樊 逸,虞旭昶,張燁濤,謝煒煜,瞿鐘情,王遠(yuǎn)山

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,浙江 杭州 310014)

我國(guó)是微生物發(fā)酵大國(guó),每年都會(huì)產(chǎn)生大量菌渣[1]。這些菌渣成分復(fù)雜,含有多種氨基酸、大量粗蛋白、粗脂肪、抗生素及部分代謝中間產(chǎn)物和微量元素等,直接填埋或焚燒不僅會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生威脅,直接或間接地對(duì)人類生活造成不良影響,也會(huì)造成資源浪費(fèi)。赤霉素(Gibberellic acid,GA)是一種非常重要的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和啤酒發(fā)酵等領(lǐng)域,主要通過藤倉(cāng)赤霉菌(Gibberellafujikuroi)發(fā)酵生產(chǎn)[2]。全球超過90%的赤霉素原藥GA3由我國(guó)生產(chǎn)[3],因此,每年產(chǎn)生大量的赤霉素菌渣,其處理存在一定難度[4]。從生物質(zhì)的資源化利用角度考慮,這些菌渣由于含有大量碳源、氮源,通過部分代替原培養(yǎng)基的成分,可以極大地降低生產(chǎn)成本,并有利于可持續(xù)發(fā)展。

水熱液化技術(shù)是一種常用的生物質(zhì)預(yù)處理技術(shù),是近年來的研究熱點(diǎn)之一[5]。在水熱液化條件下,各種原本有生物活性的小分子化合物(如抗生素等)也可能失活,采用水熱液化法處理抗生素菌渣等危險(xiǎn)固體廢棄物,不僅可以降低其危害性,而且可以將水解液回用于原菌種的培養(yǎng)。作為水熱液化的副產(chǎn)物之一,水相產(chǎn)物雖然含有大量可以供微生物生長(zhǎng)的碳源和氮源[6],但其具有毒性,可以抑制微生物的生長(zhǎng)[7]。目前關(guān)于水熱液化水相的大量研究集中在如何對(duì)水相進(jìn)行脫毒排放[8],將水相產(chǎn)物作為培養(yǎng)基的研究較少。為開發(fā)新的赤霉素菌渣處理技術(shù),筆者首次將利用水熱液化技術(shù)處理赤霉素菌渣的水解液作為培養(yǎng)基,用于生產(chǎn)生物乙醇。同時(shí),錢江生物化學(xué)股份有限公司也在嘗試?yán)霉P者研究所得赤霉素菌渣水解液培養(yǎng)赤霉素產(chǎn)生菌Fusariumfujikuroi。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種和菌渣

高酒酵母(SaccharomycescerevisiaeCCTCC M94055),安琪酵母股份有限公司提供;赤霉素生產(chǎn)菌渣(主要成分為赤霉素產(chǎn)生菌Fusariumfujikuroi的菌絲體),浙江錢江生物化學(xué)股份有限公司提供。

1.1.2 YPD培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基[9]:酵母粉,1%;蛋白胨,2%;葡萄糖,2%;pH自然。

1.2 儀器與設(shè)備

GY-3型攪拌水熱反應(yīng)釜,海安至精石油儀器廠;MQ-3乙醇檢測(cè)模塊,優(yōu)信電子科技;SpectraMax M5酶標(biāo)儀,美國(guó)Molecular Devices;Spectrumlab S23A分光光度計(jì),上海棱光技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌渣水解液的制備

將新鮮赤霉素生產(chǎn)菌渣平鋪于塑料筐,在烘箱中烘干至質(zhì)量不變后,用粉碎機(jī)研磨成粉末,保存?zhèn)溆谩?/p>

研究所用的水熱反應(yīng)釜為間歇式反應(yīng)釜,其加熱套的保溫性能較好,不能實(shí)現(xiàn)短時(shí)間的溫度控制。由于設(shè)備的限制,水熱反應(yīng)保溫時(shí)間30 min,m(菌渣粉末)∶V(水)=1∶10(其中質(zhì)量單位為g,體積單位為mL,簡(jiǎn)稱固液比),攪拌速度為200 r/min,壓力為水在該溫度下的蒸汽壓。

1.3.2 菌體生物量測(cè)定

將菌液搖勻后,吸取200 μL于96孔板中,在600 nm處用酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度值(OD600)。與菌體生物量測(cè)定相關(guān)的實(shí)驗(yàn)均設(shè)計(jì)了1個(gè)對(duì)照和3個(gè)平行,實(shí)際值為實(shí)驗(yàn)組數(shù)值減去對(duì)照組得到,以O(shè)D600表示。

1.4 MQ-3乙醇傳感器的設(shè)計(jì)和使用

MQ-3是一種金屬氧化物半導(dǎo)體氣敏元件,空氣中乙醇的體積分?jǐn)?shù)可以影響其電阻值。通過簡(jiǎn)單的分壓電路,即可檢測(cè)出相應(yīng)的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)。該元件靈敏度高、穩(wěn)定可靠、成本低[10],可作為簡(jiǎn)易乙醇傳感器對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行初步判定。在封閉條件下,液體中的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和氣體中的乙醇體積分?jǐn)?shù)呈正比例關(guān)系,并且該傳感器的輸出電壓和氣體中的乙醇體積分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)[11]。

因此,筆者選用50 mL離心管為密閉容器,利用3D打印的蓋子將MQ-3乙醇?xì)怏w傳感器固定于離心管上,形成封閉空間,以實(shí)現(xiàn)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的初步定量檢測(cè)。

1.4.1 乙醇傳感器檢測(cè)方法

取1 mL菌液,10 000 r/min離心10 min,取上清500 μL于50 mL離心管中,蓋緊蓋子,讓離心管內(nèi)乙醇揮發(fā)一段時(shí)間達(dá)到氣液平衡。將預(yù)熱好的乙醇傳感器蓋在離心管上,傳感器會(huì)通過串口向電腦返回?cái)?shù)據(jù)繪制成曲線,如圖1(a)所示,在短時(shí)間內(nèi)即可達(dá)到最大值并保持穩(wěn)定。取出傳感器探頭后,信號(hào)曲線迅速下降,待信號(hào)恢復(fù)到“基線水平”,即可進(jìn)行下一次測(cè)量。簡(jiǎn)易乙醇傳感器裝置如圖1(b)所示,包含單片機(jī)、液晶屏和MQ-3氣體傳感器,液晶屏上的“RT”代表當(dāng)前信號(hào)值,“Max”代表在檢測(cè)過程中的最大信號(hào)值,作為檢測(cè)結(jié)果。

圖1 MQ-3乙醇傳感器信號(hào)曲線和裝置圖

1.4.2 乙醇傳感器信號(hào)值和乙醇溶液真實(shí)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的對(duì)應(yīng)關(guān)系

為了將傳感器返回的信號(hào)值轉(zhuǎn)換為乙醇的真實(shí)質(zhì)量分?jǐn)?shù),配制了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乙醇溶液,用乙醇傳感器對(duì)這些乙醇溶液進(jìn)行測(cè)定,來確定返回值和實(shí)際質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間的關(guān)系。

使用量筒量取5 mL水加入試管中,再向試管中加入不同體積的無水乙醇。用移液槍吸取1 000 μL乙醇,使用分析天平稱得其質(zhì)量為0.753 g,計(jì)算得到每支試管中乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù),見表1。由于傳感器非常靈敏,因此在8號(hào)試管的基礎(chǔ)上以10倍為梯度對(duì)9,10號(hào)試管進(jìn)行稀釋。從每支試管中分別取500 μL乙醇溶液轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中,蓋上蓋子,讓離心管內(nèi)乙醇揮發(fā)一段時(shí)間達(dá)到氣液平衡。將預(yù)熱好的乙醇傳感器蓋在離心管上,記錄乙醇信號(hào)值。取出傳感器,待基線走平后進(jìn)行下一次測(cè)量。

表1 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和傳感器信號(hào)值關(guān)系

利用MATLAB對(duì)傳感器信號(hào)值和乙醇真實(shí)質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行擬合,發(fā)現(xiàn)在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí)傳感器信號(hào)變化幅度很大,較高時(shí)(2.9%～10.7%)則呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系(R2=0.990 8)。當(dāng)總方程形式為f(x)=a×xb+c時(shí),R2=0.991 4。該方程在較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)誤差較小,在低質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)誤差較大。由于低質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇發(fā)酵液不是筆者的主要研究對(duì)象,為簡(jiǎn)化計(jì)算,之后的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算公式簡(jiǎn)化為

E=2.941×10-29×S10.21

(1)

式中:E為乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù);S為乙醇傳感器返回的信號(hào)值。

2 結(jié)果與討論

2.1 水解液的生物毒性驗(yàn)證

大量文獻(xiàn)表明:水熱液化的水相中含有大量小分子有機(jī)物,有顯著的生物毒性,且處理溫度越高,毒性越強(qiáng)。Nelson等[12]利用微藻水熱液化水相產(chǎn)物作為培養(yǎng)基,發(fā)現(xiàn)需要額外添加葡萄糖酵母菌才能在水解液中生長(zhǎng)。筆者發(fā)現(xiàn)在170 ℃時(shí)處理的水解液已經(jīng)有令人不適的刺激性氣味。為了驗(yàn)證生物毒性,通過觀察酵母菌的生長(zhǎng)情況,測(cè)試了水解液在130,150,170 ℃時(shí)的毒性。

在28 ℃下培養(yǎng)24 h后,酵母菌生長(zhǎng)情況如圖2所示,圖中編號(hào)1～3的水解液添加量(體積分?jǐn)?shù))分別為0,50%,100%。在170 ℃處理時(shí)的水解液添加量為100%時(shí),酵母菌菌體量和清水相近,無明顯生長(zhǎng)跡象,表明170 ℃可能溫度過高,已經(jīng)產(chǎn)生了大量抑制酵母菌生長(zhǎng)的物質(zhì)。在130 ℃和150 ℃的水解液中,酵母菌生長(zhǎng)情況較好,150 ℃可能產(chǎn)生了少量的有毒物質(zhì),導(dǎo)致酵母菌生長(zhǎng)情況較50%添加時(shí)差。

圖2 溫度和水解液添加量對(duì)S.cerevisiae CCTCC M94055生長(zhǎng)的影響

2.2 水解條件初步探索

通過生物毒性驗(yàn)證,預(yù)計(jì)(固液比和時(shí)間根據(jù)前期工作確定)在1∶10固液比,30 min保溫時(shí)間的前提下,最佳的反應(yīng)溫度可能在140 ℃左右。測(cè)試了130,140,150 ℃水解條件下的水解液,以50%和100%添加量作為培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母,對(duì)照組為YPD培養(yǎng)基。每隔24 h測(cè)一次OD值,得到的生長(zhǎng)曲線如圖3所示。

圖3 不同溫度和水解液添加量的S.cerevisiae CCTCC M94055生長(zhǎng)曲線

每一組酵母菌都可以生長(zhǎng),100%水解液添加量的生長(zhǎng)情況要優(yōu)于50%添加量,YPD組的生長(zhǎng)情況明顯好于其他各組。當(dāng)水解液添加量為50%時(shí),150 ℃優(yōu)于140 ℃;當(dāng)水解液添加量為100%時(shí),140 ℃和150 ℃生長(zhǎng)曲線接近,可能是150 ℃的水解液中有毒的物質(zhì)抑制了酵母的生長(zhǎng)?？紤]到減少水解液的毒性、提高水解液利用率、節(jié)約能源,后續(xù)制備水解液溫度選擇140 ℃。結(jié)果表明:在低溫條件下,菌渣水熱液化的水相產(chǎn)物的生物毒性并不顯著,可以直接作為培養(yǎng)基來培養(yǎng)酵母菌。

2.3 碳氮源添加研究

為了進(jìn)一步驗(yàn)證水解液的利用價(jià)值,筆者設(shè)計(jì)了碳源(葡萄糖)和氮源(蛋白胨)添加實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)24 h后,結(jié)果如圖4所示。

圖4 碳源和氮源添加對(duì)S.cerevisiae CCTCC M94055生長(zhǎng)的影響

添加碳源時(shí),筆者研究的碳源添加量范圍內(nèi),葡萄糖添加量越大,酵母菌生長(zhǎng)情況越好。當(dāng)葡萄糖添加量為20 g/L時(shí),酵母菌生長(zhǎng)情況幾乎達(dá)到Y(jié)PD培養(yǎng)基的水平;向水解液中添加蛋白胨時(shí),酵母菌的生長(zhǎng)情況并沒有明顯改變,可能是由于水解液中已經(jīng)含有充足的氮源或碳源不足。以上結(jié)果說明水解液具有部分代替YPD培養(yǎng)基的潛力。

2.4 乙醇發(fā)酵研究

筆者在原有的140 ℃水解液水相的基礎(chǔ)上,分別以0,50,100,150,200,250 g/L的添加量向水相中添加葡萄糖。參照文獻(xiàn)[13]的方法,試管裝液量為5 mL,接種量為5%(250 μL),在30 ℃下培養(yǎng)約24 h后,取1 000 μL,10 000 r/min離心10 min。取上清,通過乙醇傳感器測(cè)定乙醇對(duì)應(yīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果如圖5所示。

圖5 葡萄糖添加量對(duì)S.cerevisiae CCTCC M94055乙醇產(chǎn)量的影響

筆者發(fā)現(xiàn):當(dāng)向培養(yǎng)基中添加300 g/L的葡萄糖時(shí),葡萄糖并不能完全溶解,其溶解度約為275 g/L;添加250 g/L葡萄糖時(shí),乙醇產(chǎn)量出現(xiàn)下降趨勢(shì),其原因可能是由于此時(shí)的培養(yǎng)基已經(jīng)接近飽和,較大的滲透壓抑制了酵母的生長(zhǎng)[14];添加200 g/L左右葡萄糖時(shí),乙醇產(chǎn)量達(dá)到最大,表明利用水解液取代氮源來生產(chǎn)生物乙醇是可行的。

2.5 乙醇發(fā)酵曲線測(cè)定

為了探究該培養(yǎng)基生成乙醇的最佳時(shí)間,選用200 g/L的葡萄糖添加量,分裝到5組試管中,每組3個(gè)平行,裝液量2 mL,接種量選用5%(100 μL)。接種后,每隔12 h左右取出1組試管(3支),吸取1 mL離心收集菌體,并測(cè)定上清中的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果如圖6所示。

圖6 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和S.cerevisiae CCTCC M94055生物量變化曲線

由圖6可知:乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)在達(dá)到峰值前持續(xù)穩(wěn)定升高,約36 h達(dá)到最大值。乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大值后,可能由于底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)過低,產(chǎn)生的乙醇被酵母菌代謝[15],乙醇產(chǎn)量下降。從酵母菌干質(zhì)量變化曲線看,前24 h酵母菌生物量增速較快,后趨于平穩(wěn),約36 h達(dá)到最大值8.3 g/L。本研究添加了約20%的葡萄糖,得到了約5.3%的乙醇產(chǎn)出,可能由于水解液成分復(fù)雜,對(duì)S.cerevisiaeCCTCC M94055乙醇生物合成產(chǎn)生了抑制。后續(xù)可以通過耐受水解液菌種篩選及其乙醇發(fā)酵工藝優(yōu)化,進(jìn)一步提高水解液利用率和乙醇產(chǎn)量。

3 結(jié) 論

我國(guó)是微生物藥物生產(chǎn)大國(guó),在生產(chǎn)過程中會(huì)產(chǎn)生大量菌渣,對(duì)菌渣的高效處理極具挑戰(zhàn)性。筆者利用低溫水熱液化技術(shù)處理赤霉素生產(chǎn)中產(chǎn)生的菌渣,所得水相產(chǎn)物可以作為培養(yǎng)基培養(yǎng)S.cerevisiaeCCTCC M94055,在添加適量葡萄糖后得到乙醇,同時(shí)獲得酵母菌體,初步實(shí)現(xiàn)赤霉素菌渣的資源化利用。雖然低溫水熱液化下菌渣水解程度較低,但是可以通過收集反應(yīng)固相產(chǎn)物進(jìn)行多次水熱液化,以提高對(duì)菌渣的利用率。本研究也為其他微生物菌渣的處理和資源化利用提供了參考。