趙玉澤,王 旖,魏志剛,梁 鋼，肖 虹*

(1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀壇醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,北京 100038；2 西安市第九醫(yī)院病理科；3 山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院普通外科；4 山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院病理科；*通訊作者,E-mail:xiaohh9999@163.com)

原發(fā)性肝癌在惡性腫瘤死亡率中位列全球第三[1]，且為我國最常見的惡性腫瘤之一[2]，對人類的生命健康產(chǎn)生著極大威脅。目前肝癌的治療手段主要為外科手術(shù)、經(jīng)肝動脈化療栓塞術(shù)(TACE)、放化療及抗血管生成、免疫治療等[3]。但大多數(shù)肝癌患者診斷時已為腫瘤晚期而喪失手術(shù)機會，且通常肝功能不全、一般情況較差，對放化療敏感性及耐受性欠佳[4]，因此，研究新的治療方法迫在眉睫。

研究發(fā)現(xiàn)，多種中藥可通過抑制肝癌細胞增殖、誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡、抑制侵襲轉(zhuǎn)移等作用達到控制和殺滅肝癌細胞的目的[5-7]。黃連素是我國應(yīng)用很久的中藥，可從黃連、黃柏、三顆針等植物中提取，因其具有顯著的抑菌作用，常用來治療胃炎、結(jié)腸炎、腹瀉等疾病[8]。近年來發(fā)現(xiàn)黃連素可以改善腫瘤的自噬活性，發(fā)揮抑制腫瘤增殖、侵襲、誘導(dǎo)細胞凋亡的作用[9,10]，已有大量體內(nèi)外試驗在多個癌種，如肺癌、宮頸癌、鼻咽癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤中觀察到黃連素的抗腫瘤效應(yīng)[10-15]。有文獻報道，在肝癌中，黃連素可通過參與多個信號通路的調(diào)節(jié)來促進腫瘤凋亡、抑制腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移[16]、抗血管生成[17]而發(fā)揮抑癌作用，如黃連素可誘導(dǎo)HepG2細胞中活性氧損傷(ROS)生成，耗竭細胞內(nèi)抗氧化劑而誘導(dǎo)肝細胞凋亡[18,19]。但是，黃連素是否還可通過影響其他凋亡相關(guān)基因表達，從而促進腫瘤細胞凋亡仍值得深入探討。Caspase-3是凋亡途徑中最重要的效應(yīng)因子，它的激活是凋亡進入不可逆階段的標志[20]。Bcl-2基因是一種凋亡抑制基因[21,22]，其表達蛋白可抑制多種組織細胞的凋亡和延長細胞壽命，在多種腫瘤中表達上調(diào)，其過表達也可減少氧自由基的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化物的形成而抑制細胞凋亡。基于此，本研究將應(yīng)用HepG2肝癌細胞株，重點研究黃連素是否可通過調(diào)節(jié)Caspase-3、Bcl-2蛋白表達從而影響肝癌細胞的增殖及凋亡，探討其抗腫瘤的可能機制，并通過比較不同濃度黃連素作用下細胞凋亡的比例，探索黃連素在抗腫瘤治療中可能的最佳藥物濃度。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑

人肝癌細胞株HepG2由山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗室饋贈。10%胎牛血清(美國HyClone公司)；RMPI 1640培養(yǎng)液(中國武漢博士德生物工程有限公司)；0.25%胰酶(美國HyClone公司)。黃連素(固體結(jié)晶，20 mg/支，成都曼思特生物科技有限公司)。CCK-8試劑盒(中國武漢博士德生物工程有限公司)。Bcl-2抗體(美國Santa Cruz公司)、p-Bcl-2抗體(美國Cell Signaling公司)。辣根酶標記山羊抗兔IgG(中國北京中杉金橋生物工程公司)。

1.2 HepG2肝癌細胞株的培養(yǎng)

HepG2細胞置于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，加入青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 U/ml)，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)。次日待細胞貼壁后更換細胞培養(yǎng)液，以后每3 d更換一次培養(yǎng)液，待細胞長到培養(yǎng)瓶的80%左右時進行傳代和凍存。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖

取對數(shù)生長期HepG2細胞，鋪于直徑6 cm皿中(5×106/皿)，接種于96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后分別加入配置為終濃度1，10，50，100 μmol/L的黃連素溶液，每個濃度設(shè)3個平行孔，并設(shè)置調(diào)零組，每組分別在培養(yǎng)12，24，36，48 h后，加入10 μl/孔CCK-8，培養(yǎng)箱2 h，在酶標儀450 nm處測定吸光度(A)值，計算各組細胞的增殖抑制率，繪制生長曲線。生長抑制率=[1-(加藥組A值-調(diào)零組A值)/(0 μmol/L組A值-調(diào)零組A值)]×100%。

1.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

使用propidium iodide(PI)和Annexin Ⅴ染色通過流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。將對數(shù)生長期的HepG2細胞接種于6孔板，培養(yǎng)12 h。依據(jù)黃連素不同濃度分為5組：0，1，10，50，100 μmol/L組。于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h后收集各組細胞，按照Annexin Ⅴ-PI細胞凋亡檢測試劑盒說明操作，用1× binding buffer調(diào)整細胞密度為1×105/ml，再加入5 μl Annexin Ⅴ和5 μl PI，混勻，4 ℃避光染色20 min，加入400 μl 1× binding buffer，采用PI和Annexin Ⅴ染色通過流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。

1.5 Western blot法檢測Bcl-2和caspase-3蛋白表達

檢測不同濃度(0，1，10，50，100 μmol/L)黃連素處理后細胞中Bcl-2和Caspase-3蛋白表達，將各組收集的細胞用預(yù)冷的PBS清洗后,按照蛋白裂解液RIPA操作說明提取蛋白，BCA法進行蛋白定量,將各組蛋白濃度調(diào)成一致,沸水煮5 min,待用。分別取各組總蛋白樣品80 μg，以樣品中的GAPDH為內(nèi)參，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，然后用含5%脫脂奶粉的PBS封閉2 h，加入適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋Bcl-2抗體(1 ∶1 000)、Caspase-3抗體(1 ∶1 000)，內(nèi)參GAPDH相關(guān)一抗(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜，二抗IgG(稀釋比例均為1 ∶5 000)室溫孵育1 h，TBST清洗，ECL暗室顯色。掃描顯影條帶圖像并存入圖像分析系統(tǒng)，應(yīng)用Image J圖像分析系統(tǒng)計算各樣本條帶灰度值，蛋白相對表達量以Bcl-2和Caspase-3灰度值與GAPDH灰度值的比值計算。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 黃連素對HepG2細胞增殖的影響

與0 μmol/L相比，1，10，50，100 μmol/L黃連素干預(yù)的HepG2細胞吸光度值降低，由吸光度值計算出的生長抑制率升高，具體統(tǒng)計學(xué)結(jié)果見表1。可見在12，24，36，48 h時，肝癌細胞生長抑制率均隨藥物濃度升高而逐漸增加(P<0.05)，且通過相關(guān)性分析顯示，黃連素對HepG2細胞生長抑制率的影響呈濃度及時間依賴性。

表1 黃連素對HepG2細胞增殖的影響Table 1 Effects of berberine on HepG2 cell proliferation

2.2 黃連素對HepG2細胞凋亡的影響

我們應(yīng)用流式檢測，不同濃度黃連素(0，1，10，50，100 μmol/L)作用48 h后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著黃連素的濃度升高，細胞凋亡的數(shù)量占比逐漸升高，不同黃連素濃度間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=15.008，P=0.000，見圖1)。

圖1 黃連素作用48 h對HepG2細胞凋亡的影響Figure 1 Effect of berberine on apoptosis of HepG2 cells after treatment for 48 h

2.3 黃連素對HepG2細胞Caspase-3及Bcl-2蛋白表達的影響

Western blot結(jié)果顯示，經(jīng)黃連素作用后，HepG2細胞Bcl-2蛋白的表達逐漸降低，Caspase-3蛋白的表達逐漸增高。應(yīng)用Mann-WhitneyU檢驗方法分析，結(jié)果顯示，10，50，100 μmol/L組與0 μmol/L組相比，Bcl-2及caspase-3表達水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖2)。

與0 μmol/L組相比，* P <0.05圖2 黃連素對HepG2細胞Caspase-3及Bcl-2蛋白表達的影響Figure 2 Effect of berberine on the expression of Caspase-3 and Bcl-2 protein in HepG2 cells

3 討論

中藥與常規(guī)化療藥物相比，有多方面、多層面和低毒性的優(yōu)勢，從整體上系統(tǒng)地調(diào)控機體抑制腫瘤。黃連素因其顯著的抗炎作用，一直以來被應(yīng)用于消化系統(tǒng)疾病，最近越來越多研究發(fā)現(xiàn)，黃連素還能夠提高宿主免疫功能，通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖而發(fā)揮抑瘤作用[23]。在人結(jié)直腸癌細胞株HT-29中發(fā)現(xiàn)，黃連素可通過抑制JAK2/STAT3信號傳導(dǎo)通路抑制HT-29細胞增殖并促進其凋亡[10]。本研究結(jié)果顯示，黃連素可抑制肝癌HepG2細胞的增殖，從細胞水平進一步證實黃連素具有抑制腫瘤生長的作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)與0 μmol/L相比，不同濃度黃連素分別作用于人肝癌細胞株HepG2不同時間后，細胞抑制率隨藥物濃度及時間的增加而升高(P<0.05)。黃連素以0，1，10，50，100 μmol/L的濃度分別作用48 h后，HepG2細胞凋亡率逐漸升高(F=15.008，P=0.000)，且隨著黃連素作用濃度的升高，HepG2細胞Bcl-2蛋白的表達逐漸降低，Caspase-3蛋白的表達逐漸增高，與0 μmol/L相比，10，50，100 μmol/L黃連素作用后Bcl-2和Caspase-3蛋白表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

Caspase與真核細胞的凋亡密切相關(guān)，凋亡執(zhí)行因子Caspase-3可介導(dǎo)細胞凋亡的死亡受體途徑及線粒體途徑并激活其他Caspase成員，從而誘導(dǎo)細胞凋亡[24]，也是細胞毒T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)殺傷機制的重要組成部分。Bcl-2為一種癌基因，可干擾一系列細胞毒作用引起的細胞凋亡，包括阻斷Caspase-3的促凋亡途徑。目前已發(fā)現(xiàn)，黃連素在乳腺癌[25]、胃癌[26]中可下調(diào)Bax、Bcl-2表達而起到促凋亡作用。為了探討黃連素的抗腫瘤作用機制，本實驗通過Western blot檢測不同黃連素作用濃度下Caspsae-3和Bcl-2蛋白的表達，結(jié)果顯示，與0 μmol/L相比，10，50，100 μmol/L黃連素作用下的HepG2細胞Caspsae-3表達上調(diào)，Bcl-2蛋白表達下調(diào)，而且不同濃度下對Caspsae-3、Bcl-2的影響也不一，我們發(fā)現(xiàn)應(yīng)用黃連素濃度從10 μmol/L起開始影響上述2種蛋白的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，從分子水平證明黃連素可通過促進Caspase的激活、下調(diào)Bcl-2表達從而抑制腫瘤細胞增殖生長、促進腫瘤細胞凋亡，為黃連素的抗腫瘤作用機制提供了依據(jù)。

此外，Bcl-2可增強細胞對大多數(shù)DNA損傷因子的抵抗，而抑制大多數(shù)化療藥物所引起的靶細胞凋亡，最終導(dǎo)致腫瘤耐藥。而黃連素對Bcl-2的阻斷作用，可能會一定程度逆轉(zhuǎn)肝癌化療過程中的耐藥現(xiàn)象，以及增加腫瘤對放療、靶向治療和免疫治療的敏感性。目前已有報道在細胞水平發(fā)現(xiàn)，黃連素聯(lián)合化療或靶向治療的療效優(yōu)于單藥，如黃連素聯(lián)合索拉菲尼或奧沙利鉑[27]以及黃連素聯(lián)合甲磺酸阿帕替尼[28]，均發(fā)現(xiàn)聯(lián)合黃連素較單藥對肝癌細胞的凋亡有增效作用。但目前針對黃連素的抗腫瘤研究還局限在細胞及實驗動物水平，在腫瘤患者中，黃連素的作用及其聯(lián)合化療、靶向藥物甚至免疫治療的療效還有待大型臨床試驗的證實。

綜上所述，黃連素對肝癌細胞HepG2有抑制作用，通過上調(diào)Caspsae-3及下調(diào)Bcl-2蛋白表達誘導(dǎo)其凋亡，其抗腫瘤效應(yīng)可為肝細胞癌提供新的治療思路。其次，我們的研究證明了不同濃度下的黃連素對肝癌細胞增長抑制作用不同，10 μmol/L的黃連素濃度就可以明顯抑制肝癌細胞的增長，影響肝癌細胞中凋亡蛋白的表達情況從而引起腫瘤凋亡。此外本研究還證明了隨著黃連素濃度的增加，腫瘤細胞的抑制率也相應(yīng)的增高，這提示我們在臨床中應(yīng)用黃連素抗腫瘤治療劑量需要進一步摸索，在不增加副作用的情況下需要找到抗腫瘤治療的最佳濃度，為后續(xù)黃連素在臨床中應(yīng)用的最佳濃度提供了證據(jù)。