杜天舒 宮曉麗 艾孜兒·艾尼瓦爾 張 震 劉 玚 王曉民2,,4* 張 婷*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)教育部神經(jīng)變性病重點實驗室, 北京 100069；3.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系，北京 100069；4.北京腦重大疾病研究院，北京 100069)

小膠質(zhì)細胞是腦內(nèi)數(shù)量最大的免疫細胞群, 在大腦的任何病理損傷下都會發(fā)生小膠質(zhì)細胞的激活[1]。國內(nèi)外大量基礎(chǔ)研究[2-3]顯示，帕金森病(Parkinson’s disease, PD)模型中存在小膠質(zhì)細胞的早期激活。小膠質(zhì)細胞也是腦內(nèi)特異的吞噬細胞，其在生理條件下的吞噬功能主要包括清除凋亡或壞死細胞，阻止促炎和神經(jīng)毒性分子的溢出以及通過吞噬突觸、軸突和髓磷脂碎片參與神經(jīng)元連接性的重塑[4]。在病理條件下，細菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)等Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)激動劑激活小膠質(zhì)細胞后，其吞噬功能增強，大量吞噬活的神經(jīng)元而引起神經(jīng)元死亡[5]。在6羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)，1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)等PD模型中也有類似的發(fā)現(xiàn)。

小膠質(zhì)細胞的表型和功能均受到來自神經(jīng)元細胞的免疫檢查點(check point)機制的嚴(yán)格調(diào)控。在慢性疾病或衰老中，這種檢查點機制限制小膠質(zhì)細胞的過度激活；小膠質(zhì)細胞免疫檢查點機制跨越多層監(jiān)管，其中細胞和細胞之間的交流包括CX3CL1-CX3CR1、CD200-CD200R、CD22-CD45、CD47-SIRPa[6]。本課題組前期工作[7-8]篩選出對中腦黑質(zhì)小膠質(zhì)細胞有特異性作用的免疫檢查點分子CD200-CD200R1，并且進一步深入研究發(fā)現(xiàn)，CD200R1敲除小鼠的腦內(nèi)炎癥水平變化不明顯，內(nèi)吞水平明顯增加。然而，CD200R1對小膠質(zhì)細胞內(nèi)吞水平的影響及分子機制未見報道。那么CD200R1對小膠質(zhì)細胞內(nèi)吞功能的影響到底是什么？因此本實驗通過熒光微球內(nèi)吞實驗研究LPS模型下BV2小膠質(zhì)細胞的內(nèi)吞功能，并通過RT-qPCR實驗檢測LPS模型下CD200R1的表達情況，進一步通過CD200R1敲除動物提取原代小膠質(zhì)細胞，研究CD200R1對LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞內(nèi)吞功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

BV2細胞和SH-SY5Y細胞購自協(xié)和細胞庫，出生24 h 內(nèi)SD大鼠乳鼠訂購于北京維通利華公司，實驗動物許可證號:SYXK(京)2017-0033。DMEM-F12培養(yǎng)基、青鏈霉素(penicillin-streptomycin solution，PS)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰蛋白酶(美國Hyclone公司)；多聚-L-賴氨酸、細胞級別細菌脂多糖(美國Sigma公司)；CellTrackerTMGreen CMFDA、Carboxylate-Modified熒光微球、Trizol(美國Invitrogen公司產(chǎn)品)；多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)主要成分十二水磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、二水合磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、氯化鈉(NaCl)(北京化工廠)；三氯甲烷、異丙醇(北京現(xiàn)代東方科技發(fā)展有限公司)；快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒(FastQuant RT Kit)(北京天根生化科技有限公司)；熒光防淬滅封片劑(美國Vector公司)，PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix、CO2恒溫培養(yǎng)箱、生物安全柜、4 ℃層析柜(美國Thermo 公司)；電動移液器(德國Brand公司)；超純水純化系統(tǒng)(美國Millipore公司)；電子天平(德國Sartorius公司)；倒置光學(xué)體式顯微鏡(日本Olympus公司)；正置熒光顯微鏡(德國Zeiss公司)；水浴鍋(北京方通達科技有限公司)；高壓消毒滅菌鍋(日本Tomy公司)；水平搖床(北京六一儀器廠)；Vortex-T 旋渦混合器(美國Scientific industries公司)；-20 ℃冰箱(中國海爾公司)；-40 ℃冰箱(中國中科美菱公司)；-80 ℃ 超低溫冰箱(德國NUAIR公司產(chǎn)品)；顯微器械(美國WPI公司)；pH儀(英國Jenway公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

將BV2細胞株、SH-SY5Y細胞株和原代小膠質(zhì)細胞分別培養(yǎng)在含10%(體積分?jǐn)?shù))FBS和1%(體積分?jǐn)?shù))PS的DMEM-F12培養(yǎng)基中，5%(體積分?jǐn)?shù))的CO2，37 ℃恒溫箱恒溫孵育。

1.2.2 SH-SY5Y細胞染色

首先配制CellTrackerTMGreen CMFDA染料，讓產(chǎn)品溫?zé)嶂潦覝亍⒚科?0 μg凍干的產(chǎn)品溶于高質(zhì)量11 μL DMSO中，使其終濃度為10 mmol/L,用錫紙包裹，避光保存于-20 ℃，用前稀釋至工作濃度。

將提前用37 ℃水浴鍋預(yù)熱的0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的胰酶消化SH-SY5Y細胞2～5 min，邊消化邊在顯微鏡下觀察，觀察到大約90%以上的細胞消化下來時，用含10%(體積分?jǐn)?shù))FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，計數(shù)后，轉(zhuǎn)速1 000g,10 min離心收集細胞，將細胞輕輕懸浮在預(yù)熱的1 mL無血清的CellTrackerTM工作液中，工作液濃度為5 μmol/L(吸0.5 μL 配制好的10 mmol/L的CellTrackerTMGreen CMFDA 到1 mL無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中)在37 ℃，5%(體積分?jǐn)?shù))CO2孵箱中孵育15 min后離心收集細胞，用5 mL的0.01 mol/L的PBS重懸洗滌細胞，離心收集細胞，重復(fù)2次后，用含10%(體積分?jǐn)?shù))FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基重選細胞，以2.5×104/孔接種于24孔板的BV2細胞上，用于接下來的內(nèi)吞實驗。

1.2.3 熒光微球內(nèi)吞實驗

將BV2細胞以5×104/孔接種于放有高壓滅菌過的細胞玻片的24孔板上，在37 ℃，5%(體積分?jǐn)?shù))CO2孵箱中培養(yǎng)，穩(wěn)定24 h后用于實驗；分別用1 μg/mL的LPS處理BV2細胞6 h以及0.1 μg/mL的LPS處理BV2細胞6、12、24 h;在收取細胞2 h前分別加入1.5 μL,即5.4×106個1 μm的熒光微球，37 ℃，5%(體積分?jǐn)?shù))CO2孵箱孵育2 h;收取細胞，首先用預(yù)冷的0.01 mol/L的PBS洗5 min×5次，注意避光；然后用4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的多聚甲醛室溫固定20 min；0.01 mol/L PBS洗5 min×3次, Hoechst用0.3%(體積分?jǐn)?shù))Triton X-100 1∶5 000稀釋后，每孔300 μL加入孔板中，室溫避光孵育15 min染細胞核,0.01 mol/L PBS洗5 min×3次,將玻片取出，熒光封片劑封片后，Confocal共聚焦顯微鏡拍照；每個樣本計數(shù)50個細胞內(nèi)吞熒光微球的情況，分別統(tǒng)計細胞內(nèi)吞分?jǐn)?shù)(將不吞珠子的細胞記為0分，吞1個熒光微球的細胞記為1分，吞兩個熒光微球的細胞記為2分，依次類推，將吞6個及6個以上的熒光微球的細胞記為6分)、內(nèi)吞比例以及單個細胞平均內(nèi)吞熒光微球的數(shù)量。BV2細胞和SH-SY5Y細胞共培養(yǎng)條件時，前一天以5×104/孔接種BV2細胞到細胞玻片，第二天將5 μmol/L CellTrackerTM Green CMFDA染色15 min的SH-SY5Y細胞以2.5×104/孔接種于24孔板的BV2細胞上，待SH-SY5Y細胞穩(wěn)定后，分別用1 μg/mL和0.1 μg/mL的LPS處理BV2和SH-SY5Y共培養(yǎng)體系6 h和24 h，之后采用上述同樣的方法進行熒光微球內(nèi)吞實驗。

為了研究CD200R1對原代小膠質(zhì)細胞內(nèi)吞功能的影響，分別從野生型(WT)小鼠及CD200R1基因敲除小鼠提取WT和CD200R1-/-原代小膠質(zhì)細胞，體外培養(yǎng)14 d后搖取并接種在24 h孔板上，穩(wěn)定24 h后，用于之后的實驗。加入0.1 μg/mL的LPS處理24 h，在收取細胞前2 h加入熒光微球，2 h后固定細胞，通過IBA1免疫熒光染色標(biāo)記小膠質(zhì)細胞，并計數(shù)各組細胞內(nèi)吞熒光微球的數(shù)量；同時，在BV2小膠質(zhì)細胞中分別加入2.5 μg/mL的CD200Fc，3 μg/mL 的CD200R1-Ab，1 μg/mL 的LPS，以及1 μg/mL的LPS和2.5 μg/mL CD200Fc共同處理6 h進行熒光微球內(nèi)吞實驗。

1.2.4 RT-qPCR實驗

首先用預(yù)冷的PBS清洗一遍六孔板細胞，棄去PBS后每孔加入750 mL Trizol，室溫靜置15 min后，收集細胞至1.5 μL EP管中，提取總RNA。加入200 μL預(yù)冷的氯仿，并在Votex上震蕩15 s，裂解液呈現(xiàn)出粉色乳液狀后，室溫繼續(xù)靜置10 min后，4 ℃，12 000g，離心20 min；此時，吸取上清加入等體積預(yù)冷的異丙醇，室溫靜置10 min后，4 ℃，12 000g，離心15 min；此時可看見EP管底部白色的RNA沉淀，棄去上清，每管加入1 μL預(yù)冷的用DEPC水配制的75%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇，然后4 ℃，7 500g，離心5 min。重復(fù)兩次棄凈上清后，每管加入20 mL的RNase-free H2O溶解RNA沉淀，60 ℃金屬浴加熱10 min。獲取總RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參通過RT-qPCR檢測腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及CD200R1的相對表達改變，CD200R1、TNF-α和GAPDH的序列如下：m-CD200R1上游引物：5′-GGAAAACCAGAAAACCGAAATG-3′；m-CD200R1下游引物：5′-CCCCCATATTAAGAGCACTGCTA-3′；m-TNF-α上游引物：5′-CCAGTGTGGGAAGCTGTCTT-3′；m-TNF-α下游引物：5′-AAGCAAAAGAGGAGGCAACA-3′，m-GAPDH上游引物：5′-AGAACATCATCCCTGCATCC-3′，m-GAPDH下游引物：5′-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3′。循環(huán)參數(shù)如下：第一步UDG激活，50 ℃，2 min；第二步 95 ℃預(yù)變性10 min；第三步95 ℃變性15 s，60 ℃退火，72 ℃延伸 1 min，40個循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

首先對計量資料進行正態(tài)性檢驗，滿足正態(tài)分布的資料，采用 GraphPad Prism 8.0版軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組間比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間兩兩比較采用Newman-Keuls檢驗。如不服從正態(tài)分布，采用非參數(shù)檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS促進BV2小膠質(zhì)細胞內(nèi)吞水平的時效曲線

LPS處理后BV2小膠質(zhì)細胞內(nèi)吞水平明顯增加(圖1A)；LPS處理6 h后0分細胞數(shù)相比于對照組下降了55.9%，6分細胞數(shù)相比于對照組增加了228%(圖1B)。LPS處理6 h后每個細胞平均內(nèi)吞的熒光微球數(shù)量最多為6.93個，相比于對照組平均內(nèi)吞熒光微球的2.55個，增加了約172%；LPS處理12 h和24 h后每個細胞平均內(nèi)吞熒光微球的數(shù)量分別為5.07個和5.02個，相比于對照組分別增加了99%和97%(圖1C)。

2.2 LPS促進BV2小膠質(zhì)細胞內(nèi)吞水平的量效曲線

熒光微球內(nèi)吞實驗顯示，與0.1 μg/mL的LPS處理組相比，1 μg/mL LPS 并沒有引起B(yǎng)V2小膠質(zhì)細胞內(nèi)吞的進一步增加(圖2A)；1 μg/mL LPS處理6 h組的BV2小膠質(zhì)細胞6分細胞數(shù)量相比于對照組BV2小膠質(zhì)細胞增加了189%；而0.1 μg/mL LPS處理6 h組的BV2小膠質(zhì)細胞6分細胞數(shù)量相比于對照組BV2小膠質(zhì)細胞增加了228%(圖2B)；同時，1 μg/mL LPS處理6 h時每個細胞平均內(nèi)吞的熒光微球數(shù)量為5.37個，相比于對照組平均內(nèi)吞熒光微球的2.55個，增加了約111%，而0.1 μg/mL LPS處理6 h 時每個細胞平均內(nèi)吞的熒光微球數(shù)量，相比于對照組，增加了約172%(圖2C)。

圖2 不同濃度的LPS引起B(yǎng)V2小膠質(zhì)細胞內(nèi)吞功能的變化

2.3 LPS下調(diào)BV2小膠質(zhì)細胞中CD200R1的表達水平

隨著LPS濃度的遞增，TNF-α的水平也在遞增，分別增加了241%、458%、668%(圖3A)，同時，0.1 μg/mL LPS明顯引起了CD200R1表達下降，與對照組相比，0.1 μg/mL LPS處理3 h組CD200R1水平下降了35.62%(圖3B)。

圖3 不同濃度LPS引起B(yǎng)V2小膠質(zhì)細胞TNF-α表達升高，CD200R1的表達下降

2.4 LPS促進神經(jīng)元-小膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)體系中BV2小膠質(zhì)細胞的內(nèi)吞水平

熒光微球內(nèi)吞實驗可觀察到BV2小膠質(zhì)細胞內(nèi)吞功能的變化(圖4A)，當(dāng)分別用0.1 μg/mL和1 μg/mL 的LPS處理共培養(yǎng)體系6 h時，每個BV2小膠質(zhì)細胞平均內(nèi)吞熒光微球數(shù)量分別為4.89和6.3個，相比于對照組的2.17個，分別增加了125%和190%；同時當(dāng)分別用0.1 μg/mL和1 μg/mL的LPS處理共培養(yǎng)體系24 h時，每個細胞平均內(nèi)吞熒光微球的數(shù)量分別為6.14和5.85個，相比于對照組的1.37個，分別增加了348%和327%(圖4B)

圖4 LPS促進神經(jīng)元-小膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)體系中BV2小膠質(zhì)細胞的內(nèi)吞水平

2.5 SH-SY5Y細胞與BV2細胞接觸后抑制LPS誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細胞內(nèi)吞水平的增加

為了進一步研究神經(jīng)元對小膠質(zhì)細胞內(nèi)吞能力的影響，將小膠質(zhì)細胞區(qū)分為與SH-SY5Y直接接觸的細胞(白色箭頭所指)和非直接接觸細胞(三角形所指)(圖5A)；通過熒光微球內(nèi)吞實驗，分別統(tǒng)計了直接接觸SH-SY5Y和非直接接觸SH-SY5Y的BV2小膠質(zhì)細胞平均內(nèi)吞熒光微球的數(shù)量，結(jié)果顯示直接接觸SH-SY5Y的小膠質(zhì)細胞平均內(nèi)吞熒光微球1.08個，非直接接觸的小膠質(zhì)細胞平均內(nèi)吞熒光微球9.31個，與直接接觸SH-SY5Y的小膠質(zhì)細胞相比增加了大約762%(圖5B)。

圖5 SH-SY5Y細胞抑制LPS誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細胞內(nèi)吞水平的增加

2.6 CD200R1缺失的原代小膠質(zhì)細胞對LPS引起的內(nèi)吞更敏感，內(nèi)吞更強

IBA1免疫熒光染色標(biāo)記小膠質(zhì)細胞(圖6A)，與WT組小膠質(zhì)細胞相比，CD200R1-/-小膠質(zhì)細胞在LPS處理后平均內(nèi)吞熒光微球的數(shù)量明顯增多，大約增加了144%(圖6B)，提示CD200R1缺失的原代小膠質(zhì)細胞對LPS引起的內(nèi)吞更敏感，內(nèi)吞更強。

在BV2小膠質(zhì)細胞中加入CD200R1-Ab后，其平均內(nèi)吞熒光微球的數(shù)量明顯增多，與對照組細胞相比增加了116%，并且與LPS處理組相比，LPS+CD200Fc共同處理組小膠質(zhì)細胞平均內(nèi)吞熒光微球的數(shù)量下降了54.66%(圖6C)。

圖6 CD200R1缺失的原代小膠質(zhì)細胞對LPS引起的內(nèi)吞更敏感，內(nèi)吞更強

3 討論

小膠質(zhì)細胞的吞噬作用與炎癥作用關(guān)系密切。吞噬作用為細胞對在質(zhì)膜包膜內(nèi)(>0.5 μm)顆粒的攝取[9]。由單核細胞、巨噬細胞、樹突細胞、朗格漢斯細胞、破骨細胞和小膠質(zhì)細胞等吞噬細胞負責(zé)清除感染因子、死細胞和組織碎片，并參與免疫應(yīng)答[10]。

Li等[11]在2019年的報道中，用0.1 μg/mL的LPS處理BV2小膠質(zhì)細胞24 h引起其吞噬比例的明顯增加，這與本團隊在BV2小膠質(zhì)細胞上得到的結(jié)果一致。本研究應(yīng)用0.1 μg/mL的LPS分別處理BV2小膠質(zhì)細胞6、12、24 h，通過熒光微球內(nèi)吞實驗觀察BV2小膠質(zhì)細胞的內(nèi)吞能力，結(jié)果表明LPS處理6、12、24 h均能引起B(yǎng)V2小膠質(zhì)細胞內(nèi)吞能力增加，但是LPS處理6 h時內(nèi)吞熒光微球的細胞明顯多于對照組細胞，同時本研究對至少50個細胞平均內(nèi)吞熒光微球數(shù)量進行了統(tǒng)計，觀察到LPS處理6 h時細胞平均內(nèi)吞熒光微球數(shù)量相比于對照組平均內(nèi)吞熒光微球的2.55個，增加了約172%。這與Kawabe等[12]得到的結(jié)論一致，Kawabe等通過直徑為1 μm的熒光微球，和凋亡/死細胞來分別評估胞飲和吞噬作用，發(fā)現(xiàn)LPS刺激的BV2小膠質(zhì)細胞中微球的熒光以濃度依賴的方式增加，與沒有LPS刺激的對照細胞相比，濃度為30～300 ng/mL時有顯著差異。另外，Lin等[13]報道0.1 μg/mL的LPS處理24 h 的BV2細胞與SH-SY5Y細胞共培養(yǎng)，使SH-SY5Y細胞的存活率下降了大約50%(SH-SY5Y∶BV2=1∶1)。本研究用0.1 μg/mL LPS處理BV2和SH-SY5Y共培養(yǎng)體系6 h和24 h，通過熒光微球內(nèi)吞實驗觀察到BV2小膠質(zhì)細胞吞噬能力增加，這與Lin等[13]用的LPS濃度和處理時間一致，推測BV2細胞內(nèi)吞水平的改變直接影響了與其共培養(yǎng)的神經(jīng)元存活。

PD主要的病理變化是中腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元進行性減少[14]，并伴隨著大量小膠質(zhì)細胞的激活[15-16]。小膠質(zhì)細胞免疫檢查點機制細胞和細胞之間的交流包括CX3CL1-CX3CR1、CD200-CD200R、CD22-CD45、CD47-SIRPa[6]。其中 CD200分子是一種I-型膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族(immuno-globulins superfamily，IgSF)成員，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，CD200主要在神經(jīng)元表達，而其受體CD200R1只表達在小膠質(zhì)細胞等髓系細胞上[17]。Lyons等[18]發(fā)現(xiàn)CD200缺失的小鼠來源的小膠質(zhì)細胞內(nèi)吞熒光微球的數(shù)量明顯增加，并伴有溶酶體標(biāo)志物CD68的表達增加；Varnum等[19]發(fā)現(xiàn)離體培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞加入CD200Fc激活CD200R1后吞噬Aβ42的水平增加。本研究將體外培養(yǎng)14 d的WT組和CD200R1-/-組原代小膠質(zhì)細胞搖取并接種于提前PLL鋪板過夜的24孔板玻片上，加入0.1 μg/mL的LPS處理24 h，觀察其內(nèi)吞熒光微球的情況，結(jié)果表明,與CD200R1-/-組原代小膠質(zhì)細胞相比，CD200R1-/-加LPS處理組的原代小膠質(zhì)細胞平均內(nèi)吞熒光微球的數(shù)量明顯增多，大約增加了144%，即CD200R1缺失的原代小膠質(zhì)細胞對LPS引起的內(nèi)吞更敏感，內(nèi)吞更強；并且在加入CD200R1的封閉抗體后小膠質(zhì)細胞的內(nèi)吞功能也有所增加。以上差異提示，小膠質(zhì)細胞吞噬不同目標(biāo)，其分子通路不同。CD200與受體結(jié)合可能促進了小膠質(zhì)細胞吞噬Aβ42分子，但是其對LPS介導(dǎo)的吞噬或小膠質(zhì)細胞對其他細胞、細胞碎片、細胞外基質(zhì)的吞噬，有不同的作用。總之，LPS促進了小膠質(zhì)細胞內(nèi)吞水平的增加以及CD200R1表達的下降，并且在BV2-SH-SY5Y共培養(yǎng)模型中，神經(jīng)元細胞接觸小膠質(zhì)細胞后抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞內(nèi)吞增加，最后CD200R1敲除的小膠質(zhì)細胞加入LPS處理后，內(nèi)吞水平增加更明顯，既CD200R1缺失促進了LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞內(nèi)吞。研究結(jié)果將提示PD早期小膠質(zhì)細胞激活的分子機制，為早期干預(yù)提供新的潛在靶點。