范金柱，任小宇，從飛，宋濤，郭云山，馬強(qiáng)

(1.西安交通大學(xué)附屬紅會(huì)醫(yī)院骨顯微修復(fù)外科，陜西 西安 710054；2.西安交通大學(xué)附屬紅會(huì)醫(yī)院脊柱外科，陜西 西安 710054；3.西安交通大學(xué)附屬紅會(huì)醫(yī)院足踝外科，陜西 西安 710054)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種慢性疼痛性關(guān)節(jié)炎，是患者殘疾的主要原因，全球至少有2.42億人患有髖/膝OA[1]。此外，隨著人口老齡化和肥胖等危險(xiǎn)因素的增加，OA的發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)[2]。OA的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要由機(jī)械、遺傳、代謝和炎癥等途徑參與的慢性演變過(guò)程[3]。目前，OA的治療主要通過(guò)藥物治療，部分患者需要考慮進(jìn)行關(guān)節(jié)置換手術(shù)。藥物治療主要采用非甾體抗炎藥和阿片類(lèi)藥物等，通過(guò)藥物控制疼痛和改善患者的癥狀[4]，然而OA患者的預(yù)后并不理想[5]。circRNAs是ncRNA的一個(gè)特殊子集，具有共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)，既沒(méi)有5′-3′極性也沒(méi)有多聚腺苷酸尾[6]。研究顯示circRNAs參與了真核生物的多種生理和病理過(guò)程，如癌癥進(jìn)展、炎癥、衰老和感染等[7]。近年來(lái)，OA與circRNAs之間的關(guān)系得到了部分闡明，circRNAs可能通過(guò)干擾軟骨細(xì)胞增殖和凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix，ECM)降解和炎癥等途徑參與OA的發(fā)生及發(fā)展[8]。研究顯示circPDE4B在OA患者軟骨組織中顯著低表達(dá)，并能夠通過(guò)調(diào)控RIC8A和MID1參與OA的進(jìn)展，然而其進(jìn)一步的生物學(xué)功能未完全明確[9]。因此，本研究選取2019年3月至2020年10月在西安交通大學(xué)附屬紅會(huì)醫(yī)院住院治療的28例OA患者，檢測(cè)circPDE4B的表達(dá)水平，并在細(xì)胞水平驗(yàn)證circPDE4B對(duì)OA軟骨細(xì)胞ECM降解和凋亡的影響及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本 選取2019年3月至2020年10月在西安交通大學(xué)附屬紅會(huì)醫(yī)院住院治療的28例OA患者和28例半月板損傷患者。OA患者男性16例，女性12例；年齡30～80歲，平均年齡(64.1±13.7)歲。半月板損傷患者男性18例，女性10例；年齡18～80歲，平均年齡(35.5±11.8)歲。OA患者行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)；半月板損傷患者行膝關(guān)節(jié)鏡下半月板成形術(shù)，切除損傷部分半月板。采用美國(guó)風(fēng)濕學(xué)院標(biāo)準(zhǔn)診斷OA，所有患者均未患有痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎等。在術(shù)中切除軟骨組織，標(biāo)本分成相同大小并保存于液氮中。所有患者術(shù)前簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自上海弗元生物科技有限公司；RT-qPCR試劑盒和TRIZol試劑購(gòu)自日本TaKaRa公司；Cleaved-caspase-3、SOX9、COL2A1、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)3、MMP13和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；轉(zhuǎn)染所需質(zhì)粒由中國(guó)上海吉?jiǎng)P基因有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人軟骨細(xì)胞通過(guò)兩步酶消化法進(jìn)行分離，傳代至第3代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用含10%胎牛血清的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2平衡濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒至OA軟骨細(xì)胞。

1.3.2 RT-qPCR 按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取組織和細(xì)胞中總RNA，采用Nano-Drop2000檢測(cè)RNA濃度。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，采用SYBR Green RT-qPCR檢測(cè)circPDE4B、miR-7、SOX9、COL2A1、MMP3、MMP13的表達(dá)水平。以GAPDH或U6作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集轉(zhuǎn)染48h后的OA軟骨細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)清洗2次后重懸，按照說(shuō)明加入Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑和染色液碘化丙啶(propidium iodide，PI)在室溫下避光10min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。

1.3.4 免疫蛋白印跡(western blot，WB) 采用ripa裂解液提取細(xì)胞中總的蛋白，使用聚氰基丙烯酸正丁酯(butyleyanoacrylate，BCA)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離蛋白后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜，在室溫條件下5%脫脂奶粉封閉，加入一抗Cleaved-caspase-3、SOX9、COL2A1、MMP3、MMP13和GAPDH后，在4℃下孵育過(guò)夜，次日加入二抗孵育2h，電化學(xué)發(fā)光(electro-chemi luminescence，ECL)顯影并檢測(cè)灰度值。

1.3.5 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 將野生型(WT)或突變型(MUT)circPDE4B克隆到pmirGLO質(zhì)粒受體中，同時(shí)將miR-NC或miR-7 mimics導(dǎo)入OA軟骨細(xì)胞中，共培養(yǎng)48 h后采用雙熒光素酶受體分析系統(tǒng)測(cè)量雙熒光素活性。

2 結(jié) 果

2.1 OA軟骨組織和軟骨細(xì)胞中circPDE4B的表達(dá)水平 半月板損傷患者和OA患者軟骨組織的番紅O染色顯示在OA患者中軟骨組織存在明顯病變(見(jiàn)圖1a～b)。進(jìn)一步檢測(cè)OA軟骨組織和軟骨細(xì)胞中circPDE4B的表達(dá)水平，結(jié)果顯示circPDE4B的表達(dá)水平在OA軟骨組織中明顯低于半月板損傷患者軟骨組織(見(jiàn)圖2a，P<0.05)。進(jìn)一步分離軟骨細(xì)胞，OA軟骨細(xì)胞中circPDE4B的表達(dá)水平明顯低于正常軟骨細(xì)胞(見(jiàn)圖2b，P<0.05)。細(xì)胞功能驗(yàn)證中，在OA軟骨細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染oe-NC和oe-circPDE4B，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染oe-circPDE4B后，circPDE4B的表達(dá)水平明顯高于轉(zhuǎn)染oe-NC(見(jiàn)圖2c，P<0.05)。

a 半月板損傷患者軟骨組織完整 b OA患者軟骨組織明顯破壞

2.2 過(guò)表達(dá)circPDE4B對(duì)OA軟骨細(xì)胞凋亡的影響 在circPDE4B對(duì)OA軟骨細(xì)胞生物學(xué)功能的研究中，流式結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)circPDE4B能夠明顯抑制OA軟骨細(xì)胞的凋亡(見(jiàn)圖3a，P<0.05)，同時(shí)抑制凋亡相關(guān)分子Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)水平(見(jiàn)圖3b，P<0.05)。

a 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 b WB檢測(cè)Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)水平

2.3 過(guò)表達(dá)circPDE4B對(duì)OA軟骨ECM降解的影響 為分析circPDE4B對(duì)OA軟骨ECM降解的影響，在OA軟骨細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染oe-NC和oe-circPDE4B后檢測(cè)ECM相關(guān)分子SOX9、COL2A1、MMP3和MMP13的表達(dá)水平。RT-qPCR結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)circPDE4B明顯促進(jìn)SOX9和COL2A1 mRNA的表達(dá)水平，抑制MMP3和MMP13 mRNA的表達(dá)水平(圖4a，P<0.05)。WB結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)circPDE4B明顯促進(jìn)SOX9和COL2A1蛋白的表達(dá)水平，抑制MMP3和MMP13蛋白的表達(dá)水平(圖4b，P<0.05)。

a RT-qPCR檢測(cè)ECM相關(guān)分子mRNA的表達(dá)水平 b WB檢測(cè)ECM相關(guān)分子蛋白的表達(dá)水平

2.4 circPDE4B能夠靶向結(jié)合miR-7 在機(jī)制研究中，雙熒光素酶基因報(bào)告結(jié)果顯示circPDE4B-WT組中轉(zhuǎn)染miR-7 mimics后雙熒光素活性明顯下降(見(jiàn)圖5a，P<0.05)，在circPDE4B-MUT組中轉(zhuǎn)染miR-7 mimics后雙熒光素活性未見(jiàn)明顯改變(見(jiàn)圖5a，P>0.05)。過(guò)表達(dá)circPDE4B能夠明顯抑制OA軟骨細(xì)胞中miR-7的表達(dá)水平(見(jiàn)圖5b，P<0.05)。miR-7的表達(dá)水平在OA軟骨組織中明顯高于半月板損傷患者軟骨組織(見(jiàn)圖5c，P<0.05)，Pearson相關(guān)性分析顯示circPDE4B和miR-7在OA患者軟骨組織中的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(見(jiàn)圖5d，P<0.05)。

a 雙熒光素酶基因報(bào)告 b RT-qPCR檢測(cè)miR-7的表達(dá)水平 c OA軟骨組織和半月板損傷軟骨組織 d circPDE4B和miR-7的表達(dá)相關(guān)性

2.5 circPDE4B調(diào)控miR-7對(duì)OA軟骨細(xì)胞凋亡的影響 在回復(fù)實(shí)驗(yàn)中，OA軟骨細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-circPDE4B和共轉(zhuǎn)染si-circPDE4B+miR-7 inhibitors，結(jié)果顯示低表達(dá)circPDE4B能夠明顯促進(jìn)OA軟骨細(xì)胞的凋亡(見(jiàn)圖6a，P<0.05)，同時(shí)促進(jìn)凋亡相關(guān)分子Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)水平(見(jiàn)圖6b，P<0.05)。共轉(zhuǎn)染si-circPDE4B和miR-7 inhibitors能夠反轉(zhuǎn)單獨(dú)轉(zhuǎn)染si-circPDE4B對(duì)OA軟骨細(xì)胞凋亡的影響(見(jiàn)圖6，P>0.05)。

a 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

2.6 circPDE4B調(diào)控miR-7對(duì)OA軟骨細(xì)胞ECM降解的影響 低表達(dá)circPDE4B能夠明顯抑制SOX9和COL2A1 mRNA的表達(dá)水平，促進(jìn)MMP3和MMP13 mRNA的表達(dá)水平(見(jiàn)圖7a，P<0.05)。WB結(jié)果顯示低表達(dá)circPDE4B能夠明顯抑制SOX9和COL2A1蛋白的表達(dá)水平，促進(jìn)MMP3和MMP13蛋白的表達(dá)水平(見(jiàn)圖7b，P<0.05)。共轉(zhuǎn)染si-circPDE4B和miR-7inhibitors能夠反轉(zhuǎn)單獨(dú)轉(zhuǎn)染si-circPDE4B對(duì)OA軟骨細(xì)胞ECM降解的影響(見(jiàn)圖7，P>0.05)。

a RT-qPCR檢測(cè)ECM相關(guān)分子mRNA的表達(dá)水平 b WB檢測(cè)ECM相關(guān)分子蛋白的表達(dá)水平

3 討 論

OA的典型病理改變包括軟骨破壞、骨贅形成和滑膜增生[10]。OA主要特征是基質(zhì)降解酶的上調(diào)，包括屬于金屬蛋白酶家族、含有血小板反應(yīng)蛋白基序的去整合素和金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS)以及細(xì)胞外間質(zhì)的丟失[11]。研究顯示circRNA-UBE2G1能夠通過(guò)調(diào)控miR-373/低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor，HIF)-1α軸抑制OA軟骨細(xì)胞活性和促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡[12]。circRNA-CER能夠調(diào)控miR-136/MMP-13軸抑制OA軟骨細(xì)胞增殖和促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡[12]。circRNA-CER能夠調(diào)控miR-136/MMP-13軸促進(jìn)OA軟骨ECM降解[13]。circ9119在OA軟骨細(xì)胞中明顯低表達(dá)，過(guò)表達(dá)circ9119能夠通過(guò)miR-26a/人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)軸抑制OA軟骨細(xì)胞的凋亡[14]。然而，circRNAs在OA中的作用還有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示circPDE4B的表達(dá)水平在OA軟骨組織和軟骨細(xì)胞中明顯低表達(dá)。細(xì)胞功能驗(yàn)證中，在OA軟骨細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染oe-NC和oe-circPDE4B，轉(zhuǎn)染oe-circPDE4B后能夠明顯提高circPDE4B在軟骨細(xì)胞中的表達(dá)水平。過(guò)表達(dá)circPDE4B能夠明顯抑制OA軟骨細(xì)胞的凋亡和凋亡相關(guān)分子Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)水平。ECM主要由膠原蛋白(例如Ⅱ、IX和XI型膠原)、糖蛋白和大量蛋白聚糖組成。ECM的降解和OA的發(fā)病密切相關(guān)，在OA中可表現(xiàn)出ECM相關(guān)分子SOX9和COL2A1的下調(diào)以及MMP3和MMP13的上調(diào)[15]。本研究結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)circPDE4B能夠明顯促進(jìn)SOX9和COL2A1的表達(dá)水平，抑制MMP3和MMP13的表達(dá)水平，這提示circPDE4B能夠抑制OA軟骨細(xì)胞的凋亡和ECM降解。研究顯示多種非編碼RNA能夠通過(guò)調(diào)控ECM降解參與心肺纖維化、心肌病、心力衰竭、哮喘、OA和癌癥等疾病[16]。

在機(jī)制研究中，circRNA最常見(jiàn)的功能為miRNA海綿吸附作用。研究顯示circSERPINE2在OA中明顯下調(diào)，低表達(dá)circSERPINE2能夠促進(jìn)OA軟骨細(xì)胞凋亡和ECM的降解[17]。本研究結(jié)果顯示circPDE4B能夠靶向結(jié)合miR-7，過(guò)表達(dá)circPDE4B能夠明顯抑制OA軟骨細(xì)胞中miR-7的表達(dá)水平。同時(shí)miR-7的表達(dá)水平在OA軟骨組織中明顯高于半月板損傷患者軟骨組織，Pearson相關(guān)系分析顯示circPDE4B和miR-7在OA患者軟骨組織中的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。這提示circPDE4B可能通過(guò)靶向調(diào)控miR-7參與OA的進(jìn)展。研究顯示miR-7在OA中明顯高表達(dá)，低表達(dá)miR-7能夠抑制OA軟骨細(xì)胞的凋亡和炎癥，促進(jìn)OA軟骨細(xì)胞的增殖[18]。同時(shí)circPDE4B還能夠通過(guò)調(diào)控miR-181c/HIF-1α軸抑制視網(wǎng)膜病理性血管生成[19]。

在回復(fù)實(shí)驗(yàn)中，OA軟骨細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-circPDE4B和共轉(zhuǎn)染si-circPDE4B+miR-7 inhibitors，結(jié)果顯示低表達(dá)circPDE4B能夠明顯促進(jìn)OA軟骨細(xì)胞的凋亡和軟骨ECM的降解，在共轉(zhuǎn)染si-circPDE4B和miR-7 inhibitors能夠反轉(zhuǎn)單獨(dú)轉(zhuǎn)染si-circPDE4B對(duì)OA軟骨細(xì)胞凋亡和軟骨ECM降解的促進(jìn)作用。研究顯示circPDE4B還能通過(guò)調(diào)控miR-103a-3p/成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)18軸抑制OA軟骨ECM降解[20]。

綜上所述，circPDE4B在OA軟骨組織和軟骨細(xì)胞中明顯低表達(dá)，circPDE4B能夠通過(guò)靶向結(jié)合miR-7抑制OA軟骨細(xì)胞凋亡和軟骨ECM降解。circPDE4B可能成為治療OA的重要干預(yù)靶點(diǎn)。