徐金娥，張 征

(1.湖北省天門市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖北 天門 431700；2.湖北省安陸市普愛醫(yī)院普外科，湖北 安陸 432600)

2型糖尿病是一種常見的代謝紊亂疾病，是世界范圍內(nèi)死亡的主要原因之一[1]。肝臟是胰島素主要的靶點之一，通過平衡肝臟葡萄糖的輸出和儲存，維持機體內(nèi)的葡萄糖穩(wěn)態(tài)[2]。胰島素抵抗為2型糖尿病的重要特性之一，肝臟葡萄糖代謝紊亂可導致肝臟胰島素抵抗，最終引發(fā)2型糖尿病[3]。胰島素樣生長因子結合蛋白2(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 2，IGF2BP2)的主要功能是調節(jié)細胞代謝[4]，其基因表達水平與胰島素抵抗值呈正相關[5]。通過TargetScan Human 7.2網(wǎng)站預測，可顯示IGF2BP2為miR-188-5p的靶向基因，Ding等[6]研究亦證實了miR-188與IGF2BP2之間的靶向關系。因此推測過表達miR-188-5p可能對胰島素抵抗發(fā)揮作用。胰島素反應性葡萄糖轉運蛋白4(glucose transporter type 4 protein，GLUT4)對機體葡萄糖代謝發(fā)揮關鍵性作用，調控GLUT4表達為代謝性疾病的治療提供全新的方向[7]。但關于miR-188-5p對GLUT4表達的影響以及在胰島素抵抗中的作用鮮有報道。本研究通過高糖誘導人肝癌細胞Hep G2胰島素抵抗模型，干預細胞中miR-188-5p的表達水平，觀察細胞對葡萄糖攝取以及GLUT4表達的影響，闡述miR-188-5p在Hep G2細胞胰島素抵抗的作用，以期為2型糖尿病的治療提供新的潛在靶點。

1 材料與方法

1.1細胞、試劑與儀器 人肝癌細胞Hep G2源自中國科學院上海細胞庫。DMEM購自美國Hyclone公司，胎牛血清、Opti-MEM購自美國Gibco公司，D-(+)-葡萄糖購自美國Sigma公司，反轉錄試劑盒購自大連TaKaRa公司，SYBR Green PCR試劑盒購自美國KAPA Biosystems公司，CCK8溶液、糖原含量檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，葡萄糖測試盒購自南京建成生物工程研究所，小鼠抗人GLUT4抗體購自英國Abcam公司，Lipofectamine RNAiMAX購自美國Invitrogen公司，miR-188-5p mimic、inhibitor及其對應的NC由廣州銳博生物科技有限公司合成。倒置顯微鏡(德國萊卡公司，型號：DMIL LED)，熒光定量PCR儀(美國Bio Rad公司，型號：CFX-Connect 96)，凝膠成像系統(tǒng)(北京君意東方電泳設備有限公司，型號：JY045-3C)，酶標儀(杭州奧盛儀器有限公司，型號：AMR-100)，激光共聚焦顯微鏡(日本Nikon公司，型號：C2)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 將人肝癌細胞Hep G2從液氮罐中取出，于37 ℃水浴至凍存液完全融化。將細胞懸液轉移至新離心管中，1 000 r/min離心3 min，棄上清，加入1 mL DMEM重懸細胞沉淀。轉移至培養(yǎng)瓶中，再加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2胰島素抵抗細胞模型構建 待細胞融合度達到70%～80%后，將細胞分為對照組和模型組，對照組采用含5.5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基孵育24 h，而模型組細胞則采用含高濃度(30 mmol/L)葡萄糖的培養(yǎng)基孵育24 h。檢測細胞中葡萄糖含量對胰島素抵抗細胞模型進行鑒定。

1.2.3實驗分組及處理 收集對數(shù)生長期的Hep G2細胞，將其分為6組：①對照組：含5.5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；②模型組：含30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h[8]，含5.5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；③miR-188-5p mimic組：含30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，miR-188-5p mimic轉染細胞，含5.5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)繼續(xù)24 h；④mimic-NC組：含30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，miR-188-5p mimi-NC轉染細胞，含5.5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)繼續(xù)24 h；⑤miR-188-5p inhibitor組：含30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，miR-188-5p inhibitor轉染細胞，含5.5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)繼續(xù)24 h；⑥inhibitor-NC組：含30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，miR-188-5p inhibitor NC轉染細胞，含5.5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)繼續(xù)24 h。

1.2.4細胞瞬時轉染 轉染前48 h，將2×105個細胞接種于6孔板中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后采用含30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。取1 μL mimic或inhibitor稀釋于50 μL Opti-MEM中，混勻。取3 μL Lipofectamine RNAiMAX稀釋于50 μL Opti-MEM中，混勻。將2種稀釋液混合，輕輕搖勻，室溫孵育5 min。將混合液滴加于細胞板中，輕輕混勻，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.5qPCR檢測miR-188-5p表達水平 TRIzol試劑提取各組細胞總RNA，采用反轉錄試劑盒合成cDNA，再使用SYBR Green PCR試劑盒進行qPCR檢測，以U6為內(nèi)參基因，計算各組細胞中miR-188-5p相對表達量。qPCR反應程序：95 ℃，3 min；95 ℃ 5 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 25 s，39個循環(huán)；65℃，5 s。引物序列：miR-188-5p上游引物：5′-GGGCATCCCTTGCATG-3′，miR-188-5p下游引物：5′-AGAAGCCCHCTACCTG-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.6CCK8法檢測細胞增殖活力 按照不同分組處理細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出細胞板，每孔加入10 μL CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。于酶標儀中檢測各孔在450 nm處的吸光值，根據(jù)所測吸光值計算各組細胞增殖率。

1.2.7生化實驗檢測細胞內(nèi)葡萄糖及糖原含量 收集各組細胞制備細胞懸液，1 000 r/min離心10 min，棄上清。PBS清洗2次，1 000 r/min離心10 min，棄上清。根據(jù)試劑盒說明書操作，處理細胞收集待測液，加樣進行檢測。于酶標儀中分別檢測505 nm和620 nm處的吸光度，計算各組細胞內(nèi)葡萄糖及糖原含量。

1.2.8免疫熒光染色觀察細胞中GLUT4蛋白的表達水平 在細胞孔板中加入大小合適的玻片，再將各組細胞制成單細胞懸液接種于對應的孔板中，培養(yǎng)過夜。PBS清洗2次，加入4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS清洗3次。加入0.5% Triton X-100室溫通透20 min，再封閉1 h。將玻片取出置于濕盒中，加入一抗(CLUT4，1∶200)，室溫孵育1 h。PBS清洗3次，加入二抗，室溫孵育1 h。PBS清洗5次，滴加含DAPI的抗熒光淬滅封片液作用10 min。細胞面朝下，貼在載玻片上，于顯微鏡中觀察細胞內(nèi)GLUT4蛋白表達情況。

1.3統(tǒng)計學方法 應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件數(shù)據(jù)分析。計量資料比較采用獨立樣本t檢驗、單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1胰島素抵抗細胞模型鑒定 與對照組比較，高糖誘導的胰島素抵抗模型組細胞中葡萄糖含量降低，差異有統(tǒng)計學意義[(0.93±0.03)mmol/Lvs.(0.46±0.04)mmol/L，t=25.145，P<0.001)]，符合胰島素抵抗模型對葡萄糖攝取率降低的特征。

2.2各組miR-188-5p表達水平及細胞增殖率比較 與對照組比較，模型組細胞miR-188-5p表達水平下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，miR-188-5p mimic組細胞中miR-188-5p表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，miR-188-5p inhibitor組細胞中miR-188-5p表達水平下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，mimic-NC組和inhibitor-NC組細胞中miR-188-5p表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與對照組比較，胰島素抵抗模型組細胞增殖率降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，miR-188-5p mimic組細胞增殖率上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，miR-188-5p inhibitor組細胞增殖率下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，mimic-NC組和inhibitor-NC組細胞增殖率無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組細胞中miR-188-5p表達、增殖率比較Table 1 Comparison of miR-188-5p experssion and proliferation rate in each group

2.3miR-188-5p提高胰島素抵抗細胞內(nèi)葡萄糖及糖原含量 與對照組比較，模型組細胞內(nèi)葡萄糖及糖原含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，miR-188-5p mimic組細胞內(nèi)葡萄糖及糖原含量上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，miR-188-5p inhibitor組細胞內(nèi)葡萄糖及糖原含量下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，mimic-NC組和inhibitor-NC組細胞內(nèi)葡萄糖及糖原含量無明顯變化，差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組細胞中葡萄糖及糖原水平比較Table 2 Comparison of glucose and glycogen levels in each group

2.4miR-188-5p促進胰島素抵抗細胞中GLUT4蛋白的表達 與對照組相比，模型組細胞中GLUT4蛋白表達減少；與模型組比較，miR-188-5p mimic組細胞中GLUT4蛋白表達上升，而miR-188-5p inhibitor組細胞中GLUT4蛋白表達下降，mimic-NC組和inhibitor-NC組細胞中GLUT4蛋白表達無明顯變化。見圖1。

圖1 免疫熒光染色觀察Hep G2細胞中GLUT4蛋白的表達藍色為細胞核，紅色為GLUT4蛋白Figure 1 Expression of GLUT4 protein in Hep G2 cells by immunofluorescence

3 討 論

胰島素抵抗指胰島素作用的組織和器官對胰島素的敏感性降低，導致胰島素促進的葡萄糖攝取和利用的效率降低，胰島素抵抗受到多種因素的影響[9]。胰島素抵抗與2型糖尿病明顯相關[10]，是2型糖尿病的病理生理前兆[11]。因此，對胰島素抵抗的抑制，可能是治療2型糖尿病的主要方向之一。

miRNA是一類表觀遺傳的轉錄后調控因子，參與了多種細胞過程的調控，在2型糖尿病的胰島素抵抗病理過程中也發(fā)揮重要作用[12]。Paschen等[13]研究顯示，miR-138-5p在胰島素抵抗Hep G2細胞中表達增加，而沉默miR-138-5p可增加細胞內(nèi)葡萄糖的攝取與糖原合成，有效抑制細胞的胰島素抵抗。Wu等[14]研究結果顯示，沉默miR-29a可改善胰島素誘導的葡萄糖攝取，增加GLUT4向質膜的轉運，因此，抑制miR-29a可能是治療胰島素抵抗和2型糖尿病的一種新策略。miR-188-5p在腫瘤中的相關研究甚多[15-16]，在胰島素抵抗和2型糖尿病中的研究卻并不多見，但相關研究顯示miR-188-5p與胰島素抵抗相關蛋白的表達有密切聯(lián)系[6]。本研究結果顯示，上調胰島素抵抗Hep G2細胞中miR-188-5p的表達，可明顯促進細胞增殖，改善細胞中葡萄糖攝取以及糖原合成，而沉默miR-188-5p則導致胰島素抵抗現(xiàn)象加劇，提示miR-188-5p可能具有緩解胰島素抵抗現(xiàn)象的潛在價值。

GLUT4是細胞攝取葡萄糖的必需物質，在機體葡萄糖代謝中起著重要作用[17]。胰島素抵抗的發(fā)生以GLUT4介導的葡萄糖攝取障礙為主要特征之一，當小鼠表現(xiàn)出胰島素抵抗時，胰島素敏感的外周組織中GLUT4的表達以及細胞膜上的GLUT4均減少[18]。本研究通過免疫熒光染色觀察胰島素抵抗Hep G2細胞中GLUT4表達情況，顯示miR-188-5p過表達可提高GLUT4在胰島素抵抗Hep G2細胞中的表達，沉默miR-188-5p則進一步降低胰島素抵抗細胞中GLUT4的表達。而有關研究顯示，胰島素信號通路的改善伴隨著GLUT4蛋白表達的增加，進而緩解胰島素抵抗[19]。因此，miR-188-5p mimic干預后胰島素抵抗Hep G2細胞中GLUT4表達增多現(xiàn)象進一步證實了miR-188-5p對胰島素抵抗具有緩解作用。

綜上所述，過表達miR-188-5p可明顯促進胰島素抵抗Hep G2細胞內(nèi)葡萄糖的攝取，糖原的合成以及GLUT4的表達，提示miR-188-5p對胰島素抵抗具有一定的改善作用，但其具體的作用機制還需進一步探討。