汪 安

(池州市質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，安徽 池州 247000)

咽炎片由玄參、百部(制)、天冬、牡丹皮、麥冬、款冬花(制)、木蝴蝶、地黃、板藍根、青果、蟬蛻、薄荷油 12 味中藥材配伍組合而成，具有疏肝理氣，健脾消食，養(yǎng)陰潤肺，清熱解毒，清利咽喉，鎮(zhèn)咳止癢的功效，主要用于慢性咽炎引起的咽干、咽癢及刺激性咳嗽[1-2]。板藍根始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，《中國藥典》2020年版一部收載為十字花科植物菘藍IsatisindigoticaFort.的干燥根[3], 其作為常用抗病毒中藥在咽炎片全方中用量較大。(R,S)-告依春為板藍根抗病毒的代表性有效成分之一[4], 是反映板藍根藥材及其制劑質(zhì)量的一個重要指標，雖已有文獻報道過板藍根提取物中(R,S)-告依春在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究[5], 但至今尚未有測定咽炎片中(R,S)-告依春含量的方法報道，通過對咽炎片中(R,S)-告依春的含量進行測定分析，能夠有效鑒別和判斷咽炎片的質(zhì)量優(yōu)劣。本研究參考《中國藥典》及文獻[6-10]，采用高效液相色譜法測定咽炎片中(R,S)-告依春的含量，以有效控制其內(nèi)在質(zhì)量，能夠為咽炎片質(zhì)量控制提供方法，保障用藥安全。

1 儀器和試藥

1.1 儀 器

島津LC-2030A型高效液相色譜儀,日本島津;XP205電子天平,梅特勒-托利斯儀器上海有限公司;Elma PH180H超聲波清洗器,德國Elma公司。

1.2 藥品與試劑

表1 咽炎片廠家與批號信息Table 1 Yanyan tablets manufacturers and batch number information

(R,S)-告依春(批號：111743-202007，純度100%)，中檢院;色譜甲醇,SIGMA 公司;磷酸、甲醇等試劑均為分析純、超純水、0.45 μm微孔濾膜,天津市津騰實驗設(shè)備有限公司;咽炎片廠家與批號信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱: SHIMADZU C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相: 甲醇-0.02%磷酸 (7:93); 流速: 1. 0 mL/min; 柱溫: 30 ℃; 檢測波長: 241 nm; 進樣量: 10 μL，以進行咽炎片中(R,S)-告依春含量的檢測分析。

2.2 對照品溶液的制備

精確稱量(R,S)-告依春對照品11.42 mg，放置于100 mL量瓶中，加5% 甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，用 0.45 μm 的微孔濾膜進行過濾，得到濃度為 0. 1142 mg/mL 的對照品溶液。在該色譜條件下，對照品峰型良好，見圖1。

2.3 供試品溶液的制備

取咽炎片20片，除去薄膜衣，稱定重量，研細，精密稱取1 g，放置于具塞錐形瓶中，精密加水25 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。在該色譜條件下，樣品分離度較好，見圖1。

圖1 對照品(A)和樣品(B)溶液的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of control (A) and sample (B) solutions

2.4 線性關(guān)系試驗

分別精密量取“2.2”項下(R,S)-告依春對照品貯備液2、4、10、12、16、20 mL分別置于100 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，配制成濃度依次遞增的對照品溶液。精密吸取上述對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀進行分析，測定對照品的峰面積，記錄色譜圖，以峰面積積分值為縱坐標，對照品濃度為橫坐標繪制線性方程，計算得線性方程：以峰面積(Y)對溶液濃度(X)進行線性回歸分析。得回歸方程為：y=19225x+488912(r=0.9993)。結(jié)果表明(R,S)-告依春在 22.84～228.4 μg·mL-1內(nèi)線性關(guān)系良好。實驗結(jié)果證明對照品峰面積與濃度有良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗

取“2.2”項下制得的對照品溶液，按“2.1”項下的色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果(R,S)-告依春的RSD為0.51%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

表2 樣品穩(wěn)定性含量變化Table 2 Sample stability content change

精密吸取“2.3”項下供試品溶液，分別于放置0、2、4、8、10、12、24 h后，注入高效液相色譜儀按“2.1”項下的色譜條件進行測定，記錄峰面積。測定結(jié)果顯示色譜峰平均峰面積為360855，RSD為 1.24%，表明供試品溶液在 24 h內(nèi)基本穩(wěn)定，隨著時間的推移，供試品溶液中(R,S)-告依春的含量呈緩慢下降趨勢。建議供試品制備后兩小時上機分析，或者置于冰箱中保存，見表2。

2.7 重復(fù)性試驗

取同一批號藥材，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，平行6份，按“2.1”項下的色譜條件進樣分析，記錄峰面積并計算(R,S)-告依春含量及平均值。結(jié)果 (R,S)-告依春的平均含量為0.065 mg/片，RSD為1.72%，結(jié)果表明本法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的供試品(含量：0.065 mg/片)6份，樣品按“2.3”項下操作制備供試品溶液，分別加入一定量的(R,S)-告依春對照品溶液，均勻混合，按“2.1”項下的色譜條件進樣并測定含量，計算回收率，結(jié)果表明(R,S)-告依春的平均回收率為96.4%，RSD為0.72%，見表3。表明該方法加樣回收率結(jié)果良好。

表3 (R,S)-告依春加樣回收率試驗數(shù)據(jù)Table 3 (R,S)-Gao Yichun sample recovery test data

2.9 樣品含量測定

照“2.3”項制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL，在“2.1”項下色譜條件下進樣分析，測定峰面積，根據(jù)回歸方程計算樣品中(R,S)-告依春含量，見表4。結(jié)果表明石家莊東方藥業(yè)生產(chǎn)的咽炎片中(R,S)-告依春含量較高。

表4 樣品含量測定結(jié)果(n=3)Table 4 The content results of sample

3 討 論

3.1 檢測波長得選擇

參考《中國藥典》2020版一部板藍根項下規(guī)定，檢測波長245 nm，并根據(jù)文獻[11-12]選擇了235 nm和254 nm兩種波長進行比較，利用二極管陣列檢測器，預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)(R,S)-告依春在245 nm處有最大吸收，在上述色譜條件下，在245 nm處所得的HPLC圖譜峰型較好，有利于分析。故在后續(xù)實驗中選擇245 nm作為檢測波長。

3.2 流動相的選擇

參考《中國藥典》2020版一部板藍根項下選擇甲醇-0.02%磷酸 (7:93)作為流動相，并同時采用了了水-甲醇梯度洗脫以及甲醇-水 (15:85)兩種方法的流動相，預(yù)實驗結(jié)果顯示甲醇-0.02%磷酸 (7:93)作為流動相響應(yīng)值良好，峰形佳，理論板數(shù)和分離度、基線等均符合要求，且效果優(yōu)于水-甲醇梯度洗脫和甲醇-水 (15:85)這兩種流動相，故在實驗中選擇了甲醇-0.02%磷酸 (7:93)作為流動相。

3.3 提取方法的選擇

在預(yù)實驗中采取了加熱回流提取和超聲提取兩種提取方法對咽炎片進行提取，結(jié)果表明超聲提取對咽炎片的提取不夠充分，加熱回流提取效率高于超聲提取，為了保證咽炎片內(nèi)的有效成分能被充分、高效地提取出，故在后續(xù)實驗中選擇了加熱回流作為咽炎片的提取方法。

4 結(jié) 論

通過上述實驗方法，選定了市面上6個廠家生產(chǎn)的咽炎片作為供試品，對其(R,S)-告依春含量進行檢測分析，結(jié)果顯示選定的不同廠家的咽炎片中(R,S)-告依春含量范圍為0.024～0.065 mg，含量差異較大，部分廠家生產(chǎn)的咽炎片中(R,S)-告依春含量較低。造成不同廠家生產(chǎn)的咽炎片含量差異較大的原因可能與各個廠家具有不同的生產(chǎn)工藝流程，且藥材來源與質(zhì)量等方面有關(guān)。由此可見，加強對市面上咽炎片中(R,S)-告依春的含量檢測，有利于保障咽炎片的產(chǎn)品質(zhì)量控制，確保其發(fā)揮更好的藥效作用。

咽炎片的藥品標準收載于衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第二冊，但在中藥成方制劑標準中未收載其有效成分含量測定的相關(guān)內(nèi)容，咽炎片的現(xiàn)行質(zhì)量標準滯后嚴重，缺乏專屬性，無法保證用藥的安全有效。目前，提高咽炎片的質(zhì)量標準，增加專屬性成分的檢測，是控制其質(zhì)量的有效途徑。另外，中成藥質(zhì)量的源頭，原料藥材質(zhì)量的控制更需有關(guān)部門進行嚴格把關(guān)，生產(chǎn)企業(yè)用質(zhì)量合格的原料藥材，嚴格按標準投料和生產(chǎn)，更是保證藥品質(zhì)量的關(guān)鍵?？紤](R,S)-告依春是板藍根的主要活性成分之一，抗病毒作用明顯，且含量較大，中國藥典2020年版也收載了板藍根中 (R,S)-告依春的含量測定方法，但至今尚未有測定咽炎片中(R,S)-告依春含量的方法報道，因此選擇(R,S)-告依春作為咽炎片的質(zhì)量控制成分，并首次建立了測定咽炎片中(R,S)-告依春的含量，并采用甲醇-0.02%磷酸 (7:93)作為流動相，該方法線性良好，精密度、準確度、穩(wěn)定性及回收率均符合要求，可作為控制咽炎片中指標成分(R,S)-告依春的質(zhì)量標準。