張 艷，趙淑珍，何 靜，張 婷

(新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，新疆 烏魯木齊 830000)

銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa,PA)是誘發(fā)院內(nèi)感染的主要致病菌，屬于革蘭陰性菌，在革蘭陰性菌感染中的占比接近30.00%[1-2]。燒傷、肺囊纖維化等機體免疫力降低患者是PA感染高危群體，除了浮游菌外，生物被膜(biofilm,BF)亦是誘發(fā)PA感染的危險因素之一，并且BF形成是造成PA耐藥性增強的主要原因之一。BF指細(xì)菌黏附于表面并分泌胞外物質(zhì)包裹細(xì)胞，形成多細(xì)胞聚集膜狀物，是自然界多數(shù)細(xì)菌的主要存活方式，具有致密復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，為細(xì)菌形成了抗生素屏障，最終造成細(xì)胞耐藥性增強[3]。PA通過形成BF逃避宿主防御、生物殺滅劑、抗生素造成的損傷，進而誘發(fā)腦膜炎、角膜炎、囊性纖維化等疾病，對患者臨床治療以及感染預(yù)防管理均造成嚴(yán)重威脅[4-5]。因此研發(fā)抑制PA的BF形成與耐藥性新方案已成為臨床感染預(yù)防中亟待解決的問題。金銀花主要活性成分包括的綠原酸，人殺菌肽LL-37是參與人體先天免疫的抗菌肽之一，c-di-GMP是在細(xì)菌中廣泛存在的第二信使，c-di-GMP在細(xì)菌周期生長、分化等多個生理過程中均有參與并發(fā)揮一定的調(diào)控作用，與細(xì)菌的耐藥性以及致病菌持久性間存在密切聯(lián)系[6]。本研究旨在明確綠原酸、c-di-GMP、人殺菌肽LL-37對銅綠假單胞菌BF形成及其耐藥性的作用，為后續(xù)新型抗PA藥物的研發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1材料 本實驗使用的銅綠假單胞菌野生型由丹麥哥本哈根大學(xué)臨床微生物科提供，本研究已通過醫(yī)學(xué)倫理委員會審核準(zhǔn)許。

1.2主要試劑與儀器 人殺菌肽LL-37購自南京肽業(yè)生物科技有限公司，綠原酸購自國家食品藥品檢定研究所，Muller-Hinton肉湯(MHB)、LB培養(yǎng)基、結(jié)晶紫、LIVE/DEADBacLight Viability Kit(Invitrogen)購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。二甲基亞礬(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自北京索萊寶科技有限公司，無菌黏附載玻片購自江蘇世泰實驗器材有限公司，Multiskan酶標(biāo)儀購自Thermo公司，JET BIOFIL24/96孔板購自廣州潔特生物公司，BX53+DP80熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯有限公司。

1.3方法

1.3.1人殺菌肽LL-37、綠原酸、c-di-GMP最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)檢測方法 取-80 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆玫腜A復(fù)蘇24 h，選取平板上單個菌落在MHB液體培養(yǎng)基中進行接種，在37 ℃條件下?lián)u床過夜后收集菌體，加入MHB培養(yǎng)基稀釋至1×103CFU/L濃度。加入CLSI肉湯進行微量稀釋后測定PA的人殺菌肽LL-37、綠原酸、c-di-GMP MIC，用DMSO溶解干預(yù)藥物后，采用滅菌MHB培養(yǎng)基進行倍比稀釋處理，人殺菌肽LL-37最終濃度為1 024、512、256、128、64、32、16、8、4 mg/L，綠原酸的最終濃度為16 384、8 192、4 096、2 048、1 024、512、256、128、64 mg/L，c-di-GMP的最終濃度為1 024、512、256、128、64、32 mg/L。在含有不同濃度藥物的96孔中加入100 μL制備好的菌液，體系總體積為200 μL，陰性對照組僅加入等體積的MHB培養(yǎng)基，空白組僅加入等體積的菌液，在37 ℃下持續(xù)培養(yǎng)24 h后判定結(jié)果，培養(yǎng)基清澈且藥物稀釋濃度最小的為最低抑菌濃度。

1.3.2檢測人殺菌肽LL-37、綠原酸、c-di-GMP對PA早期BF形成的抑制作用 按照1.3.1方法配置菌液以及藥物濃度，依據(jù)1.3.1方法分組介入菌液以及藥物后進行培養(yǎng)，早期BF形成后丟棄培養(yǎng)液，每孔用無菌雙蒸水重復(fù)沖洗2次，人殺菌肽LL-37、綠原酸、c-di-GMP分別取6個孔各加入200 μL MIC藥物，空白組加入等體積MHB培養(yǎng)基，在37 ℃條件下培養(yǎng)，持續(xù)24 h后丟棄藥物培養(yǎng)液，采用無菌雙蒸水反復(fù)沖洗3次，晾干加入220 μL 0.1%結(jié)晶紫染色，染色15 min后沖洗、晾干，加入220 μL 95%乙醇溶解，10 min后應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測590 nm波長處的各孔吸光度(optical density，OD)。

1.3.3PA運動試驗 ①泳動干預(yù)實驗。人殺菌肽LL-37組、綠原酸組、c-di-GMP組分別取6個孔各加入200 μL MIC藥物，陰性對照組僅加入等體積的MHB培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中間層接種單個菌落，置于37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)，持續(xù)24 h后觀察以接種菌落區(qū)域為中心的云霧狀區(qū)域并記錄區(qū)域直徑。②集群運動干預(yù)實驗。人殺菌肽LL-37組、綠原酸組、c-di-GMP組分別取6個孔各加入200 μL最低抑菌濃度藥物，陰性對照組僅加入等體積的MHB培養(yǎng)基，各菌株利用培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜后稀釋至OD590=0.05，各吸取5 μL菌株菌液接種于培養(yǎng)基表面，置于37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)，持續(xù)24 h后觀察以接種菌落區(qū)域為中心的生長區(qū)域并記錄區(qū)域直徑。

1.3.4檢測人殺菌肽LL-37、綠原酸、c-di-GMP對PA早期BF形態(tài)的影響 按照1.3.1方法配置菌液以及不同濃度藥液，24孔培養(yǎng)板中放置無菌蓋玻片，加入1 mL制備的菌液，在37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)，持續(xù)24 h形成早期BF后，丟棄培養(yǎng)基并加入無菌雙蒸水反復(fù)漂洗，漂洗掉浮游菌，人殺菌肽LL-37組、綠原酸組、c-di-GMP組分別取6個孔各加入1 mL的最低抑菌濃度藥物，空白組加入1 mL的等體積MHB培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)24 h后附著BF載體，按照1∶1比例的Syto熒光染料與碘化丙啶配置，并按照1∶5 000比例加入滅菌生理鹽水稀釋，沒過載體在避光條件下染色，30 min后取出載體，加入7.4 pH的PBS溶液，漂洗掉多余染料置于熒光顯微鏡下觀察，記錄PA的存活情況?；罹鸀榫G色熒光，死菌均為紅色熒光，二者重疊為橙色熒光。

1.3.5測定人殺菌肽LL-37、綠原酸、c-di-GMP對PA耐藥性的影響 人殺菌肽LL-37組、綠原酸組、c-di-GMP組分別取25個孔各加入200 μL最低抑菌濃度藥物，陰性對照組僅加入等體積的MHB培養(yǎng)基，按照倍比稀釋法加入美羅培南藥液，最終濃度為32、16、8、4、2 mg/L，選取平板上單個菌落在MHB液體培養(yǎng)基中進行接種，記錄每組的5個最低美羅培南抑菌濃度，根據(jù)MIC值評估菌株的BF耐藥情況[7]，MIC≤4 mg/L為敏感，MIC≥16 mg/L為耐藥，計算耐藥率。

1.4觀察指標(biāo) ①分析PA的人殺菌肽LL-37、綠原酸、c-di-GMP MIC值，對比PA早期BF形成中人殺菌肽LL-37、綠原酸、c-di-GMP的抑制作用，參考指標(biāo)為OD590nm值；②比較各組的PA運動試驗結(jié)果，包括泳動干預(yù)實驗、集群運動干預(yù)實驗的生長區(qū)域直徑；③比較PA早期人殺菌肽LL-37、綠原酸、c-di-GMP對BF形態(tài)的影響；④對比人殺菌肽LL-37、綠原酸、c-di-GMP對PA耐藥性的影響，包括耐藥率。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較采用t檢驗和SNK-q檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1人殺菌肽LL-37、綠原酸、c-di-GMPMIC值及對PA早期BF形成抑制作用人殺菌肽LL-37、綠原酸、c-di-GMP的MIC值分別為64、256、32 mg/L，c-di-GMP組的OD590nm值明顯高于人殺菌肽LL-37組、綠原酸組、空白組的OD590nm值，且人殺菌肽LL-37組、綠原酸組的OD590nm明顯低于空白組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。人殺菌肽LL-37組、綠原酸組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 PA早期人殺菌肽LL-37、綠原酸、c-di-GMP的BF形成抑制作用Table 1 Inhibitory effect of human bactericidal peptide LL-37, chlorogenic acid and c-di-GMP on BF formation in the early stage of PA

2.2各組的PA運動試驗結(jié)果比較 人殺菌肽LL-37組、綠原酸組、c-di-GMP組的泳動干預(yù)實驗生長區(qū)域直徑、集群運動干預(yù)實驗生長區(qū)域直徑均明顯低于陰性對照組，且人殺菌肽LL-37組、綠原酸組明顯低于c-di-GMP組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。人殺菌肽LL-37組、綠原酸組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組的PA運動試驗結(jié)果比較Table 2 Comparison of PA exercise testing results in each group

2.3比較PA早期人殺菌肽LL-37、綠原酸、c-di-GMP的BF形態(tài)差異 空白組、c-di-GMP組BF濃密且呈綠色熒光，人殺菌肽LL-37組、綠原酸組綠色熒光明顯減少，主要是紅色熒光與橙色熒光，BF稀疏。見圖1。

圖1 PABF形態(tài)差異A.空白；B.c-di-GMP組；C.綠原酸組；D.人殺菌肽LL-37組Figure 1 Morphological differences of PA-BF

2.4人殺菌肽LL-37、綠原酸、c-di-GMP的PA耐藥性比較 c-di-GMP組的耐藥率明顯高于人殺菌肽LL-37組、陰性對照組、綠原酸組，且人殺菌肽LL-37組、綠原酸組的耐藥率明顯低于陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，人殺菌肽LL-37組、綠原酸組數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 人殺菌肽LL-37、綠原酸、c-di-GMP的PA耐藥性比較Table 3 Comparison of PA resistance of human bactericidal peptide LL-37, chlorogenic acid and c-di-GMP

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，人殺菌肽LL-37組、綠原酸組的OD590nm值低于空白對照組，人殺菌肽LL-37組、綠原酸組的PA運動試驗直徑明顯低于陰性對照組，人殺菌肽LL-37組、綠原酸組紅色熒光明顯增多，且綠色熒光明顯減少，提示綠原酸、人殺菌肽LL-37BF形成中均可發(fā)揮良好的清除作用。人殺菌肽LL-37主要由絲氨酸蛋白酶3在細(xì)胞外將hCAP-18裂解而成，hCAP-18是中性粒細(xì)胞特定顆粒中的主要蛋白質(zhì)，在固有免疫系統(tǒng)中起到重要作用，因此抗菌能力良好，可以有效抑制BF的形成[8-9]。李更森等[10]研究表示煙曲霉BF形成中綠原酸可起到一定的抑制作用，綠原酸是金銀花的主要有效成分，可以破壞早期與成熟期的生物膜結(jié)構(gòu)，同時可以通過減少胞外基質(zhì)促進藥液對生物膜的滲透，增強殺菌作用，加快菌絲崩解，最終減少生物膜，與本研究結(jié)果相符，說明人殺菌肽LL-37、綠原酸均可以有效抑制BF形成。

本研究結(jié)果顯示，c-di-GMP組PA運動試驗直徑明顯低于陰性對照組，c-di-GMP組的PA存活情況與空白組相近，且明顯優(yōu)于人殺菌肽LL-37組、綠原酸組，空白組、c-di-GMP組主要為綠色熒光，c-di-GMP組的OD590nm值高于空白組，提示相比于陰性對照組或者空白組，c-di-GMP組的c-di-GMP水平增加，使其細(xì)胞運動能力降低，同時增加了PA的BF形成與PA存活率，進而降低PA的BF清除效果。分析抑制PA運動行為的作用機制如下：游泳運動指的是液體環(huán)境中的細(xì)胞通過旋轉(zhuǎn)鞭毛進行運動的過程，c-di-GMP增加可以結(jié)合FleQ的Wallker A模體結(jié)合，進而對FleQ的ATP酶活性及其鞭毛組裝基因轉(zhuǎn)錄過程產(chǎn)生抑制作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞游泳運動能力降低[11]。而細(xì)胞集群運動是指在群體細(xì)胞基礎(chǔ)上通過四型菌毛、鞭毛參與下進行的表面協(xié)同運動，c-di-GMP的合成與分解在細(xì)胞黏附表面進行集群運動過程中起到一定調(diào)控作用，c-di-GMP與鞭毛馬達間存在密切關(guān)系，c-di-GMP可通過系列反應(yīng)調(diào)控鞭毛馬達，且c-di-GMP升高后，會使FlgZ蛋白以依賴c-di-GMP的形式對MotC產(chǎn)生作用，進而對集群運動產(chǎn)生抑制作用，而抑制細(xì)胞集群運動在BF形成具有重要作用，因此從整體上分析，c-di-GMP升高會限制細(xì)胞的運動能力，進而促進PA的BF形成[12-13]。另外Wan等[14]研究表示胞外多糖是BF形成的重要成分，c-di-GMP可以通過調(diào)控胞外多糖(exopolysaccharides,EPSs)的方式參與BF形成過程，c-di-GMP升高可以解除FleQ與pelA啟動子結(jié)合產(chǎn)生的抑制pel基因的作用，將FleQ轉(zhuǎn)化為激活因子，促進Pel多糖產(chǎn)生，進而促進BF的產(chǎn)生。結(jié)合本研究結(jié)果分析得出，c-di-GMP增加，可以通過抑制細(xì)胞運動行為、調(diào)控胞外多糖等多種途徑參與PABF形成過程并起到促進作用。

致病菌形成BF后，被包裹在BF內(nèi)的致病菌面對抗菌藥物滅殺能力、微環(huán)境壓力以及宿主自身的免疫攻擊的耐受力增強，耐藥率相應(yīng)提高，因此抑制PA的BF形成是降低細(xì)胞耐藥性的關(guān)鍵[15-16]。本研究結(jié)果顯示，c-di-GMP組的耐藥性明顯高于人殺菌肽LL-37組、綠原酸組、陰性對照組，人殺菌肽LL-37組、綠原酸組耐藥率低于陰性對照組。結(jié)合研究的BF形成結(jié)果可得出，綠原酸、人殺菌肽LL-37可有效發(fā)揮清除BF的作用，同時降低細(xì)胞耐藥性，而c-di-GMP增加會促進BF形成，反向增加了細(xì)胞耐藥性，因此降低c-di-GMP水平是抑制PA的BF形成以及降低細(xì)胞耐藥性的新靶點。本研究仍存在一定不足，例如納入的菌株數(shù)量較少，可能會影響耐藥性檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，另外c-di-GMP濃度對BF形成具有重要影響，本研究未針對不同濃度c-di-GMP下PA的BF形成情況進行深入研究，研究設(shè)計思路上仍可進一步完善，可作為后續(xù)研究的一個重點拓展方向。

綜上所述，PA的BF行程中綠原酸、人殺菌肽LL-37均可起到清除作用，而c-di-GMP具有抑制細(xì)胞運動能力的作用，并且通過該途徑調(diào)控PA的BF形成過程，后續(xù)PA的BF防治中綠原酸、人殺菌肽LL-37以及c-di-GMP均具有廣闊的研究前景。