后因18例患者失訪，6例患者術(shù)后影像資料不全，以及2例患者因直腸癌術(shù)后其他并發(fā)癥(如腸梗阻、感染等)死亡，最終納入研究者94例。

1.2 方法 在病例系統(tǒng)中收集所有患者術(shù)前相關(guān)的臨床資料包括有無(wú)吸煙史、酗酒史、高血壓史、糖尿病史、腫瘤家族史，并在術(shù)前及隨訪過(guò)程中均檢測(cè)腺癌相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物，包括CEA、CA199、CA125、CA153，使用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析設(shè)備以及相應(yīng)配套的設(shè)備試劑來(lái)完成檢測(cè)，在檢測(cè)過(guò)程中CEA的檢測(cè)范圍正常界限數(shù)值在0～5 ng/mL，CA199正常界限數(shù)值在0～35 U/mL，糖類(lèi)抗原CA125正常界限數(shù)值在0～37 U/mL，糖類(lèi)抗原CA153正常界限數(shù)值在0～31 U/mL。所檢測(cè)的結(jié)果如果超出如上正常界限數(shù)值范圍，就判定為陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果。所有手術(shù)切除的腫瘤標(biāo)本均采用免疫組化法來(lái)檢測(cè)MMR蛋白(MLH1、PMS2、MSH2、MSH6)的表達(dá)情況。以4種MMR蛋白中出現(xiàn)1～3種表達(dá)缺失現(xiàn)象為錯(cuò)配修復(fù)基因缺失(dMMR)，將其作為dMMR組；以4種MMR蛋白均為陽(yáng)性為錯(cuò)配修復(fù)基因健全(pMMR)，將其作為pMMR組。

1.3 術(shù)后隨訪 以首次根治手術(shù)治療作為觀察起點(diǎn)，術(shù)后定期隨訪12個(gè)月，隨訪時(shí)腸鏡及病理提示局部復(fù)發(fā)或影像學(xué)檢查提示腹腔或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者隨訪終止，隨訪截止時(shí)間為2021年1月。隨訪時(shí)間為3～76個(gè)月，平均隨訪時(shí)間為(19.7±17.2)個(gè)月，隨訪方式采取門(mén)診或住院復(fù)查和電話(huà)相結(jié)合。對(duì)于腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的判定需要臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查、組織學(xué)或病理學(xué)檢查的支持，并將在隨訪過(guò)程中出現(xiàn)復(fù)發(fā)或腹腔、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者作為復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組，在隨訪結(jié)束無(wú)復(fù)發(fā)或腹腔、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者作為復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移組。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。采用ShapiroWilk檢驗(yàn)分析計(jì)量資料的正態(tài)性，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；MMR蛋白表達(dá)和直腸癌復(fù)發(fā)和或轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)性采用雙向無(wú)序分類(lèi)資料的關(guān)聯(lián)性檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組直腸癌患者的臨床資料比較 94例直腸癌根治術(shù)標(biāo)本中，pMMR組有55例(58.5%)，dMMR組有39例(41.5%)。兩組患者術(shù)前臨床基線(xiàn)資料及術(shù)前腫瘤標(biāo)志物比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組直腸癌患者的臨床資料比較[±s，例(%)]

表1 兩組直腸癌患者的臨床資料比較[±s，例(%)]

項(xiàng)目年齡(歲)性別男女CEA正常升高CA199正常升高CA125正常升高CA153正常升高酗酒史有無(wú)吸煙史有無(wú)高血壓史有無(wú)糖尿病史有無(wú)腫瘤家族史有無(wú)pMMR組(n=55)65.2±10.9 37(67.3)18(32.7)52(94.5)3(5.5)49(89.1)6(10.9)50(90.9)5(9.1)54(98.2)1(1.8)9(16.4)46(83.6)10(18.2)45(81.8)17(30.9)38(69.1)6(10.9)49(89.1)5(9.1)50(90.9)dMMR組(n=39)66.9±10.9 25(64.1)14(35.9)33(84.6)6(15.4)32(82.1)7(17.9)38(97.4)1(2.6)38(97.4)1(2.6)5(12.8)34(87.2)9(23.1)30(76.9)9(23.1)30(76.9)5(12.8)34(87.2)4(10.3)35(89.7)t/χ2值0.744 0.102 1.580 0.950 0.720 0.061 0.230 0.340 0.700 0.008 0.000 P值0.459 0.097 0.210 0.330 0.400 1.000 0.635 0.560 0.403 0.776 1.000

2.2 MMR蛋白表達(dá)與直腸癌病理特征關(guān)系 在截至隨訪時(shí)間內(nèi)，在94例患者中，11例出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)并5例同時(shí)出現(xiàn)肝、肺轉(zhuǎn)移，17例出現(xiàn)肝、肺、腎上腺及腹膜腔轉(zhuǎn)移等，其中10例有肝、肺、腎上腺、卵巢結(jié)節(jié)或腫塊手術(shù)病理證實(shí)為直腸癌轉(zhuǎn)移，7例主要以影像學(xué)術(shù)前及術(shù)后隨訪對(duì)比提示肺、肝、脊柱、腹膜等轉(zhuǎn)移；66例無(wú)局部復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移情況。dMMR組患者的腹腔及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的比例明顯高于pMMR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。經(jīng)關(guān)聯(lián)性檢驗(yàn)，MMR蛋白表達(dá)與直腸癌復(fù)發(fā)和或轉(zhuǎn)移雖然存在關(guān)聯(lián)性，但數(shù)值較小(列聯(lián)系數(shù)為0.198)，認(rèn)為兩者的關(guān)聯(lián)性較低；而dMMR組與pMMR組在腫瘤最大徑、腫瘤位置、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管癌栓、VEGF上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，在T分期上dMMR組與pMMR組均以T4期占比例居多，見(jiàn)表2。

表2 MMR蛋白表達(dá)與直腸癌病理特征的關(guān)系[例(%)]

3 討論

眾所周知，直腸癌治療的目的就是減少局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，隨著外科技術(shù)水平的提高，直腸癌患者長(zhǎng)期生存或治愈已成為可能。而直腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，其中肝臟是其血行轉(zhuǎn)移的主要靶器官[4]。但因直腸癌異質(zhì)性大，不同患者表現(xiàn)出多樣的腫瘤生物學(xué)特性及臨床病理特征，部分患者預(yù)后生存改善不明顯，術(shù)后易出現(xiàn)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。部分研究報(bào)道顯示，結(jié)直腸癌患者術(shù)后5年生存率為40%～50%，約30%以上患者因疾病進(jìn)展危及生命，且處于相同分期的患者其預(yù)后也存在較大差異[5]。因此術(shù)前、術(shù)后進(jìn)行較為準(zhǔn)確的預(yù)后預(yù)測(cè)可對(duì)直腸癌選擇不同治療方式的可行性進(jìn)行評(píng)估，進(jìn)而幫助臨床制定更為合理有效的治療策略。

近年來(lái)，臨床上逐漸認(rèn)識(shí)到MMR在直腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，MSI作為主要的遺傳不穩(wěn)定性之一，由dMMR所致，MMR系統(tǒng)主要由4個(gè)基因及其編碼的蛋白質(zhì)MLH1、MSH2、MSH6、PMS2組成，在DNA損傷反應(yīng)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中識(shí)別并修復(fù)堿基錯(cuò)配、插入、缺失，維持細(xì)胞中DNA結(jié)構(gòu)完整性和穩(wěn)定性，與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]。對(duì)于Ⅱ期的直腸癌患者，MSI狀態(tài)直接決定其術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)及輔助治療的選擇。而對(duì)于Ⅳ期直腸癌患者，MSI狀態(tài)有助于篩查免疫抑制劑治療的適用人群。故而，臨床上逐漸將檢測(cè)錯(cuò)配修復(fù)蛋白缺失情況作為判定腫瘤狀態(tài)的一項(xiàng)有效參考指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，在94例直腸癌患者的腫瘤組織中，dMMR患者39例(41.5%)，高于目前國(guó)內(nèi)外部分研究者既往的研究報(bào)道顯示的15.0%～30.1%[7-8]。這可能是人種或地域差異造成了特有表達(dá)的趨勢(shì)，也可能是本研究的樣本量相對(duì)較少造成的選擇性偏倚。路敏等[9]就錯(cuò)配修復(fù)基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系研究中顯示MMR蛋白表達(dá)缺失與患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤大小、病理組織學(xué)分類(lèi)及pTNM分期等臨床病理特征相關(guān)。本研究未發(fā)現(xiàn)dMMR與pMMR組在年齡、腫瘤長(zhǎng)徑、T分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓、VEGF等病理特征差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但本研究結(jié)果表明dMMR組發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的比例高于pMMR組，這也提示MMR的缺失可能會(huì)加重腫瘤的惡化，或者認(rèn)為低分化環(huán)境更易加速基因的突變，同時(shí)MMR突變現(xiàn)象與其浸潤(rùn)深度和轉(zhuǎn)移相關(guān)，這也提示pMMR與dMMR的發(fā)生發(fā)展機(jī)制不同，對(duì)應(yīng)的治療策略可能不同。這給臨床醫(yī)生在治療方式的選擇上提供了幫助，有研究提示MMR的缺失對(duì)氟尿嘧啶藥物不敏感[10]，幫助臨床在治療中采取個(gè)體化的治療方式。這說(shuō)明錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)情況對(duì)預(yù)測(cè)直腸癌復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移有提示作用并對(duì)臨床治療選擇有幫助。

本研究的局限性在于：(1)樣本量相對(duì)較小，后續(xù)研究中需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證；(2)所有的數(shù)據(jù)目前均來(lái)自同一家醫(yī)院，不具有普遍性，以后需要多中心研究證實(shí)研究結(jié)果；(3)復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素還有許多，如手術(shù)方式等，今后研究需要納入更多影響因素。