曲人亮，楊勇衛(wèi)，張 帥，劉靜靜，劉君瑋

山東省煙臺(tái)市奇山醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東煙臺(tái) 264001

乙型肝炎病毒(HBV)感染是我國(guó)最嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[1]。而血清中HBV-DNA載量是檢測(cè)HBV感染最直接的指標(biāo)[2]，血清中的HBV-DNA水平變化可以為乙型肝炎(以下簡(jiǎn)稱乙肝)的臨床診治提供依據(jù)[3]。近年來(lái)，由于抗病毒藥物的應(yīng)用，患者體內(nèi)的HBV-DNA水平往往維持在較低水平，臨床多出現(xiàn)用藥后反彈的情況[4]。相關(guān)指南指出：為了避免乙肝復(fù)發(fā)，HBV-DNA需控制在實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不到的水平(5～10 IU/mL)[5]。目前，國(guó)內(nèi)三甲醫(yī)院多采用羅氏COBAS核酸檢測(cè)系統(tǒng)，其定量限在20 IU/mL，少數(shù)醫(yī)院采用國(guó)產(chǎn)試劑盒，其定量限普遍在100 IU/mL，靈敏度較低，不能滿足美國(guó)肝病研究協(xié)會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)和乙肝臨床診斷治療的需求?；谝陨蠁?wèn)題，急需一種檢測(cè)乙肝低病毒載量的技術(shù)。然而病毒載量的檢測(cè)結(jié)果往往受到實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的非特異性產(chǎn)物的干擾，影響了結(jié)果的判斷[6]。這就對(duì)HBV-DNA的臨床檢測(cè)技術(shù)提出了更高的要求。

國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)北京納捷診斷技術(shù)有限公司研發(fā)的HBV-DNA定量檢測(cè)試劑盒上市，靈敏度達(dá)到5 IU/mL[7]。該試劑盒采用了最新的靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒，在1個(gè)試管中完成核酸提取及擴(kuò)增全過(guò)程，樣本直接加到核酸裂解液中無(wú)須混勻，具有靜態(tài)漂洗、磁珠參與PCR反應(yīng)，無(wú)核酸丟失及操作步驟少、低值重復(fù)性好、實(shí)驗(yàn)室污染可控的優(yōu)勢(shì)，可對(duì)低病毒載量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果可靠性高。本研究采用世界衛(wèi)生組織(WHO)標(biāo)準(zhǔn)品及臨床樣本，同時(shí)與羅氏COBAS核酸檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行比對(duì)，旨在分析靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒的檢測(cè)能力，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 WHO標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：201601)，濃度為1.0×108IU/mL，經(jīng)HBV-DNA陰性血清3次100倍稀釋后，制成1.0×102IU/mL標(biāo)準(zhǔn)品。取40 mL的1.0×102IU/mL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋樣本與10 mL HBV-DNA陰性血清混勻，制成80 IU/mL的稀釋樣本，然后采用陰性稀釋液進(jìn)行1∶1倍數(shù)稀釋，依次制成濃度為80.00、40.00、20.00、10.00、5.00、2.50、1.25 IU/mL的待測(cè)樣本。收集煙臺(tái)市奇山醫(yī)院80例羅氏COBAS核酸檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)臨床樣本，其中20例表面抗原陰性體檢人員血清樣本(獻(xiàn)血員樣本)，20例結(jié)果小于20 IU/mL的樣本，40例結(jié)果在20.0～2.0×107IU/mL的樣本。

1.2儀器與試劑 選擇北京納捷診斷試劑有限公司生產(chǎn)的HBV-DNA定量檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?和上海宏石醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)的SLAN-96P擴(kuò)增儀進(jìn)行研究。選擇羅氏COBAS核酸檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)。

1.3方法 靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒與羅氏COBAS核酸檢測(cè)系統(tǒng)同步對(duì)80.00、40.00、20.00、10.00、5.00、2.50、1.25 IU/mL的稀釋樣本和HBV-DNA陰性血清進(jìn)行檢測(cè)。

除此以外，用靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒檢測(cè)臨床樣本1～80，其中臨床樣本1～20為表面抗原陰性樣本，臨床樣本21～40為羅氏COBAS核酸檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果小于20 IU/mL的樣本，臨床樣本41～80為羅氏COBAS核酸檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果在20.0～2.0×107IU/mL的樣本。

靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒：按照HBV裂解液每人份100 μL+HBV內(nèi)標(biāo)1.0 μL配制裂解液，充分混勻后立即按每孔100 μL分裝到PCR擴(kuò)增管中。在已經(jīng)分裝提取液的PCR管內(nèi)加入100 μL待測(cè)樣本(校準(zhǔn)品、質(zhì)控品同樣本操作)，無(wú)須混勻；室溫靜置5～10 min。將PCR管轉(zhuǎn)移至磁力架上，靜置2～3 min，用移液器或負(fù)壓裝置吸取上清液后丟棄。保持PCR管在磁力架上，每孔加入HBV漂洗液(DWB)250 μL，靜置2 min，用移液器或負(fù)壓裝置吸取上清液后丟棄。取相應(yīng)量的HBV PCR反應(yīng)液及HBV酶混合液，按(HBV PCR反應(yīng)液每人份43.0 μL+HBV酶混合液每人份2.0 μL)比例配制，充分混勻成PCR-Mix，即刻使用。每孔加入45.0 μL的PCR-Mix，蓋上管蓋，顛倒輕輕彈下磁珠，使PCR-Mix與磁珠充分混勻，水平瞬時(shí)離心。將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至檢測(cè)區(qū)，置于熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0對(duì)兩種方法的抗污染性能、檢測(cè)限和定量限、精密度[即變異系數(shù)(CV)]，測(cè)定值lg差值及相關(guān)系數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。并對(duì)兩種方法的操作性進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

2.1靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒的抗污染性能 利用靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒對(duì)20例表面抗原陰性樣本進(jìn)行4次重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果全為陰性，符合率均為100%。靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒抗污染性能良好，試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、有效。

2.2靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒的檢測(cè)限、定量限和精密度評(píng)價(jià) 用靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒對(duì)1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00 IU/mL樣本進(jìn)行了4次重復(fù)檢測(cè)。11個(gè)1.25 IU/mL樣本共檢出10個(gè)，檢出率達(dá)90.9%，2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00 IU/mL樣本檢出率100.0%，表明靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒檢測(cè)限在1.25 IU/mL，定量限在2.5 IU/mL，低于試劑盒標(biāo)明的5.00 IU/mL，不同濃度樣本檢測(cè)結(jié)果層次分明，分辨率高。而羅氏COBAS核酸檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)限在20.00 IU/mL，靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒靈敏度較高，檢測(cè)限、定量限較低，見表1。

表1 靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋樣本的檢出率及CV

40.00、80.00 IU/mL樣本檢測(cè)結(jié)果顯示，靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒的CV分別為4.28%和4.77%，均小于5%，優(yōu)于羅氏COBAS核酸檢測(cè)系統(tǒng)的6.51%和6.21%。靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒精密度高，檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性較好。見表2。

表2 羅氏COBAS核酸檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋樣本的檢出率及CV

2.3對(duì)20例羅氏COBAS核酸檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果小于20.00 IU/mL樣本的檢測(cè)結(jié)果 用靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒檢測(cè)20例羅氏COBAS核酸檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果小于20.00 IU/mL的樣本，45%的樣本檢測(cè)結(jié)果大于5.00 IU/mL，表明靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒靈敏度明顯高于羅氏COBAS核酸檢測(cè)系統(tǒng)。

2.4兩種方法的準(zhǔn)確性研究 用靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒檢測(cè)40例羅氏COBAS核酸檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果在20.0～2.0×107IU/mL的樣本，結(jié)果顯示，兩種方法測(cè)定值lg差值均未超過(guò)±0.5。兩試劑盒相關(guān)系數(shù)為0.994 9。見表3。

表3 靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒與羅氏COBAS核酸檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果比對(duì)

續(xù)表3 靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒與羅氏COBAS核酸檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果比對(duì)

2.5兩種方法可操作性比較 兩種方法進(jìn)行核酸制備的方法比較見表4。兩種方法PCR擴(kuò)增性能比較見表5。

表5 PCR擴(kuò)增性能比較

3 討 論

乙肝是我國(guó)最常見的傳染病之一，目前由于抗病毒治療藥物的應(yīng)用，患者體內(nèi)的病毒水平往往維持在較低水平[7]，若檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確極易誤導(dǎo)臨床診斷治療，導(dǎo)致病情復(fù)發(fā)[8]，如何準(zhǔn)確檢測(cè)低HBV-DNA載量樣本是實(shí)驗(yàn)室急需解決的問(wèn)題之一?；诿绹?guó)肝病研究協(xié)會(huì)提出的5～10 IU/mL的檢測(cè)要求，靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒較好地補(bǔ)充了我國(guó)HBV-DNA檢測(cè)技術(shù)的短板[5]。該技術(shù)可實(shí)現(xiàn)核酸提取全過(guò)程在1個(gè)試管中進(jìn)行，靜態(tài)漂洗無(wú)須混勻操作，不僅避免污染且減少了核酸丟失；裂解液中含有50%構(gòu)象磁珠等成分，能快速分離蛋白抓取核酸；試劑性能穩(wěn)定，低值重復(fù)性好。若能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化提取，將會(huì)極大提高我國(guó)基層實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力。

本研究顯示，靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒抗污染能力強(qiáng)，定量限在2.50 IU/mL，遠(yuǎn)高于羅氏COBAS核酸檢測(cè)系統(tǒng)的20.00 IU/mL，且低值重復(fù)性好，檢測(cè)結(jié)果層次分明，分辨率高。采用靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒檢測(cè)羅氏COBAS核酸檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果小于20.00 IU/mL的樣本，其中45%的樣本檢測(cè)結(jié)果大于5.00 IU/mL，相比羅氏COBAS核酸檢測(cè)系統(tǒng)，靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒靈敏度更高，能有效防止漏檢，更適合我國(guó)臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。準(zhǔn)確性研究結(jié)果顯示，兩種技術(shù)方法檢測(cè)結(jié)果相差較小，相關(guān)系數(shù)為0.994 9，無(wú)明顯差異。兩種方法可操作性比較，靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒在操作時(shí)間、成本、檢測(cè)通量等方面均優(yōu)于羅氏COBAS核酸檢測(cè)系統(tǒng)。

靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒為具有獨(dú)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)的國(guó)內(nèi)專利技術(shù)，綜合性能顯著優(yōu)于羅氏COBAS核酸檢測(cè)系統(tǒng)，且操作簡(jiǎn)單、快速，但靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒處于發(fā)展初期，目前核酸提取及擴(kuò)增均為人工操作，與全自動(dòng)儀器相比，對(duì)操作人員的要求更高，若能制造穩(wěn)定的全自動(dòng)靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒設(shè)備，該技術(shù)能成為進(jìn)口技術(shù)的替代產(chǎn)品，為臨床抗病毒治療療效觀察提供更科學(xué)、準(zhǔn)確的依據(jù)。

靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒與羅氏COBAS核酸檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)HBV-DNA比較，其定量限達(dá)到5.00 IU/mL，是羅氏COBAS核酸檢測(cè)系統(tǒng)(20.00 IU/mL)的1/4；線性范圍為5.0～2.0×109IU/mL，高于羅氏COBAS核酸檢測(cè)系統(tǒng)(20.0～1.2×108IU/mL)。羅氏COBAS核酸檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)HBV-DNA在核酸提取純化后需用洗脫液從磁珠上洗脫并溶解核酸，檢測(cè)靈敏度易受洗脫和溶解效率的影響，而靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒直接在磁珠核酸中直接添加PCR擴(kuò)增試劑，無(wú)須磁珠核酸洗脫溶解，檢測(cè)靈敏度不受影響；且靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒操作簡(jiǎn)單，僅需5步即可完成核酸提取和擴(kuò)增，檢測(cè)40個(gè)樣本，從核酸提取到PCR結(jié)果報(bào)告僅需2 h左右，每天檢測(cè)通量可達(dá)到3 000個(gè)樣本，而羅氏COBAS核酸檢測(cè)系統(tǒng)則需要7 h左右，每天檢測(cè)通量不到1 000個(gè)樣本，靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒每天檢測(cè)通量為羅氏COBAS核酸檢測(cè)系統(tǒng)的3倍[7]。而且靜態(tài)核酸制備技術(shù)試劑盒不需要貴重設(shè)備，國(guó)產(chǎn)熒光PCR儀即可檢測(cè)，儀器設(shè)備費(fèi)用低，各基層醫(yī)療科研單位均可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，試劑盒成本較低，為羅氏COBAS核酸檢測(cè)系統(tǒng)的1/5左右，適合我國(guó)國(guó)情。