肝細(xì)胞癌（HCC）是一個(gè)主要的全球健康問(wèn)題和死 亡原因。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，到2030年，將有超過(guò)100 萬(wàn)人死于HCC，與其他癌癥相比，HCC 發(fā)病率在2020年繼續(xù)以更快的速度上升。這種癌癥的主要病因包括代謝紊亂、肝炎病毒的慢性感染、吸煙和過(guò)量飲酒等。不管肝臟的病因如何，HCC與肝纖維化和肝硬化密切相關(guān)。HCC預(yù)后的一個(gè)重要部分取決于潛在的慢性肝病，這也是其發(fā)生的危險(xiǎn)因素。肝硬化死亡率的Child-Pugh評(píng)分對(duì)于患者分層至關(guān)重要。大約80%～90%的HCC有潛在肝纖維化，大約三分之一的肝硬化患者會(huì)發(fā)展成HCC。由于早期臨床癥狀不明顯，發(fā)病機(jī)制不明，HCC確診時(shí)通常為晚期或已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，增加治療難度，且預(yù)后較差。目前，常用的HCC診斷方法，如血清腫瘤標(biāo)志物、影像學(xué)技術(shù)等臨床效果并不理想。篩選與HCC早期診斷和不良預(yù)后相關(guān)的標(biāo)志物，對(duì)于提高HCC的治療效果和預(yù)后至關(guān)重要。隨著多組學(xué)分析方法的應(yīng)用，大量重要分子被發(fā)現(xiàn)并成功應(yīng)用于臨床診斷和治療。但是，從肝纖維化進(jìn)展到HCC是一個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程，其機(jī)制非常復(fù)雜，目前尚未發(fā)現(xiàn)能作為HCC進(jìn)程的標(biāo)記物。因此，我們通過(guò)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)挖掘，著眼于HCC進(jìn)程中各疾病表型之間的基因變化，找到與HCC進(jìn)展相關(guān)的新基因，以期作為HCC的診斷和預(yù)后的新靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)集選擇

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載374 個(gè)HCC 和50 個(gè)正常組織的表達(dá)譜，從GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/database）獲取HBV相關(guān)肝纖維化患者基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE84044、正常與肝硬化相關(guān)數(shù)據(jù)集GSE14323、肝硬化與HCC相關(guān)數(shù)據(jù)集GSE63898。其中GSE84044數(shù)據(jù)集基于GPL570平臺(tái)［HG-U133_Plus_2］Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array、GSE14323數(shù)據(jù)集基于GPL571平臺(tái)［HG-U133A_2］Affymetrix Human Genome U133A 2.0 Array、GSE63898數(shù)據(jù)集基于GPL13667平臺(tái)［HGU219］Affymetrix Human Genome U219 Array。

1.2 DEG的篩選

TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集的DEG使用edge R包分析，GSE84044、GSE14323和GSE63898數(shù)據(jù)集的DEG使用在線工具GEO2R來(lái)識(shí)別。選擇＜0.05，|FC|＞2作為TCGA-LIHC、GSE14323和GSE63898數(shù)據(jù)集DEG的截?cái)嘀?，?.05，|FC|＞1.3作為GSE84044 數(shù)據(jù)集DEG的截?cái)嘀怠?/p>

1.3 DEG的火山圖、韋恩圖繪制

使用ggplot2 R包繪制火山圖和韋恩圖。

1.4 DEG的富集分析

使用clusterProfiler R包對(duì)差異基因繪制GO分析，包括生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞成分（CC）和分子功能（MF）以及KEGG通路分析。＜0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 基因的差異表達(dá)和臨床參數(shù)相關(guān)性分析

GO富集分析顯示差異基因主要富集在細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織，含細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白，細(xì)胞外基質(zhì)成分等方面。KEGG富集顯示主要富集在黏著斑途徑中（圖2）。

1.6 RT-qPCR

本研究使用GEO2R分別對(duì)GSE84044數(shù)據(jù)集中肝纖維化組織、GSE14323數(shù)據(jù)集中正常與肝硬化組織、GSE63898數(shù)據(jù)集中肝硬化與HCC組織；使用edgeR包對(duì)TCGA-LIHC中正常與HCC組織按篩選標(biāo)準(zhǔn)（FC=1.3/2，＜0.05）進(jìn)行差異基因分析（表1），分別得到了1972，912，1107，8975個(gè)DEG。使用火山圖對(duì)各數(shù)據(jù)集差異基因進(jìn)行可視化（圖1A～D），取交集后得到了118個(gè)共同DEG（圖1E）。

2 結(jié)果

2.1 不同肝臟相關(guān)疾病組別共同DEG篩選

收集來(lái)自廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院15對(duì)HCC組織和鄰近癌旁組織。采樣時(shí)間為2018年6月～2020年9 月。本研究獲得廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（20200035）。所有患者均提供知情同意。Trizol試劑提取HCC組織和癌旁組織中的總RNA。用Takala反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047A）將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后用Takala試劑盒（RR820A）進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。引物序列：ATP1B3正向5'-TCATCTACAACCCGACCACCG-3'，反向5'-GAGTCTGAAGCATAACCCACATC-3'；ENAH正向5'-TGACTATTGTGCTGTCTGCTGC-3'，反向5'-AAAGGTTCACTGCTGACTCCC-3'；ACTB 正 向5'-AGATCAAGATCATTGCTCCTCCTG-3'，反向5'-AG TCATAGTCCGCCTAGAAGCAT-3'。ATP1B3和ENAH的檢測(cè)以β-Actin 作為內(nèi)參。2法計(jì)算ATP1B3 和ENAH的相對(duì)表達(dá)水平。

2.2 DEG的富集分析

使用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)對(duì)基因在各不同疾病類型中進(jìn)行差異表達(dá)分析；基因與臨床特征關(guān)系分析，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)或Fisher's精準(zhǔn)檢驗(yàn)，連續(xù)資料采用檢驗(yàn)；使用logrank檢驗(yàn)對(duì)基因在TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中進(jìn)行生存分析，使用survminer包對(duì)生存結(jié)果進(jìn)行可視化；使用pROC包繪制基因關(guān)于預(yù)測(cè)正常和腫瘤結(jié)局的ROC曲線圖；使用單因素方差分析分析基因表達(dá)量與T分期、病理Stage和病理Grade關(guān)系，使用ggplot2 R包進(jìn)行可視化。

ATP1B3 表達(dá)與T 分期和臨床病理分期相關(guān)（＜0.05），而ENAH表達(dá)與病理分級(jí)相關(guān)（＜0.05，表3）。生存分析發(fā)現(xiàn)，ATP1B3和ENAH高表達(dá)與HCC患者不良預(yù)后有關(guān)（＜0.05，圖4A、B）。ROC曲線分析表明ATP1B3 和ENAH，曲線下面積AUC 分別是0.821 和0.933，在預(yù)測(cè)患者為正?；蚰[瘤結(jié)局檢驗(yàn)效能方面具有較高準(zhǔn)確性（圖4C、D）。接著我們分析了ATP1B3和ENAH的表達(dá)量與臨床各分期和分級(jí)關(guān)系。從T分期、病理Stage和病理Grade來(lái)看，ATP1B3表達(dá)隨著HCC疾病進(jìn)展表達(dá)量逐漸升高。T3、T2分期ATP1B3表達(dá)量顯著高于T1分期，Stage III、Stage II高于Stage I分期，Grade3分級(jí)高于Grade1（＜0.05，圖4E～G）。ENAH高表達(dá)與HCC晚期病理Grade相關(guān)，Grade3、Grade2分級(jí)ENAH表達(dá)量顯著高于Grade1（＜0.05，圖4H～J）。

2.3 篩選DEG的核心基因

在本研究中，我們篩選了GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中3個(gè)數(shù)據(jù)集：肝纖維化數(shù)據(jù)集GSE84044、肝硬化相關(guān)數(shù)據(jù)集GSE14323、肝硬化與HCC 相關(guān)數(shù)據(jù)集GSE63898 和TCGA中肝細(xì)胞癌TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集。取四個(gè)數(shù)據(jù)集DEG交集，我們獲得了118個(gè)共同DEG。對(duì)DEG做GO和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)DEG在細(xì)胞外基質(zhì)組織、膠原蛋白三聚體、糖胺聚糖結(jié)合、黏著斑和AGE-RAGE通路中起重要作用。我們發(fā)現(xiàn)在上調(diào)基因中發(fā)現(xiàn)ROBO1、LAMC1、ATP1B3、SPP1、AKR1B10、ENAH 等基因在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中，其高表達(dá)與HCC患者不良預(yù)后相關(guān)（＜0.05）。通過(guò)Pubmed文獻(xiàn)檢索，發(fā)現(xiàn)ROBO1作為分泌蛋白Slit2的受體，通過(guò)Slit2-Robo1信號(hào)通路激活肝星狀細(xì)胞，從而促進(jìn)肝損傷和纖維化。Song等在HCC組織和細(xì)胞中檢測(cè)Robo1的水平，發(fā)現(xiàn)Robo1被上調(diào)。Qin等發(fā)現(xiàn)層粘連蛋白γ1（Lamc1）在肝細(xì)胞癌組織中上調(diào)，體外實(shí)驗(yàn)推測(cè)Lamc1 可能通過(guò)PTEN/AKT途徑調(diào)節(jié)PKM2表達(dá)而參與HCC的進(jìn)展。分泌型磷蛋白1（SPP1）參與編碼骨橋蛋白（OPN），OPN在肝纖維化和肝硬化等慢性肝臟疾病中起關(guān)鍵作用表達(dá)上調(diào)。Zhu等檢測(cè)170例HCC患者和120例健康體檢者血清醛酮還原酶1B10（AKR1B10）水平，發(fā)現(xiàn)HCC患者血清AKR1B10水平顯著高于健康對(duì)照組,聯(lián)合血清AFP檢測(cè)可提高肝癌的診斷率。AKR1B10被認(rèn)為是一種新的HCC血清學(xué)生物標(biāo)志物。

2.3 核心基因與臨床特征關(guān)系

購(gòu)買堅(jiān)果時(shí)，注意看看有無(wú)發(fā)霉長(zhǎng)蟲(chóng)，炒貨要看看有沒(méi)有燒煳，燒煳的堅(jiān)果既產(chǎn)生了有害物質(zhì)，又使?fàn)I養(yǎng)價(jià)值大打折扣。而且最好選擇原味的堅(jiān)果。

2.4 ATP1B3和ENAH在臨床樣本中的驗(yàn)證

同場(chǎng)PK：將葛蘭許和Bin 707放在一起PK是極其不公平的，這里不過(guò)是想比較一下兩款酒的風(fēng)格而已，因?yàn)锽in707近年價(jià)位越來(lái)越逼近葛蘭許，是Penfolds眾多紅葡萄酒中最為強(qiáng)壯、飽滿的代表。707充滿力量，卻不會(huì)讓你覺(jué)得太霸道，濃郁的黑漿果香，入口復(fù)雜的香料香和更多層次的香氣。葛蘭許要深沉和沉穩(wěn)很多，它是一款你得要品嘗到第三口才能喝明白的年份，剛開(kāi)始有很多你無(wú)法形容的感受。

收集來(lái)自廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院15對(duì)HCC及鄰近癌旁組織樣本，提取總RNA，接著對(duì)ATP1B3和ENAH在HCC組織及癌旁組織的表達(dá)進(jìn)行了RT-qPCR實(shí)驗(yàn)?？赡苡捎跇颖緮?shù)較少，暫未發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因與HCC臨床特征有顯著關(guān)系（表4）。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ATP1B3和ENAH在HCC組織表達(dá)高于癌旁組織（＜0.05，圖5），可作為診斷HCC的良好指標(biāo)。

3 討論

HCC是一種嚴(yán)重的全球健康負(fù)擔(dān)，其發(fā)生和發(fā)展的潛在機(jī)制很復(fù)雜，是全球癌癥相關(guān)死亡的常見(jiàn)原因。目前，盡管HCC在系統(tǒng)治療方面取得了進(jìn)展，但由于診斷晚和頻繁潛在的肝臟疾病，患者的生存率仍然很低。尚不清楚不同形式的肝炎和肝損害是如何引發(fā)HCC的。因此，確定共同的致病基因?qū)υ缙贖CC的檢測(cè)和預(yù)防非常重要。隨著多組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，生物標(biāo)志物已成為診斷、預(yù)后和治療的有力工具。盡管，許多與HCC不同發(fā)生階段相關(guān)的關(guān)鍵分子被篩選出來(lái)，成為HCC早期篩查和治療的靶點(diǎn)。但是，肝細(xì)胞癌發(fā)生過(guò)程中的共同基因的研究，尚未見(jiàn)報(bào)道。

對(duì)118個(gè)DEG在TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)除9個(gè)無(wú)明顯差異外，95個(gè)DEG在HCC組織下調(diào)（＜0.05），14 個(gè)DEG 在HCC 組織上調(diào)（＜0.05，表2）。為了能篩選出與HCC進(jìn)展相關(guān)并且能成為疾病惡化程度的預(yù)后指標(biāo)，結(jié)合Pubmed文獻(xiàn)檢索，在上調(diào)基因中選擇ATP1B3和ENAH這2個(gè)研究很少的基因。接著對(duì)ATP1B3和ENAH分別做了在不同肝臟疾病類型數(shù)據(jù)集中的表達(dá)差異分析，發(fā)現(xiàn)ATP1B3在惡性疾病中表達(dá)較高，特別在癌前病變肝硬化時(shí)期表達(dá)更高（圖3A），ENAH隨著疾病進(jìn)展加劇，其表達(dá)逐漸增高（圖3B）。

目前，ATP1B3和ENAH與HCC進(jìn)程相關(guān)的研究非常少。ATP1B3編碼Na+/K+-ATPase的β亞基，Na+/K+-ATPase不僅參與正常的細(xì)胞活動(dòng)，在致癌過(guò)程中也至關(guān)重要。Li等發(fā)現(xiàn)ATP1B3在胃癌組織中高表達(dá)，可通過(guò)PI3K/AKT通路調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的進(jìn)展和預(yù)后。Zhang等通過(guò)綜合數(shù)據(jù)集多轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)ATP1B3在HCC中高表達(dá)，且與生存和免疫浸潤(rùn)相關(guān)。體內(nèi)功能分析發(fā)現(xiàn)ATP1B3參與HCC的增殖、遷移和轉(zhuǎn)化。預(yù)測(cè)ATP1B3可作為HCC診斷和潛在治療靶點(diǎn)。ENAH是一種肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)蛋白，參與控制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞-細(xì)胞黏附。ENAH在多種癌癥中包括食管癌、胃癌和乳腺癌中過(guò)表達(dá)，Deng等結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)分析和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ENAH可通過(guò)Notch 信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。ENAH可逆轉(zhuǎn)miR-139-5P對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制功能作用，誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌的惡性進(jìn)展。本研究通過(guò)收集各肝臟疾病相關(guān)數(shù)據(jù)集分析，發(fā)現(xiàn)ATP1B3和ENAH在正常組織、低纖維化、高纖維化、肝硬化、HCC組織中其表達(dá)量隨著疾病進(jìn)展大體上調(diào)，但ATP1B3在肝硬化階段表達(dá)最高。

在之前的課程中，已經(jīng)學(xué)習(xí)了C、G、D、A調(diào)的五指音階，這些音階均由“秘密公式”“全音—全音—半音—全音”的結(jié)構(gòu)構(gòu)成，即為大調(diào)音階。在大調(diào)音階的基礎(chǔ)上，將五指音階中的三音降低半音，即成為小調(diào)音階，它的結(jié)構(gòu)為“全音—半音—全音—全音”。由此，學(xué)生便輕松地掌握了C、G、D、A大調(diào)及其同主音小調(diào)的五指音階。至此，移調(diào)訓(xùn)練不僅可以在大調(diào)之間相互轉(zhuǎn)換，也可以在大調(diào)與小調(diào)之間進(jìn)行，同時(shí)，也幫助學(xué)生建立大調(diào)與小調(diào)的調(diào)性聽(tīng)覺(jué)及理論認(rèn)知能力，使這一模式的學(xué)習(xí)更加清晰和直觀。

生存分析發(fā)現(xiàn)，ATP1B3和ENAH在TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中，基因的高表達(dá)HCC患者生存率低，有不良預(yù)后。ROC曲線分析ATP1B3和ENAH在診斷正?；蚰[瘤結(jié)局檢驗(yàn)效能方面，ENAH AUC高達(dá)0.933，ATP1B3為0.821，具有較高檢驗(yàn)效能。接著我們分析了ATP1B3和ENAH與HCC患者各臨床參數(shù)之間關(guān)系，發(fā)現(xiàn)ATP1B3隨著T分期、病理Stage和Grade進(jìn)展，其表達(dá)量逐漸增高。ENAH在晚期病理Grade中，其表達(dá)量更高。以上說(shuō)明ATP1B3和ENAH密切參與肝細(xì)胞癌的進(jìn)展過(guò)程，可作為肝細(xì)胞癌預(yù)后和診斷標(biāo)記物。最后我們收集到15 對(duì)肝細(xì)胞癌和鄰近癌旁組織，對(duì)ATP1B3 和ENAH 做RT-qPCR 驗(yàn)證。研究發(fā)現(xiàn)ATP1B3和ENAH mRNA在癌組織表達(dá)上調(diào)。

參照組:該組患者予以四聯(lián)療法,使用的藥物為蘭索拉唑,使用劑量為15mg,一天2次,阿莫西林,使用劑量為1000mg,一天2次,左氧氟沙星,使用劑量為200mg,一天2次,枸櫞酸鉍鉀,使用劑量為220mg,一天2次。

綜上所述，我們通過(guò)生物信息學(xué)方法挖掘出從肝纖維化、肝硬化到HCC疾病進(jìn)程中，表達(dá)逐漸上調(diào)且與HCC 患者生存、預(yù)后、進(jìn)展和診斷密切相關(guān)基因：ATP1B3和ENAH，并通過(guò)收集臨床樣本驗(yàn)證了其在肝癌組織的高表達(dá)，可以為HCC診斷和預(yù)后提供新的靶點(diǎn)和治療方向。

社會(huì)認(rèn)知兩大基本維度對(duì)中庸思維三因子分別的回歸分析顯示，能動(dòng)性對(duì)三因變量均不具有顯著預(yù)測(cè)作用，而社群性的預(yù)測(cè)作用均為極顯著，其中，對(duì)多方思考的預(yù)測(cè)率為18%(F=27.66，p<0.001)；對(duì)整合性的預(yù)測(cè)率為6%(F=7.98，p<0.001)；對(duì)和諧性的預(yù)測(cè)率為13%(F=18.95，p<0.001)。