張順棠,劉繼東

(蓮花健康產(chǎn)業(yè)集團股份有限公司,河南 項城 466200)

抗氧化劑是阻止氧氣不良影響的物質(zhì),它是一類能幫助捕獲并中和自由基,從而降低自由基對機體損害的一類物質(zhì)。常用的抗氧化劑有維生素類抗氧化劑、酚系抗氧化劑、胺系抗氧化劑和含硫化合物抗氧化劑等。日本味之素公司城照雄等研究表明:谷氨酸發(fā)酵中,在培養(yǎng)基中有抗氧化劑存在的時候,可以防止菌體成分的氧化,使谷氨酸生成酶系能夠維持較長時間和較高活性,菌體細胞的老化和培養(yǎng)時間的延遲均能得到根本改善[19]。筆者在谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加不同比例的抗氧化劑茶多酚和硫辛酸,利用茶多酚和硫辛酸的抗氧化特性,防止谷氨酸菌體細胞質(zhì)膜及細胞壁的主要組成分磷脂質(zhì)的氧化,清除過量的自由基,減少自由基積累對菌體的氧化損傷,延緩菌體細胞衰老,延長菌體高產(chǎn)酸期持續(xù)時間。研究茶多酚和硫辛酸對谷氨酸菌體生長和產(chǎn)酸的影響,探討其合適的添加比例,以提高谷氨酸生產(chǎn)效率。

1 設(shè)備與儀器

50 L發(fā)酵罐、10 L種子罐、溫度、風量、pH數(shù)顯自控,上海國強生化裝備有限公司;754分光光度計,北京普析通用儀器有限公司;SBA-40C生物傳感儀,山東省科學院生物研究所;振蕩培養(yǎng)箱,上海智誠分析儀器制造有限公司;ES-A標準天平,天津市德安特傳感技術(shù)有限公司;DYS-40研究型生物顯微鏡,上海點應(yīng)光學儀器有限公司。

2 材料與配方

2.1 主要材料

谷氨酸棒桿菌“LHWJ-19”,蓮花健康產(chǎn)業(yè)集團股有限公司保藏;茶多酚,宜昌清江茗研生物科技有限公司;硫辛酸,江蘇采薇生物科技有限公司;葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏,上海天蓮精細化工有限公司;生物素,日本進口分裝;硫酸錳、硫酸亞鐵,國藥集團化學試劑有限公司;尿素、氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、氯化鈉、硫酸鎂、磷酸氫二鈉,上海凌峰化學試劑有限公司;玉米漿,山東西王糖業(yè)有限責任公司;糖蜜,柳州市金黔灣糖蜜有限公司。

2.2 培 養(yǎng) 基

2.2.1 斜面培養(yǎng)基

葡萄糖,20 g/dL;磷酸氫二鈉,0.12%;硫酸鎂,0.06%;玉米漿,0.25%;糖蜜,0.25%;尿素,0.6%;消泡劑,0.1%;硫酸亞鐵,2 mg/kg;硫酸錳,2 mg/kg;生物素,2 mg/kg;pH 7.0～7.2。

2.2.2 種子培養(yǎng)基

葡萄糖,4.0 g/dL;尿素,0.5%;硫酸鎂,0.05%;玉米漿,3.0%;磷酸氫二鉀,0.14%;硫酸亞鐵,2 mg/kg;硫酸錳,2 mg/kg;pH 7.0～7.2。

2.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖,10 g/dL;磷酸氫二鈉,0.12%;硫酸鎂,0.06%;玉米漿,0.25%;糖蜜,0.25%;硫酸亞鐵,2 mg/kg;硫酸錳,2 mg/kg;生物素,2 mg/kg;pH 7.0。

3 培養(yǎng)方法

3.1 菌種活化

取保藏菌種劃線接種于活化斜面培養(yǎng)基,30 ℃恒溫靜置培養(yǎng)10～12 h。

3.2 種子培養(yǎng)

利用接種環(huán)刮取斜面菌種數(shù)環(huán),接入滅菌后的搖瓶培養(yǎng)基,搖床轉(zhuǎn)速100 r/min,溫度30 ℃,培養(yǎng)8～10 h。

3.3 二級種子培養(yǎng)

種子罐培養(yǎng)基115 ℃滅菌20 min;當溫度降低到33 ℃時,接入搖瓶培養(yǎng)好的一級種子;控制溫度33.0～33.5 ℃,pH 7.0～7.1,通風量(按通風體積比)1∶0.15～1∶0.25,罐壓0.1 MPa,培養(yǎng)8～11 h;當OD凈增0.45以上時,將二級種子移入發(fā)酵罐。

3.4 谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)

發(fā)酵罐培養(yǎng)基初定容量10%,115 ℃滅菌20 min;當溫度降低到34 ℃時,移入種子罐培養(yǎng)好的二級種子開始發(fā)酵。

1) 溫度控制:0～6 h,34 ℃;6～12 h,35 ℃;12～18 h,36 ℃;18～24 h,37 ℃;24～28 h,38 ℃;28 h～放罐,39 ℃。

2) 轉(zhuǎn)速控制:當OD為0時,400 r/min;當OD凈增0.2～0.25時,500 r/min;當OD凈增0.4～0.65時,600 r/min;當OD凈增0.85以上時,700 r/min。

3) 通風量控制:當OD為0時,1∶0.12～1∶0.15;當OD凈增0.2～0.25時,1∶0.20;當OD凈增0.4～0.65時,1∶0.30～1∶0.35;當OD凈增0.85以上時,1∶0.35～1∶0.45。發(fā)酵后期可根據(jù)生產(chǎn)情況適當調(diào)整通風量,但不能低于零時通風量。

4) pH控制:0～2 h,pH 7.0～7.2;2～26 h,pH 7.0～6.8;26 h以后pH 6.7～6.8;放罐pH 6.4～6.7。

5) 流加糖控制:當殘?zhí)琴|(zhì)量濃度≤3.0 g/dL時流加濃縮高糖,流加糖質(zhì)量分數(shù)為45 g/dL。

6) 耗糖的控制:菌株生長期每2 h耗糖4.0～6.0 g/dL;產(chǎn)酸期每2 h耗糖1.5～2.0 g/dL;發(fā)酵后期每2 h耗糖0.5～1.0 g/dL。當耗糖過慢時可適當降低通風量或pH并提高溫度,當耗糖過快時可適當提高通風量或pH以使發(fā)酵平穩(wěn)。

3.5 檢測方法

1) 菌體OD值檢測:利用754分光光度計于600 nm測定,以蒸餾水為空白。

2) 葡萄糖液質(zhì)量濃度測定:利用SBA-40C生物傳感儀測定,吸取標準葡萄糖液25 μL進樣標定,到標定結(jié)束,取葡萄糖液10 μL,稀釋100倍后,取25 μL稀釋液進樣,讀取葡萄糖的質(zhì)量濃度。

3) 谷氨酸質(zhì)量濃度測定:利用SBA-40C生物傳感儀測定。

3.6 計算方法

1) 谷氨酸質(zhì)量=谷氨酸質(zhì)量濃度×發(fā)酵液體積。

2) 葡萄糖質(zhì)量=葡萄糖質(zhì)量濃度×葡萄糖液體積。

3) 糖酸轉(zhuǎn)化率=谷氨酸質(zhì)量÷葡萄糖質(zhì)量×100%。

4 結(jié)果與討論

4.1 添加茶多酚對谷氨酸發(fā)酵的影響

茶多酚又稱茶單寧、茶鞣酸、茶鞣質(zhì),是一類以α-苯基苯并吡喃為基本結(jié)構(gòu)的多羥基酚類復合體的統(tǒng)稱,包含黃烷醇(兒茶素)類、黃酮類等30余種化合物[20]。茶多酚屬于鏈終止型抗氧化劑,含有不穩(wěn)定的—H,自身易失去—H被氧化,而活性氧化基團因接受—H得到電子變成穩(wěn)定的非活性基團,抗氧化劑非活性基團的形成切斷了活性氧化基團進一步的氧化連鎖反應(yīng),從而起到抗氧化作用。生物體內(nèi)自由基的生成與相關(guān)的氧化酶有關(guān),如黃嘌呤氧化酶系、脂氧化酶和環(huán)氧酶等,茶多酚對以上氧化酶有抑制作用,通過抑制氧化酶減少自由基的產(chǎn)生。茶多酚的抗氧化性表現(xiàn)為直接和間接清除自由基[21],茶多酚對活細胞產(chǎn)生的氧自由基綜合清除效果明顯[22]。筆者在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加10,20,30,50 mg/kg的茶多酚,與在發(fā)酵培養(yǎng)基中不添加茶多酚進行平行實驗,茶多酚對谷氨酸菌體OD值影響如圖1所示,對谷氨酸質(zhì)量濃度的影響如圖2所示。

圖1 茶多酚對谷氨酸菌體生長曲線的影響

圖2 茶多酚對谷氨酸質(zhì)量濃度的影響

由圖1可知:在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量分數(shù)的茶多酚,發(fā)酵前期菌體的生長曲線基本一致,沒有明顯變化,說明茶多酚對前期谷氨酸菌體生長階段影響不明顯;與茶多酚0添加量時相比,添加10 mg/kg的茶多酚時,發(fā)酵中后期菌體OD值變化不明顯;當茶多酚添加量增加到20 mg/kg時,發(fā)酵中期菌體OD值明顯提高,后期菌體OD值降低速度明顯放緩;當茶多酚添加量增大到30 mg/kg和50 mg/kg時,發(fā)酵中后期菌體OD值與添加量為20 mg/kg時基本一致,后期OD值下降速度放緩,趨于穩(wěn)定,添加過量的茶多酚時菌體OD值不再改變。由圖2可知:隨著茶多酚添加量的增加,谷氨酸質(zhì)量濃度明顯提高,當添加量達到20 mg/kg時,谷氨酸產(chǎn)酸率達到最大值16.6 g/dL,與0添加量相比,谷氨酸質(zhì)量濃度提高0.5 g/dL;當添加量繼續(xù)加大時,谷氨酸質(zhì)量濃度基本穩(wěn)定,不再升高。綜上所述,發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定量的茶多酚,在發(fā)酵中期菌體OD值增高,后期OD值下降速度放緩,菌體老化速度變緩,可以提高谷氨酸的質(zhì)量濃度,茶多酚適合的添加量為20 mg/kg,此時的谷氨酸質(zhì)量濃度為16.6 g/dL。

4.2 添加硫辛酸對谷氨酸發(fā)酵的影響

硫辛酸也稱α-硫辛酸,是一種天然的二硫化合物,其化學名稱為1,2-二硫戊環(huán)-3-戊酸,是一種B族維生素[23]。硫辛酸是已知的天然抗氧化劑中抗氧化能力最強的一種,被稱為“萬能抗氧化劑”[24],是代謝過程中三羧酸循環(huán)不可缺少的物質(zhì),在三羧酸循環(huán)過程起輔酶作用[25]。硫辛酸可直接清除自由基(·OH)、活性氧(ROS)、活性氮(RNS)、單線態(tài)氧(1O2)和一氧化氮(NO)等[26],并能阻止自由氧對組織細胞的損害,起到延緩細胞衰老的作用。筆者在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加10,20,30,50 mg/kg的硫辛酸,與在發(fā)酵培養(yǎng)基中硫辛酸0添加進行平行實驗,硫辛酸對谷氨酸菌體OD值的影響情況如圖3所示,對谷氨酸質(zhì)量濃度的影響情況如圖4所示。

圖3 硫辛酸對谷氨酸菌體生長曲線的影響

圖4 硫辛酸對谷氨酸質(zhì)量濃度的影響

由圖3可知:在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量分數(shù)的硫辛酸,發(fā)酵前期菌體的生長曲線變化不明顯,表明硫辛酸對前期谷氨酸菌體生長階段的影響不明顯;與硫辛酸0添加量相比,添加量為10 mg/kg和20 mg/kg時,發(fā)酵中后期菌體OD值變化不明顯;當添加量增加到30 mg/kg時,發(fā)酵中期菌體OD值明顯變大,后期菌體OD值的下降速度明顯放緩;當添加量達到50 mg/kg時,OD值與添加量為30 mg/kg時基本一致,表明進一步加大添加量不會提高菌體OD值。由圖4可知:隨著硫辛酸添加質(zhì)量分數(shù)的增加,谷氨酸質(zhì)量濃度逐漸提高,當添加量達到30 mg/kg時,谷氨酸產(chǎn)酸率達到16.9 g/dL,與硫辛酸0添加相比,產(chǎn)酸率提高0.7 g/dL;當添加量繼續(xù)加大時,谷氨酸質(zhì)量濃度保持穩(wěn)定,過量的硫辛酸對進一步提高菌體的產(chǎn)酸能力效果不明顯。綜上所述,發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定量的硫辛酸,發(fā)酵中后期菌體OD值明顯升高,表明添加一定量的硫辛酸可降低菌體老化速度,提高谷氨酸的質(zhì)量濃度,硫辛酸適合的添加量為30 mg/kg,此時的谷氨酸質(zhì)量濃度為16.9 g/dL。

4.3 組合添加茶多酚和硫辛酸對谷氨酸發(fā)酵的影響

硫辛酸有很強的抗氧化作用,具有水溶性和脂溶性雙重特性[23],可同時在細胞的親水部分和脂質(zhì)部分發(fā)揮抗氧化功效,作用時間也比其他抗氧化劑持久,硫辛酸在細胞體內(nèi)轉(zhuǎn)化為還原型的二氫硫辛酸[27],二氫硫辛酸和硫辛酸是防止細胞DNA損傷的有效保護劑[24],二氫硫辛酸還可以激活生物體內(nèi)其他抗氧化劑的代謝循環(huán)。有研究表明硫辛酸與其他抗氧化劑復合使用比單獨使用效果好[28]。依據(jù)前期實驗結(jié)果,將20,10 mg/kg的茶多酚分別與30,20,10 mg/kg的硫辛酸進行組合,如表1所示。將組合1～6分別添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中,與發(fā)酵培養(yǎng)基中茶多酚和硫辛酸0添加進行平行實驗,組合添加后發(fā)酵后期谷氨酸菌體破碎情況如圖5所示,對谷氨酸的質(zhì)量濃度和糖酸轉(zhuǎn)率的影響情況如圖6所示。

表1 茶多酚與硫辛酸組合

圖5 發(fā)酵后期谷氨酸棒桿菌鏡檢情況(放大1萬倍)

圖6 組合添加茶多酚和硫辛酸對谷氨酸質(zhì)量濃度、糖酸轉(zhuǎn)化率的影響

由圖5可知:組合添加茶多酚和硫辛酸后,鏡檢觀察到發(fā)酵后期谷氨酸菌體破碎情況減少,表明發(fā)酵菌體細胞得到了抗氧化劑的保護,延緩了細胞的衰老、減少了細胞破碎和自溶現(xiàn)象的發(fā)生。由圖6可知:組合添加茶多酚和硫辛酸到發(fā)酵培養(yǎng)基中后,谷氨酸質(zhì)量濃度和糖酸轉(zhuǎn)化率明顯提高;與茶多酚和硫辛酸0添加相比,組合添加20 mg/kg的茶多酚和10 mg/kg的硫辛酸時,谷氨酸質(zhì)量濃度由16.2 g/dL提高到17.1 g/dL,糖酸轉(zhuǎn)化率由64.6%提高到65.9%,指標值最好,明顯優(yōu)于單獨添加茶多酚和硫辛酸的指標值。實驗結(jié)果表明:發(fā)酵培養(yǎng)基中組合添加20 mg/kg的茶多酚和10 mg/kg的硫辛酸,比單獨添加茶多酚和硫辛酸更加有利于提高谷氨酸質(zhì)量濃度和糖酸轉(zhuǎn)化率。

5 結(jié) 論

在谷氨酸發(fā)酵過程中,谷氨酸菌體進入產(chǎn)酸期后,加大通風量可以提升菌體活力以提高菌體產(chǎn)酸能力。然而菌體代謝和老化速度也隨之加快,高產(chǎn)酸期持續(xù)時間縮短。筆者在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加抗氧化劑茶多酚和硫辛酸,利用茶多酚和硫辛酸能夠清除自由基的特性和硫辛酸的輔酶特性,阻斷和減少自由基對菌體細胞造成的傷害,延緩菌體細胞的老化,減少了菌體破碎和自溶現(xiàn)象,提高谷氨酸菌體持續(xù)高產(chǎn)酸能力。組合添加20 mg/kg茶多酚和10 mg/kg硫辛酸時谷氨酸發(fā)酵質(zhì)量濃度提高到17.1 g/dL,糖酸轉(zhuǎn)化率提高到65.9%,對提高谷氨酸質(zhì)量濃度和糖酸轉(zhuǎn)化率效果最明顯。