張?jiān)t

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271018)

近年來，具有過氧化物酶和類氧化酶活性的串聯(lián)酶被開發(fā)用于葡萄糖比色檢測，它具有多種催化功能，可以同時(shí)催化級(jí)聯(lián)反應(yīng)。然而，大多數(shù)串聯(lián)酶都有一個(gè)共同的缺點(diǎn)[1-3]，即它們的最佳反應(yīng)通常發(fā)生在pH值約為3的酸性溶液中，而在中性條件下，它們的級(jí)聯(lián)催化活性可以忽略不計(jì)。這一缺點(diǎn)嚴(yán)重限制了它們在需要接近中性pH值(pH 5.0～7.4)的生物系統(tǒng)中的進(jìn)一步應(yīng)用。盡管最近報(bào)道了幾種在近中性pH值下表現(xiàn)出良好催化活性的串聯(lián)酶模擬物[4-5]，但開發(fā)在近中性pH值下表現(xiàn)出優(yōu)異催化活性的串聯(lián)酶仍然非常有意義。

在這里，選擇MnO2是因?yàn)槠洫?dú)特的化學(xué)、化學(xué)催化、電催化和光催化特性[6-9]。我們不僅發(fā)現(xiàn)了串聯(lián)納米酶-MnO2納米棒，該方法不僅可以實(shí)現(xiàn)葡萄糖的快速肉眼定性分析，還可以實(shí)現(xiàn)葡萄糖的分光光度定量分析。由于鄰近效應(yīng)和原位反應(yīng)，該方法具有較高的靈敏度和較低的檢測限。更重要的是，這項(xiàng)工作達(dá)到了真正意義上的“一鍋”、“無酶”和“中性條件”的葡萄糖檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料來源

高錳酸鉀、鹽酸(37%)、3,3’，5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、葡萄糖、果糖、麥芽糖和蔗糖從中國阿拉丁化學(xué)試劑公司采購。所有化學(xué)品均為商業(yè)采購，使用時(shí)無需進(jìn)一步純化。

1.2 α-MnO2納米棒的制備 [10]

將1.3 g高錳酸鉀溶解在150 mL超純水中，并在磁力攪拌器中攪拌。攪拌5 min后，逐滴加入1 mL濃HCl(37%)、繼續(xù)攪拌5 min，以獲得完全均勻的溶液。將溶液轉(zhuǎn)移到100 mL聚四氟乙烯內(nèi)襯不銹鋼高壓反應(yīng)器中，并將其置于140 ℃ 的烘箱中反應(yīng)16 h。從反應(yīng)器中取出溶液并冷卻至室溫。通過離心收集棕色產(chǎn)品，并用去離子水洗滌4～5次、乙醇洗滌3次，去除最終產(chǎn)品中可能殘留的雜質(zhì)。最終在80 ℃下干燥24 h后得到樣品。

1.3 葡萄糖的比色反應(yīng)

在不同濃度的葡萄糖溶液中加入α-MnO2納米棒溶液(500 μL, 1 mg/mL)和檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(100 mM, pH 7.0)。將混合溶液置于40 ℃下孵育25 min，加入TMB溶液(100 μL, 15 mmol)。最后用紫外分光光度計(jì)測量652 nm處的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 掃描電鏡

采用溶劑熱法制備了具有高雙酶催化活性的α-MnO2，用掃描電鏡對α-MnO2的形貌進(jìn)行了表征。如圖1所示，直徑約為20～100 nm的α-MnO2的微米級(jí)一維棒狀結(jié)構(gòu)。棒狀結(jié)構(gòu)提供了獨(dú)特的一維幾何結(jié)構(gòu)和大表面積，這是有效催化所必需的[11]。

圖1 α-MnO2納米棒的SEM圖Fig.1 SEM image of α-MnO2 nanorods

2.2 XRD譜

為了進(jìn)一步獲得α-MnO2納米棒的純度和物相，獲得了α-MnO2納米棒的典型X射線衍射圖來表征其晶體結(jié)構(gòu)。從圖2可以看出，所有衍射峰可以被認(rèn)定為體心四方α-MnO2，表明所獲得的是純相α-MnO2。

圖2 α-MnO2納米棒的XRD譜Fig.2 XRD patterns of α-MnO2 nanorods

2.3 葡萄糖檢測的可行性

圖3 不同反應(yīng)體系的紫外-可見光譜Fig.3 UV-vis spectra of different reaction systems: TMB+glucose, TMB+catalysis and TMB+catalysis+glucose

為了驗(yàn)證α-MnO2納米棒是否能夠模擬催化葡萄糖級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液(pH=7)中測量了三種體系的吸光度。圖3顯示TMB-葡萄糖沒有明顯的吸收峰；而一個(gè)弱峰(652 nm)出現(xiàn)在TMB-α-MnO2體系中；幸運(yùn)的是，當(dāng)α-MnO2納米棒加入TMB-葡萄糖反應(yīng)系統(tǒng)中時(shí)，652 nm處的吸收峰明顯增加。三個(gè)體系表現(xiàn)出來的不同特點(diǎn)說明葡萄糖的級(jí)聯(lián)反應(yīng)主要依賴α-MnO2納米棒催化作用。在α-MnO2納米棒-TMB-葡萄糖體系中并未加入H2O2，可以推測α-MnO2納米棒首先催化氧化葡萄糖生成H2O2，然后催化H2O2氧化為oxTMB從而在652 nm產(chǎn)生吸收，說明α-MnO2納米棒具有串聯(lián)酶活性。

2.4 葡萄糖檢測的條件優(yōu)化

圖4顯示的是在不同pH條件下，652 nm處oxTMB的吸收強(qiáng)度。在弱酸(pH=3～5)或弱堿性(pH=8～10)環(huán)境中時(shí)，α-MnO2納米棒對葡萄糖的響應(yīng)相對較低。然而，一旦pH值位于6～7范圍內(nèi)，尤其是在pH=7的環(huán)境中，紫外-可見吸收峰強(qiáng)度最大。溶液的相應(yīng)照片也顯示了最佳顏色變化。結(jié)果表明，α-MnO2納米棒在中性環(huán)境中具有較高的催化葡萄糖級(jí)聯(lián)反應(yīng)的活性。

此外，我們還研究了不同溫度(包括20、30、40、50、60 ℃)的影響，考察了相應(yīng)的比色傳感性能。根據(jù)圖5展示的oxTMB在652 nm處的紫外-可見吸收峰強(qiáng)度，α-MnO2納米棒在40 ℃時(shí)對葡萄糖具有較高的串聯(lián)酶活性。

圖4 α-MnO2納米棒在不同pH下的反應(yīng)活性Fig.4 The optimization of pH value for the reactivity of α-MnO2 nanorods

圖5 α-MnO2 納米棒在不同溫度下的反應(yīng)活性Fig.5 The optimization of temperature for the reactivity of α-MnO2 nanorods

2.5 葡萄糖檢測

接下來，我們研究了α-MnO2納米棒對葡萄糖的檢測性能。圖6顯示了在不同濃度的目標(biāo)葡萄糖存在下α-MnO2納米棒體系的紫外-可見吸收光譜。隨著葡萄糖濃度(0～5 mM)的增加，紫外-可見吸收響應(yīng)逐漸增強(qiáng)。652 nm處對應(yīng)吸光度與葡萄糖濃度的校準(zhǔn)曲線在圖7中顯示，插圖給出的是α-MnO2納米棒的相對吸光度強(qiáng)度和葡萄糖濃度(0.5～250 μM)的線性校正。線性方程為Y=2.51908x+0.31578 (相關(guān)系數(shù)R2=0.9928)，葡萄糖的檢出限為0.3 μM。

圖6 不同葡萄糖濃度條件下的紫外-可見光譜圖Fig.6 UV-visible spectra of glucose and TMB in the presence of α-MnO2 nanorods with different glucose

圖7 652 nm處對應(yīng)吸光度與葡萄糖濃度的校準(zhǔn)曲線； 插圖顯示652 nm處葡萄糖檢測的線性校準(zhǔn)曲線Fig.7 Calibration curve of corresponding absorbance at 652 nm versus glucose concentrations Insert shows linear calibration curve for glucose detection at 652 nm

2.6 葡萄糖檢測的選擇性

圖8 α-MnO2納米棒的選擇性實(shí)驗(yàn)Fig.8 Selectivity of α-MnO2 nanorods

考慮到實(shí)際研究樣品的復(fù)雜性，測試α-MnO2納米棒對葡萄糖的選擇性至關(guān)重要。因此，在相同條件下，乳糖、果糖和蔗糖被用作對照。結(jié)果(圖8)表明，只有葡萄糖的加入才產(chǎn)生顯著的吸光度變化，證實(shí)了α-MnO2納米棒對葡萄糖具有優(yōu)良的選擇性。

3 討 論

葡萄糖檢測為通常采用將過氧化物酶模擬物與天然葡萄糖氧化酶(GOx)相結(jié)合方法，通過兩步反應(yīng)達(dá)到檢測目標(biāo)分子的目的[12-13]。具體而言，GOx首先用于在中性緩沖液中催化葡萄糖氧化生成H2O2，然后在酸性溶液中由過氧化物酶模擬物催化，以誘導(dǎo)顯色反應(yīng)來指示目標(biāo)物的水平。顯然，兩步方案在測試操作和分析性能方面存在一些不足：一方面，兩種酶/納米酶應(yīng)提供不同的反應(yīng)pH條件，這使得研究中的檢測操作步驟復(fù)雜[14]，另一方面，第一步生成的H2O2中間體容易自發(fā)分解，其部分損失會(huì)限制檢測靈敏度。因此，具有同時(shí)具有氧化物酶活性和過氧化物酶活性的納米酶材料的開發(fā)將有利于解決上述問題。

4 結(jié) 論

葡萄糖是生物體中新陳代謝不可或缺的營養(yǎng)物質(zhì)，也是人體重要的組成部分。葡萄糖的水平?jīng)Q定著動(dòng)物、植物以及微生物等生理活動(dòng)過程。糖尿病和低血糖癥是與葡萄糖代謝異常有關(guān)的臨床疾病，血糖含量過高或者過低都會(huì)引起相應(yīng)的疾病。另外，葡萄糖也廣泛應(yīng)用于食品加工工業(yè)中，在保健品加工生產(chǎn)、乳制品生產(chǎn)及飲料制品生產(chǎn)等過程中，葡萄糖含量都是重要的檢測指標(biāo)。本文采用簡單的水熱法制備了α-MnO2納米棒，它可以在中性條件、無天然酶存在的條件下一鍋中選擇性地催化葡萄糖級(jí)聯(lián)反應(yīng)。該納米酶有望在臨床血糖檢測和/或食品工程中有一定的應(yīng)用前景。