付 勛，聶青玉，張 艷，劉 丹，馮婷婷，李 翔，熊春梅

（重慶三峽職業(yè)學(xué)院 農(nóng)林科技學(xué)院，重慶 404155）

獼猴桃（Actinidia chinensisPlanch.）又稱奇異果，獼猴桃科獼猴桃屬落葉藤本株，獼猴桃富含黃酮、酚類等多種營養(yǎng)物質(zhì)成分，其維生素C含量較大部分水果高[1-2]。血橙全稱為“塔羅科血橙”，原產(chǎn)于意大利，果實(shí)較大，目前在我國四川、重慶、湖南等地均有種植，其果面較光滑，色澤鮮艷帶血紅色、汁多為淡血紅色、味濃[3]，果汁出汁率達(dá)69%左右，成熟果實(shí)含糖量一般為10%～14%，具備釀造果酒的優(yōu)良條件。羅佳麗等[4]研究了兩種酵母的發(fā)酵規(guī)律和血橙果酒的香氣成分，并建立其酵母的發(fā)酵動力模型。付勛等[5-6]研究了血橙果酒發(fā)酵及調(diào)配工藝，主要研究了血橙果酒發(fā)酵工藝中酵母添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間等對果酒品質(zhì)的影響，同時對果酒調(diào)配環(huán)節(jié)的含糖量、酸度及果汁添加量等進(jìn)行優(yōu)化。酵母在果酒發(fā)酵中的選擇也是近年來研究的熱點(diǎn)，如王玉霞等[7]為解決柑橘果酒香氣滋味欠佳等不足，在柑橘分別添加不同用量蘋果、獼猴桃果醪等，分析混合發(fā)酵果酒感官變化。譚玉巖等[8]研究了釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）與非釀酒酵母混合發(fā)酵對果酒品質(zhì)的影響。王家利等[9]以紅樹莓為原料，選取6種果酒酵母進(jìn)行發(fā)酵，通過儀器測定和嗅聞感官綜合判斷，篩選出最佳的酵母品種。

主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚類分析法（cluster analysis，CA）廣泛應(yīng)用于分析樣品中的多個指標(biāo)中起主要作用的指標(biāo)，各指標(biāo)的影響程度及正、負(fù)方向，樣品分類等研究，彭邦遠(yuǎn)[10]等采用主成分分析法對刺梨汁的揮發(fā)性成分分析，得出刺梨汁中主要香氣成分為酯類、烯烴類物質(zhì)，同時聚類分析表明熱處理樣品其香氣成分與原汁聚為一類；李明瑕等[11]利用主成分分析方法研究實(shí)驗(yàn)室制備黃桃果酒與多種醇和酯的相關(guān)性；李彩虹等[12]采用主成分分析法對寧夏賀蘭山東麓不同品種，不同產(chǎn)區(qū)葡萄酒中礦物元素含量差異進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)葡萄酒的原產(chǎn)地判別。

本實(shí)驗(yàn)以獼猴桃、血橙為原料，添加8種商業(yè)果酒酵母發(fā)酵成果酒，通過頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（headspace solid phase micro-extraction/gas chromatog raphy mass spectrometry，HS-SPME/GC-MS）檢測發(fā)酵果酒中的風(fēng)味物質(zhì)，結(jié)合主成分與聚類分析，分析獼猴桃血橙果酒中主要風(fēng)味物質(zhì)及物質(zhì)間相關(guān)性，不同酵母發(fā)酵果酒樣品的差異性及相似度，以期為果酒樣品的分類等提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

萬州紅心獼猴桃、血橙：重慶市萬州區(qū)林發(fā)超市。

8種活性果酒干酵母（La-Ma、La-Ec、La-Ra、La-De、La-Ba、La-Fr、CR1、安琪果酒酵母）：煙臺帝伯仕自釀有限公司；氯化鈉（色譜純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；白砂糖（食品級）：佛山層層高食品有限公司；檸檬酸（分析純）：天津市北辰方正試劑廠；果膠酶（30 000 U/g）：南寧龐博生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo 1300氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Thermo Fisher公司；PAL System三合一進(jìn)樣器：瑞士CTC公司；75 μm CAR/PDMS/DVB萃取纖維頭：美國SUPELCO公司；JSZZ-5L機(jī)器攪拌玻璃發(fā)酵罐系統(tǒng)：江蘇中正生物工程設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 獼猴桃血橙果酒生產(chǎn)工藝流程及操作要點(diǎn)[5-6，13-15]

操作要點(diǎn)：

（1）前處理：血橙經(jīng)破碎榨汁得到果汁，在果汁中添加焦亞硫酸鉀試劑，使SO2含量為100 mg/L，再添加果膠酶（添加量0.09 g/L，31 ℃酶解120 min），經(jīng)澄清處理得到澄清血橙果汁；獼猴桃經(jīng)去皮打漿，在血橙汁中添加20 g/100 mL獼猴桃果漿，使用蔗糖調(diào)節(jié)初始發(fā)酵糖度至18.0%，檸檬酸調(diào)pH值至4.0。

（2）發(fā)酵：酵母（活性干酵母按照1∶10（g∶mL），加入5%的蔗糖水溶液，于30 ℃恒溫活化30 min使用）按照0.12 g/L接種量接種發(fā)酵，各酵母發(fā)酵溫度設(shè)置見表1，果酒在溫控發(fā)酵罐中發(fā)酵至干性果酒（總糖含量＜5.0 g/L）。

表1 8種不同果酒酵母發(fā)酵特性Table 1 Fermentation characteristics of 8 different fruit wine yeasts

（3）陳釀、澄清：主發(fā)酵結(jié)束后，分離上層果酒和酒泥，在果酒中添加藻土（添加量0.2 g/mL）使進(jìn)一步澄清，陳釀、澄清階段多次分離上層清酒直至得到澄清果酒。

1.3.2 風(fēng)味物質(zhì)的測定

HS-SPME條件：取混勻樣品5 mL于20 mL頂空瓶中，加入飽和氯化鈉，壓蓋，置于80 ℃水浴中平衡20 min，再將固相微萃取針扎進(jìn)頂空瓶中，繼續(xù)放入80 ℃水浴鍋中水浴20 min，上機(jī)解吸5 min，進(jìn)行GC-MS分析。

氣相色譜條件：色譜柱為HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣量1 μL，載氣流速1.0 mL/min，進(jìn)樣模式為不分流；程序升溫條件為初始溫度45 ℃保持4 min；以6 ℃/min升至130 ℃，保持6 min；再以10 ℃/min升至230 ℃，保持8 min；以15 ℃/min升至280 ℃，保持15 min。

質(zhì)譜條件：電子電離源（electron ionization，EI），電子能量70 eV，傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度180 ℃，溶劑切除時間2 min，質(zhì)量掃描方式為全掃描，質(zhì)量掃描范圍30～500 m/z。

定性定量方法：根據(jù)全掃圖中的母離子信息，利用Thermo美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）MS Search2.3本地?cái)?shù)據(jù)庫，進(jìn)行物質(zhì)鑒定，對樣品中各組分進(jìn)行定性分析；用峰面積歸一化法分析各成分的相對含量。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 23.0 數(shù)據(jù)處理軟件，對果酒風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行主成分分析和樣品聚類分析[19-25]。數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，以果酒中檢測出的風(fēng)味物質(zhì)相對含量矩陣為數(shù)據(jù)，進(jìn)行主成分分析，矩陣經(jīng)旋轉(zhuǎn)處理后，得到主成分的特征值和特征向量。以果酒風(fēng)味物質(zhì)累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)＞85%為標(biāo)準(zhǔn)，確定主成分個數(shù)以及各主成分中因子。根據(jù)主成分特征向量和方差貢獻(xiàn)率得出果酒風(fēng)味物質(zhì)綜合評價模型，計(jì)算出不同酵母發(fā)酵果酒所得果酒風(fēng)味物質(zhì)的綜合評分；采用Origin Pro 2021軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 8種不同果酒酵母發(fā)酵獼猴桃血橙果酒中主要風(fēng)味物質(zhì)分析

將樣品經(jīng)過HS-SPME/GC-MS檢測后，得到8種不同果酒酵母發(fā)酵獼猴桃血橙果酒樣品的總離子流色譜圖見圖1。8種不同果酒酵母發(fā)酵獼猴桃血橙果酒的主要揮發(fā)性物質(zhì)見表2。

圖1 8種不同果酒酵母發(fā)酵獼猴桃血橙果酒風(fēng)味物質(zhì)GC-MS分析總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion flow chromatogram of flavor compounds in kiwifruit and blood orange wine fermented by 8 different wine yeasts analyzed by GC-MS

由圖1可知，本實(shí)驗(yàn)所采用的HS-SPME/GC-MS條件可以有效分離獼猴桃血橙果酒的揮發(fā)性成分。

由表2可知，8種不同果酒酵母發(fā)酵獼猴桃血橙果酒中共鑒定出34種主要風(fēng)味物質(zhì)，包括酯類、醇類、醛類、羧酸類及烯烴類風(fēng)味物質(zhì)。除乙醇外，其中相對含量較高的物質(zhì)有正己酸乙酯（3.19%）、乙酸乙酯（0.87%）、2-甲基-1-丙醇（1.38%）、異戊醇（11.21%）、2-甲基-1-丁醇（3.06%）、辛酸（1.35%）等。果酒風(fēng)味物質(zhì)中，具有果香及芳香成分的物質(zhì)主要有[26-33]乙酸乙酯（水果香味）、戊酸乙酯（蘋果香氣）、正己酸乙酯（強(qiáng)烈果香和酒香，蘋果、香蕉、菠蘿香氣）、乙酸苯乙酯（玫瑰花香氣）、3-苯丙酸乙酯（呈甜的水果和蜂蜜似花香香氣）、棕櫚酸乙酯（微弱蠟香、果爵和奶油香氣）、3-羥基己酸乙酯（水果香氣）、庚酸乙酯（酒香、白蘭地樣香氣）、苯甲酸乙酯（稍有水果氣味）、琥珀酸氫乙酯（有愉快氣味）、辛酸乙酯（菠蘿香味）、己酸2-苯乙酯（新鮮的水果菠蘿樣香氣）、丙二酸二乙酯（微具芳香氣味）、油酸乙酯（花果香氣）、2,3-丁二醇（具有和諧、溫和的玫瑰、蜂蜜樣香氣）、4-萜烯醇（暖的胡椒香、較淡的泥土香和陳腐的木材氣息）、萜品醇（有清香似海桐花氣息和紫丁香、鈴蘭的鮮幽香氣）、正丙醇（有芳香氣味）、廣藿香醇（有較淡的廣藿香香氣）、苯丙醇（具有甜的花香香氣和甜蜜餞香味，稀釋后有清鮮愉快瓜果香）、乙縮醛（有芳香氣味）、辛酸（略有不舒適的氣味，稀釋后呈水果香氣）、己酸（有特殊臭氣味）、（-）-檸檬烯（有類似檸檬或甜橙香味）。其中，戊酸乙酯、乙酸苯乙酯、琥珀酸氫乙酯、辛酸乙酯、異丙醇、4-萜烯醇、異植物醇、苯丙醇、乙縮醛、辛酸、（-）-檸檬烯等香氣成分對果酒的風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。

續(xù)表

2.2 8種不同果酒酵母發(fā)酵獼猴桃血橙果酒中風(fēng)味物質(zhì)主成分分析

由表3可知，前7個主成分對應(yīng)的特征值均＞1，累積方差貢獻(xiàn)率為97.152%，故選取前7個主成分，可反映不同酵母發(fā)酵果酒中風(fēng)味物質(zhì)的大部分信息。

表3 8種不同果酒酵母發(fā)酵獼猴桃血橙果酒主成分方差貢獻(xiàn)率Table 3 Variance contribution rates of principal component of kiwifruit and blood orange wine fermented by 8 different wine yeasts

由表4可知，第1主成分中載荷較高的果酒風(fēng)味物質(zhì)有戊酸乙酯、異丙醇、4-萜烯醇、乙縮醛、（-）-檸檬烯，載荷值均＞0.99，為高度正相關(guān)，即第1主成分大時，戊酸乙酯、異丙醇、4-萜烯醇、乙縮醛、（-）-檸檬烯含量越高，第1主成分公因子的方差貢獻(xiàn)率最大為21.548%，說明第1主成分對果酒風(fēng)味品質(zhì)的影響最大；第2主成分中乙酸苯乙酯、辛酸乙酯、辛酸的載荷值也均＞0.93，且有正向影響，第2主成分方差貢獻(xiàn)率為19.510%；第3主成分中琥珀酸氫乙酯、異植物醇、苯丙醇含量的載荷值較大，呈正相關(guān)，載荷值分別為0.971、0.932、0.959，方差貢獻(xiàn)率為16.790%；第4主成分中己酸2-苯乙酯、2,3-丁二醇、廣藿香醇含量的載荷值也均＞0.9，呈正相關(guān)，方差貢獻(xiàn)率為15.271%；第5主成分中只有正己酸乙酯含量的載荷值較高，載荷值為0.895，方差貢獻(xiàn)率為10.729%；第6主成分中丙二酸二乙酯、油酸乙酯含量的載荷值較大，呈正相關(guān)，載荷值分別為0.958、0.958，方差貢獻(xiàn)率為8.610%。

表4 8種不同果酒酵母發(fā)酵獼猴桃血橙果酒風(fēng)味物質(zhì)主成分旋轉(zhuǎn)后載荷矩陣Table 4 Principal component loading matrix after rotating of flavor compounds of kiwifruit and blood orange wine fermented by 8 different wine yeasts

由圖2可知，不同果酒酵母發(fā)酵的獼猴桃血橙果酒樣品區(qū)分效果較好，8種獼猴桃血橙果酒的數(shù)據(jù)點(diǎn)均位于95%置信區(qū)間內(nèi)，且不同果酒樣品位于不同區(qū)域。其中2#、3#、6#果酒樣品分布于第1象限，2#、3#果酒樣品在PC1上較接近，說明2#、3#果酒樣品聚集較好，含有的風(fēng)味物質(zhì)組成和含量相近；7#、8#及4#果酒樣品分別位于第3和4象限，而6#、7#、8#果酒樣品在PC2上較接近，4#果酒樣品PC2得分接近0，主要位于PC1負(fù)半軸，說明其分布特征主要受主成分2影響，因此6#、7#、8#果酒相對聚集較好，1#和5#果酒樣品遠(yuǎn)離其他果酒樣品分布在第2和3象限，說明其風(fēng)味物質(zhì)組成和含量差異較大。

圖2 8種不同果酒酵母發(fā)酵獼猴桃血橙果酒的主成分分析得分Fig. 2 Principal component analysis score of kiwifruit and blood orange wine fermented by 8 different wine yeasts

2.3 不同類型果酒風(fēng)味物質(zhì)的綜合評判

從表3可知，當(dāng)提取7個主成分時可解釋的累計(jì)方差達(dá)到97.152%，因此選用前7個主成分已經(jīng)足夠描述果酒種風(fēng)味物質(zhì)的總體水平。以34種風(fēng)味物質(zhì)為初始自變量，經(jīng)主成分分析，最終得出7個主成分因子的方程表達(dá)式如下：

Z1～Z7分別代表第1～第7主成分的特征向量權(quán)重值。

7個表達(dá)式中，X1為乙酸乙酯、戊酸乙酯、正己酸乙酯、乙酸苯乙酯……醋酸、辛酸、己酸、（-）-檸檬烯風(fēng)味物質(zhì)的相對含量，由方差貢獻(xiàn)率和主成分函數(shù)表達(dá)式可求綜合評價函數(shù)得：F=0.215Z1+0.195Z2+0.168Z3+0.153Z4+0.107Z5+0.086Z6+0.047Z7。

根據(jù)主成分綜合評價函數(shù)值可知，8種不同果酒酵母發(fā)酵獼猴桃血橙果酒的綜合得分和排序結(jié)果見表5。由表5可知，綜合得分排在第1、第2位的樣品是CR1和La-Ba酵母發(fā)酵的獼猴桃血橙果酒。

表5 8種不同果酒酵母發(fā)酵獼猴桃血橙果酒主成分分析綜合得分和排序Table 5 Comprehensive scores and ranking of principal component analysis of kiwifruit and blood orange wine fermented by 8 different wine yeasts

2.4 8種不同果酒酵母發(fā)酵獼猴桃血橙果酒樣品聚類分析

對8種不同果酒酵母發(fā)酵獼猴桃血橙果酒樣品進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。

圖3 8種不同果酒酵母發(fā)酵獼猴桃血橙果酒風(fēng)味物質(zhì)聚類分析熱圖Fig. 3 Heat map of cluster analysis of flavor compounds in kiwifruit and blood orange wine fermented by 8 different wine yeasts

由圖3可知，1#果酒樣品獨(dú)立聚為第一類，第二類聚集了其余7個果酒樣品，7個樣品中，4#、6#、7#果酒樣品先聚集為一類，再與2#、3#果酒樣品聚類為一類，最后與5#果酒樣品聚集為一大類。與主成分分析比較，1#和5#果酒樣品遠(yuǎn)離其他6個果酒樣品，2#和3#果酒樣品接近，4#、6#和7#果酒樣品較集中，因此，聚類結(jié)果與主成分分析結(jié)果基本一致。由圖3亦可知，果酒風(fēng)味物質(zhì)主要聚集為四類，第一類聚集了乙酸乙酯、己酸2-苯乙酯、廣藿香醇、2,3-丁二醇、2-甲基-1-丁醇、異戊醇和乙醛；第二類聚集了戊酸乙酯、異丙醇、（-）-檸檬烯、4-萜烯醇、乙縮醛、萜品醇、苯甲酸乙酯、琥珀酸氫乙酯、異植物醇、苯丙醇、醋酸、庚酸乙酯、乙醇、正己酸乙酯、正丙醇、己酸；第三類聚集了乙酸苯乙酯、辛酸乙酯、甲氧乙酸、辛酸、丁二酸二乙酯、3-苯丙酸乙酯、3-羥基己酸乙酯；第四類聚集了棕櫚酸乙酯、丙二酸二乙酯、油酸乙酯；這四大類各風(fēng)味物質(zhì)能先聚集在一起，說明他們之間具有較強(qiáng)相關(guān)性，其中廣藿香醇、戊酸乙酯、異丙醇、（-）-檸檬烯、4-萜烯醇、乙縮醛、庚酸乙酯、己酸、辛酸、異植物醇、苯丙醇、油酸乙酯等風(fēng)味物質(zhì)是影響果酒的主要風(fēng)味物質(zhì)，該結(jié)果與主成分分析結(jié)果較一致。

3 結(jié)論

對8種果酒的風(fēng)味物質(zhì)檢測分析，共檢測出34種風(fēng)味物質(zhì)，包括酯類、醇類、羧酸等主要風(fēng)味物質(zhì)，其中主要風(fēng)味物質(zhì)為戊酸乙酯、乙酸苯乙酯、琥珀酸氫乙酯、辛酸乙酯、異丙醇、4-萜烯醇、異植物醇、苯丙醇、乙縮醛、辛酸、（-）-檸檬烯等。對8種果酒風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行主成分分析，可分為7個主成分，第1主成分中戊酸乙酯、異丙醇、4-萜烯醇、乙縮醛、（-）-檸檬烯為高度正相關(guān)；第2主成分中乙酸苯乙酯、辛酸乙酯、辛酸有較大正向影響；第3主成分中琥珀酸氫乙酯、異植物醇、苯丙醇含量的載荷值較大；第4主成分中己酸2-苯乙酯、2,3-丁二醇、廣藿香醇含量呈正相關(guān)；第5主成分中只有正己酸乙酯含量的載荷值較高；第6主成分中丙二酸二乙酯、油酸乙酯呈正相關(guān)；第7個主成分中庚酸乙酯呈正相關(guān)。

對果酒樣品進(jìn)行聚類分析，La-Ma酵母發(fā)酵果酒獨(dú)立聚為第一類，第二類聚集了La-Ec、La-Ra、La-De、La-Ba、La-Fr、CR1和安琪果酒酵母發(fā)酵的7個果酒樣品，第二類中，La-Ec和La-Ra果酒樣品較集中，La-De、La-Fr和CR1果酒樣品較集中，該聚類結(jié)果與主成分分析樣品分類結(jié)果基本一致。