肖福川 吳 娜 張 靜,3 陳柏安,3 盧 靜,3*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)學(xué)系，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)再生修復(fù)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069; 3.首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部, 北京 100069)

認(rèn)知障礙是危害老年人健康的主要疾病之一[1]，因其病程長(zhǎng)、難逆轉(zhuǎn)、暫無有效治療方案，經(jīng)常導(dǎo)致患者日常生活自理能力減退[2]，并伴有各種神經(jīng)精神癥狀和障礙，給患者家庭和社會(huì)帶來極大負(fù)擔(dān)[3]。目前對(duì)散發(fā)性認(rèn)知功能障礙的根本病因尚不明確[1]，對(duì)散發(fā)性認(rèn)知障礙的治療方法也缺乏針對(duì)性。

筑巢行為實(shí)驗(yàn)常用來評(píng)估認(rèn)知障礙小鼠的日?；顒?dòng)[4]。該實(shí)驗(yàn)在對(duì)小鼠施加最小壓力的同時(shí)，可以評(píng)估其精細(xì)動(dòng)作的靈活性、認(rèn)知和情緒狀態(tài)[5]。對(duì)小鼠來說，高質(zhì)量的巢穴可以保溫、御敵，是一個(gè)保持安全感的重要場(chǎng)所[6]。小鼠的筑巢質(zhì)量主要受遺傳背景、環(huán)境溫度、母性經(jīng)驗(yàn)以及是否有幼仔等因素影響[7-9]。此外，小鼠的筑巢行為可分為集體筑巢和個(gè)體筑巢，集體筑巢反映的是小鼠的社會(huì)交互行為[10]，而個(gè)體筑巢則反映了小鼠的執(zhí)行功能。小鼠筑巢行為的機(jī)制目前尚不清楚，有研究者[11]推測(cè)其可能受到許多腦區(qū)和神經(jīng)遞質(zhì)活動(dòng)的控制。

臨床上，認(rèn)知障礙多是隨著年齡的增長(zhǎng)自然發(fā)生的，而不是外加誘導(dǎo)劑或者手術(shù)等方式導(dǎo)致的，所以研究與人類自發(fā)性認(rèn)知障礙更相似的動(dòng)物模型及其神經(jīng)病理特征能更好地為探究自發(fā)性認(rèn)知障礙疾病的病因和防治提供條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6小鼠(000664-JAX)購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2019-0008。本研究使用15月齡的C57BL/6小鼠39只，包括20只雌性和19只雄性，在首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部屏障環(huán)境[SYXK(京)2015-0012]飼養(yǎng)，經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：AEEI-2015-020)。

1.1.2 主要試劑與儀器

筑巢所用的壓縮紙片是由中生北動(dòng)(北京)科技發(fā)展有限公司定制，規(guī)格為7.5 cm×8 cm，3 g/片。突觸的標(biāo)志物突觸后密度蛋白95(postsynaptic density protein 95, PSD95;貨號(hào)：PA5-85749)抗體購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;神經(jīng)元樹突的標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白2(microtubule-associated protein 2, MAP2; 貨號(hào)：ab8130)抗體、神經(jīng)元軸突的標(biāo)志物神經(jīng)絲蛋白重鏈(neurofilament heavy chian,NFH；貨號(hào)：ab8135)抗體、神經(jīng)元的標(biāo)志物神經(jīng)元核抗原(neuronal nuclei,NeuN; 貨號(hào)：ab104224)抗體、星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP;貨號(hào)：ab53554)抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物離子鈣接頭蛋白1(ionized calcium bindingadaptor molecule 1, IBA1; 貨號(hào)：011-27991)抗體購(gòu)自日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社; 抗熒光淬滅封片劑(貨號(hào)：P0126)、DAPI(貨號(hào)：C1002)購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；EDTA抗原修復(fù)液、PBS緩沖液購(gòu)自北京基譜生物科技有限公司；無水乙醇、二甲苯購(gòu)于中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；全自動(dòng)脫水機(jī)(SYD-T2070)、石蠟包埋機(jī)(SYD-B-F)、病理取材臺(tái)(SYD-9804)、烘烤漂片機(jī)(SYD-PK)購(gòu)自沈陽(yáng)譽(yù)德電子儀器有限公司；石蠟切片機(jī)(Leica RM2016)購(gòu)于德國(guó)萊卡公司；載玻片及蓋玻片(10127105P-G)購(gòu)于江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司；溫控?fù)u床(TS-2000A)購(gòu)于海門市其林貝爾儀器制造有限公司；倒置熒光顯微鏡(Nikon Eclipse Ti-SR)購(gòu)于日本尼康公司；全景掃描儀(Pannoramic MIDI)購(gòu)于匈牙利3D HISTECH公司。

1.2 方法

1.2.1 筑巢

將實(shí)驗(yàn)小鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，移除所有的環(huán)境強(qiáng)化物品，在每個(gè)籠子里放一個(gè)3.0 g的方形壓縮棉片(Nestlets)。48 h后，用筑巢五分評(píng)級(jí)量表[4]評(píng)估筑巢情況，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)詳見表1。稱量所有未使用的Nestlets質(zhì)量，精確到0.1 g(約Nestlets質(zhì)量的4%)。

表1 筑巢實(shí)驗(yàn)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(方法)[4]

1.2.2 免疫熒光染色

將實(shí)驗(yàn)組(15月齡野生型小鼠)中筑巢障礙的小鼠與筑巢表現(xiàn)良好的小鼠，進(jìn)行麻醉、心臟灌注后取腦，使用4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛液將組織固定，脫水包埋后進(jìn)行切片，厚度為4 μm。脫蠟、抗原修復(fù)后加5%(體積分?jǐn)?shù))的正常山羊封閉血清室溫孵育 20 min。棄去封閉血清后，加入一抗(稀釋比為1∶250)孵育過夜。滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗覆蓋切片(兔二抗bs-0295G-FITC和羊二抗bs-0294D-cy3 稀釋比均為1∶400)，避光室溫孵育60 min。加入DAPI染液，避光室溫孵育10 min。用抗熒光淬滅封片劑封片。取景拍照。

1.2.3 分組方法

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 老齡小鼠筑巢能力障礙的模型篩選

根據(jù)筑巢結(jié)果，15月齡WT小鼠評(píng)分為2.52±0.41。本實(shí)驗(yàn)中小鼠實(shí)際筑巢情況(圖1)證明了本研究所采用的筑巢5分法的可操作性。篩選出了7只(17.9%)發(fā)生筑巢障礙的小鼠，其中有1只小鼠在實(shí)驗(yàn)過程中死亡，以及5只(12.8%)筑巢能力良好的小鼠。

圖1 筑巢實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 筑巢能力障礙的老齡小鼠突觸表達(dá)水平

免疫熒光結(jié)果顯示，小鼠腦內(nèi)PSD95標(biāo)記的突觸呈綠色圓點(diǎn)狀，筑巢能力障礙組小鼠腦內(nèi)顳葉區(qū)突觸的免疫熒光強(qiáng)度與筑巢能力良好組相比降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而海馬組間區(qū)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

圖2 筑巢功能障礙組和良好組小鼠腦內(nèi)PSD95表達(dá)

2.3 筑巢能力障礙的老齡小鼠神經(jīng)元樹突表達(dá)水平

免疫熒光結(jié)果顯示，小鼠腦內(nèi)MAP2標(biāo)記的神經(jīng)元樹突呈綠色長(zhǎng)絲狀，筑巢能力障礙組小鼠腦內(nèi)顳葉區(qū)神經(jīng)元樹突的免疫熒光強(qiáng)度與筑巢能力良好組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而海馬區(qū)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。

圖3 筑巢功能障礙組和良好組小鼠腦內(nèi)MAP2表達(dá)

2.4 筑巢能力障礙的老齡小鼠神經(jīng)元軸突表達(dá)水平

免疫熒光結(jié)果顯示，小鼠腦內(nèi)NFH標(biāo)記的神經(jīng)元軸突呈綠色絲狀，筑巢能力障礙組小鼠腦內(nèi)顳葉區(qū)和海馬區(qū)NFH的免疫熒光強(qiáng)度與筑巢能力良好組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖4)。

圖4 筑巢功能障礙組和良好組小鼠腦內(nèi)NFH表達(dá)

2.5 筑巢能力障礙的老齡小鼠神經(jīng)元數(shù)量

免疫熒光結(jié)果顯示，小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN主要表達(dá)在細(xì)胞核上呈紅色圓形，筑巢能力障礙組小鼠腦內(nèi)顳葉區(qū)和海馬區(qū)神經(jīng)元(NeuN)的陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)與筑巢能力良好組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖5)。

圖5 筑巢功能障礙組和良好組小鼠腦內(nèi)NeuN表達(dá)

2.6 筑巢能力障礙的老齡小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量

免疫熒光結(jié)果顯示，小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物IBA1主要表達(dá)在細(xì)胞膜上，筑巢能力障礙組小鼠腦內(nèi)顳葉區(qū)和海馬區(qū)IBA1的陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)與筑巢能力良好組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖6)。

圖6 筑巢功能障礙組和良好組小鼠腦內(nèi)IBA1表達(dá)

2.7 筑巢能力障礙的老齡小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量

免疫熒光結(jié)果顯示，小鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP主要表達(dá)在細(xì)胞膜上，發(fā)生筑巢能力障礙組小鼠腦內(nèi)顳葉區(qū)和海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)與筑巢能力良好組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖7)。

圖7 筑巢功能障礙組和良好組小鼠腦內(nèi)GFAP表達(dá)

3 討論

隨著人們生活質(zhì)量的提高，人口老齡化的現(xiàn)象越來越嚴(yán)重，年齡相關(guān)性疾病，尤其是認(rèn)知功能障礙極大地影響了人們的生活質(zhì)量，引起了人們的關(guān)注[12-13]。但是，自發(fā)性認(rèn)知障礙的原因目前尚不清楚，老年群體中出現(xiàn)散發(fā)性的認(rèn)知障礙個(gè)體的機(jī)制也有待研究。認(rèn)知包括記憶、語(yǔ)言、視空間、執(zhí)行、計(jì)算和理解判斷等多方面，個(gè)體筑巢實(shí)驗(yàn)可用于評(píng)估小鼠日?；顒?dòng)的執(zhí)行能力[14]。本研究通過個(gè)體筑巢實(shí)驗(yàn)篩選出了自然發(fā)生筑巢障礙的老齡小鼠，并通過免疫熒光染色分析了自然發(fā)生筑巢障礙小鼠腦內(nèi)認(rèn)知相關(guān)的神經(jīng)病理學(xué)變化特征。

小鼠的遺傳背景、生長(zhǎng)及飼養(yǎng)環(huán)境、筑巢材料及實(shí)驗(yàn)方法等因素均可影響個(gè)體筑巢實(shí)驗(yàn)結(jié)果[11]。本研究選用了遺傳背景相近的15月齡近交系野生型小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，實(shí)驗(yàn)組小鼠表現(xiàn)出了筑巢能力的差異。為了探索這一現(xiàn)象的原因，以實(shí)驗(yàn)組為標(biāo)準(zhǔn)，從實(shí)驗(yàn)組中篩選出了7只自然發(fā)生筑巢障礙的小鼠(17.9%)，以及5只筑巢表現(xiàn)良好的小鼠(12.8%),該發(fā)病率與國(guó)內(nèi)臨床上認(rèn)知功能障礙的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果(20.8%)[15]相近。這個(gè)結(jié)果提示，通過筑巢實(shí)驗(yàn)篩選出自然發(fā)生筑巢障礙的小鼠模型可用于研究自發(fā)性認(rèn)知功能障礙。

PSD位于神經(jīng)元興奮性突觸后膜，參與突觸后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和整合，可調(diào)節(jié)突觸谷氨酸受體的定位[16]。PSD95是指相對(duì)分子質(zhì)量為95 000的突觸后致密蛋白，是PSD的主要成分[17]。PSD95本身無蛋白酶活性，主要是通過不同結(jié)構(gòu)域與相關(guān)受體及信號(hào)分子結(jié)合，形成信號(hào)復(fù)合物發(fā)揮作用，具有參與突觸連接的形成、維持突觸的可塑性等多種生物學(xué)功能，與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[18]。本研究通過免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)自然發(fā)生筑巢障礙的老齡小鼠顳葉區(qū)的突觸的免疫熒光強(qiáng)度較筑巢良好組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而海馬區(qū)突觸差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。氧化應(yīng)激、離子型谷氨酸受體介導(dǎo)的興奮性毒性作用及線粒體功能障礙等均可能導(dǎo)致顳葉區(qū)突觸可塑性降低[19]，但具體原因目前尚未闡明，還需深入探究。

神經(jīng)元樹突和軸突復(fù)雜的形狀決定了細(xì)胞可以建立的突觸連接，具有重要作用。它與細(xì)胞分子成分選擇性地分布到軸突或樹突的特定區(qū)域有著千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系[20]。微管是神經(jīng)元樹突中的主要骨架蛋白，參與維持細(xì)胞形態(tài)及物質(zhì)運(yùn)輸?shù)冗^程[21]。MAP2是一種定位于神經(jīng)元樹突的微管相關(guān)蛋白[22]。本研究通過免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)自然發(fā)生筑巢障礙的老齡小鼠顳葉區(qū)的神經(jīng)元樹突的免疫熒光強(qiáng)度較筑巢良好組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，推測(cè)其可能出現(xiàn)的原因是DNA損傷的異常修復(fù)或能量代謝障礙[23]，有待進(jìn)一步的研究。而海馬區(qū)神經(jīng)元樹突呈現(xiàn)減少趨勢(shì)，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這個(gè)結(jié)果提示，筑巢反映的認(rèn)知障礙可能與顳葉所負(fù)責(zé)的情感活動(dòng)有關(guān)，而不是海馬區(qū)負(fù)責(zé)的短期學(xué)習(xí)記憶。

NFH是軸突的主要成分之一，是神經(jīng)元軸突的標(biāo)志物[24]。NeuN是一種神經(jīng)元核抗原，可識(shí)別神經(jīng)元的胞體，通常用作神經(jīng)元的標(biāo)記[25]。IBA1為小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，是一種離子鈣結(jié)合銜接分子。在機(jī)體受到損傷或者感染時(shí)，正常情況下處于靜息狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞被激活活化為具有免疫功能的細(xì)胞，此時(shí)，IBA1會(huì)上調(diào)[26]。GFAP是一種膠質(zhì)纖維酸性蛋白，是活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，參與細(xì)胞骨架的構(gòu)成并維持其張力強(qiáng)度[27]。在本研究中，自然發(fā)生筑巢障礙的15月齡C57BL/6小鼠腦內(nèi)顳葉區(qū)和海馬區(qū)的神經(jīng)元軸突的免疫熒光強(qiáng)度、神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞以及星形膠質(zhì)細(xì)胞的陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？沙醪秸J(rèn)為，筑巢實(shí)驗(yàn)篩選出的筑巢障礙模型，未發(fā)生神經(jīng)元軸突的損傷以及神經(jīng)元的凋亡，并且自發(fā)性筑巢障礙的原因可能不是小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞異常所引起的神經(jīng)炎癥反應(yīng)。

綜上所述，通過筑巢實(shí)驗(yàn)可以篩選出老齡小鼠自然發(fā)生筑巢障礙的模型，該篩選方法簡(jiǎn)單易學(xué)，實(shí)驗(yàn)周期短，不會(huì)引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)激，具有良好的可操作性和重復(fù)性。本研究中筑巢障礙組老齡小鼠顳葉區(qū)突觸和神經(jīng)元樹突的顯著減少提示突觸可塑性的降低可能是導(dǎo)致發(fā)生自發(fā)性筑巢障礙的原因，但具體的機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。